化学生物学第六章化学物质与蛋白质相互作用讲稿.ppt

化学生物学第六章化学物质与蛋白质相互作用第一页，讲稿共五十一页哦第六章第六章 化学物质与蛋白质的相互作用化学物质与蛋白质的相互作用 Chapter6.Interactionsbetweenchemicalsandproteins 第八次课第八次课第二页，讲稿共五十一页哦在在生生物物体体内内，蛋蛋白白质质（包包括括酶酶）占占细细胞胞干干重重的的70%以以上上，种种类类繁繁多多，在在生生命命活活动动过过程程中中发发挥挥着着各各种种各各样样的的作作用用。随随着着人人们们对对环环境境保保护护和和生生活活质质量量要要求求的的提提高高，蛋蛋白白质质在在食食品品、医医药药（生生化化药药物物、临临床床检检验验、药药物物筛筛选选等等）、环环保保（环环境境分分析析）、农农业业、日日用用化化工工（化化妆妆品品）、精精细细化化工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。在在蛋蛋白白质质体体外外的的应应用用中中，一一般般涉涉及及到到分分离离纯纯化化、储储存存、含含量量检检测测等等过过程程，其其中中常常常常发发生生化化学学物物质质与与蛋蛋白白质质非非专专一一性性的的相相互互作作用用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。第一节第一节概概述述第三页，讲稿共五十一页哦球状蛋白三级结构的主要特征球状蛋白三级结构的主要特征绝绝大大多多数数蛋蛋白白质质折折叠叠成成为为近近乎乎球球状状的的结结构构。球球状状蛋蛋白白质质一一旦旦具具有有三三级级结结构构后后，蛋蛋白白质质内内部部变变得得更更为为紧紧密密，内内部部的的空空间间约约有有75被被原原子子所所充充满满。这这样样的的密密集集程程度度远远远远超超过过在在液液体体中的小分子，可以与某些晶体相比。中的小分子，可以与某些晶体相比。蛋蛋白白质质可可认认为为是是带带有有极极性性外外套套的的油油滴滴，也也就就是是“非非极极性性在在内内，极极性性在在外外”。大大量量蛋蛋白白质质的的X射射线线晶晶体体衍衍射射分分析析统统计计结结果果充分证明了这一规律。充分证明了这一规律。存存在在于于蛋蛋白白质质内内部部的的主主要要是是一一些些非非极极性性残残基基侧侧链链，约约有有63是是丙丙氨氨酸酸、甘甘氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸等等；带带电电的的残残基基，如如天天冬冬氨氨酸酸、谷谷氨氨酸酸、赖赖氨氨酸酸和和精精氨氨酸酸只只有有4。约约95的的带带电电侧侧链链分分布布在在蛋蛋白白质质表表面面；约约14的的亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。第四页，讲稿共五十一页哦蛋蛋白白质质内内部部存存在在极极少少量量的的亲亲水水残残基基，表表面面也也常常见见到到一一些些疏疏水水残残基基。这这些些“异异常常”分分布布的的残残基基，致致使使肽肽链链的的局局部部结结构构发发生生“扭扭曲曲”，一一些些键键的的张张角角与与一一般般正正常常的的值值有有偏偏离离，蛋蛋白白质质中中这这些些局局部部的的构构象象具具有有相相对对偏偏高高的的能能量量，相相对对处处于于较较不不稳稳定定状状态态，在在外外界界很很小小的的扰扰动作用下，就能发生变化。动作用下，就能发生变化。原原则则上上，一一些些相相对对规规则则的的-螺螺旋旋和和-折折叠叠分分布布在在球球状状蛋蛋白白内内部部，且且压压积积得得很很紧紧密密，致致使使球球状状蛋蛋白白具具有有致致密密的的结结构构；那那些些-螺螺旋旋和和-折折叠叠叠叠规规整整性性相相对对差差一一些些的的二二级级结结构构，转转角角和和环环状状以以及及特特定定的的“无规无规”卷曲，则更多地分布在球状蛋白外周。卷曲，则更多地分布在球状蛋白外周。值值得得指指出出的的是是在在很很多多蛋蛋白白质质分分子子内内部部还还存存在在着着数数量量不不同同的的水水分分子子，这这些些水水分分子子也也和和一一些些极极性性基基因因或或负负电电性性原原子子形形成成氢氢键键。其其中中一一些些也也参与蛋白质功能的行使过程。参与蛋白质功能的行使过程。球球状状蛋蛋白白表表面面并并不不是是非非常常光光滑滑的的，而而是是具具有有很很多多沟沟渠渠，多多数数球球状状蛋白可及表面的面积约为同样大小球表面积的两倍蛋白可及表面的面积约为同样大小球表面积的两倍。第五页，讲稿共五十一页哦球球状状蛋蛋白白质质分分子子的的立立体体结结构构具具有有高高度度特特异异性性和和高高度度灵灵敏敏性性。每每种种蛋蛋白白质质分分子子都都有有特特定定的的高高级级结结构构。这这种种构构象象特特异异性性，使使它它区区别别于于其其他他蛋蛋白白质质；但但这这种种高高度度特特异异性性结结构构，并并非非固固定定不不变变，在在执执行行生生物物学学功功能能时时，常常常常发发生生一一系系列列的构象变化，表现出高度灵敏性。的构象变化，表现出高度灵敏性。在在生生物物体体内内，构构象象变变化化，往往往往是是该该蛋蛋白白质质分分子子与与配配基基相相互互作作用用引引起起的的，配配基基包包括括酶酶的的小小分分子子底底物物、受受体体的的小小分分子子激激素素和和神神经经介介质质、血血红红蛋蛋白白O2等等。因因此此，生生物物体体内内的的蛋蛋白白质质总总是处于一种可以相互转变的多种构象平衡态。是处于一种可以相互转变的多种构象平衡态。球球状状蛋蛋白白质质分分子子表表面面并并不不光光滑滑，常常出出现现一一些些“裂裂隙隙”或或“洞洞穴穴”，“裂裂隙隙”或或“洞洞穴穴周周围围常常具具有有疏疏水水性性，这些这些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”可能是蛋白质可能是蛋白质(酶酶)的活性部位。的活性部位。第六页，讲稿共五十一页哦硫氧还蛋白的结构硫氧还蛋白的结构紧密结合水紧密结合水亲水性残基亲水性残基疏水性残基疏水性残基第七页，讲稿共五十一页哦第二节第二节 化学物质对蛋白质的沉淀作用化学物质对蛋白质的沉淀作用 由由于于蛋蛋白白质质分分子子量量很很大大，在在水水中中能能够够形形成成胶胶体体溶溶液液。蛋蛋白白质质溶溶液液具具有有胶胶体体溶溶液液的的典典型型性性质质，如如丁丁达达尔尔现现象象、布布郎郎运运动动等等。由由于于胶胶体体溶溶液液中中的的蛋蛋白白质质不不能能通通过过半半透透膜膜，因因此此可可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。根根据据蛋蛋白白质质的的亲亲水水胶胶体体性性质质，当当其其环环境境发发生生改改变变时时，蛋蛋白白质质会发生沉淀作用。会发生沉淀作用。蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液的的稳稳定定性性与与它它的的分分子子量量大大小小、所所带带的的电电荷荷和和水水化化作作用用有有关关。改改变变溶溶液液的的条条件件，将将影影响响蛋蛋白白质质的的溶溶解解性性质质。在在适适当当的的条条件件下下，蛋蛋白白质质能能够够从从溶溶液液中中沉沉淀淀出来。出来。第八页，讲稿共五十一页哦沉沉淀淀作作用用的的类类型型可逆沉淀可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀抗体抗体-抗原沉淀抗原沉淀在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础疫功能的基础。第九页，讲稿共五十一页哦一、无机物沉淀一、无机物沉淀当当向向蛋蛋白白质质溶溶液液中中逐逐渐渐加加入入无无机机盐盐时时，开开始始蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度增增大大，是是由由于于蛋蛋白白质质的的活活度度系系数数降降低低的的缘故，这种现象称为盐溶。缘故，这种现象称为盐溶。但但当当继继续续加加入入电电解解质质时时，另另一一种种因因素素起起作作用用，使使蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度减减小小，称称为为盐盐析析。这这是是由由于于电电解解质质的的离离子子在在水水中中发发生生水水化化，当当电电解解质质的的浓浓度度增增加加时时，水水分分子子就就离离开开蛋蛋白白质质的的周周围围，暴暴露露出出疏疏水水区区域域，疏疏水水区区域域间间的的相相互互作作用用，使使蛋蛋白白质质聚聚集集而而沉沉淀淀，疏疏水水区区域域越越多多，就就越越易易产产生生沉沉淀。淀。（1）盐析）盐析牢固结牢固结合水合水大量溶大量溶剂水层剂水层第十页，讲稿共五十一页哦第十一页，讲稿共五十一页哦含高价阴离子的盐，效果比含高价阴离子的盐，效果比1价的盐好。阴离子的盐析效果有下列次序：价的盐好。阴离子的盐析效果有下列次序：柠檬酸盐柠檬酸盐PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-。但但高高价价阳阳离离子子的的效效果果不不如如低低价价阳阳离离子子，例例如如硫硫酸酸镁镁的的效效果果不不如如硫硫酸酸铵铵。对对于于1价阳离子则有下列次序：价阳离子则有下列次序：NH4+K+Na+。因因此此，最最常常用用的的盐盐析析剂剂是是硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、磷磷酸酸钾钾或或磷磷酸酸钠钠。但但硫硫酸酸钠钠在在40C 以以下下溶溶解解度度较较低低，因因而而仅仅适适用用于于对对热热稳稳定定的的蛋蛋白白质质。磷磷酸酸盐盐在在中中性性范范围围内内实实际际上上是是HPO42-和和H2PO4-的的混混合合物物，其其作作用用比比PO43-差差。硫硫酸酸铵铵由由于于价价廉廉、溶溶解解度度大大，且且能能使使蛋蛋白白质质稳稳定定,在在2-3mol/L(NH4)2SO4中中酶酶可可保保存存几几年年。同同时时由由于于盐盐的的浓浓度度高高，可可防防止止蛋蛋白白酶酶和和细细菌菌作作用用，故故是是最最常常用用的的盐盐析析剂剂。硫硫酸酸铵铵的的缺缺点点是是水水解解后后变变酸酸，在在高高pH下下会会释释放放出出氨氨，腐腐蚀蚀性性强强；残残留留的的硫硫酸酸铵铵在在食食品品中中虽虽然然量量少少，也也会会影影响响其其味味，在在医医疗疗上上有有毒，因此必须除去。毒，因此必须除去。第十二页，讲稿共五十一页哦（2）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法一一些些高高价价金金属属离离子子对对沉沉淀淀蛋蛋白白质质很很有有效效。它它们们可可以以分分为为三三类：类：第第一一类类为为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和和Cd2+能能和和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。第第二二类类为为Ca2+，Ba2+，Mg2+和和Pb2+能能和和蛋蛋白白质质分分子子表表面面的的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。羧基结合，但不和含氮化合物相结合。第第三三类类为为Ag+，Hg2+和和Pb2+能能和和蛋蛋白白质质分分子子表表面面的的巯巯基基相相结结合。合。第十三页，讲稿共五十一页哦金金属属离离子子沉沉淀淀法法的的优优点点是是它它们们在在稀稀溶溶液液中中对对蛋蛋白白质质有有效效强强的的沉沉淀淀能能力力。处处理理后后残残余余的的金金属属离离子子可可用用离离子子交交换树脂或螯合剂除去。换树脂或螯合剂除去。在在这这些些离离子子中中，应应用用较较广广的的是是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和和Mn2+，而而Cu2+，Fe2+，Pb2+，Hg2+等等较较少少应应用用，因因为为它它们们会会使使产产品品损损失失和和引引起起污污染染。如如Zn2+可可用用于于沉沉淀淀杆杆菌菌肽肽(作作用用于于第第4个个组组氨氨酸酸残残基基上上)和和胰胰岛岛素素；Ca2+(CaCO3)用用于于分分离离乳乳酸酸，血清清蛋白等。血清清蛋白等。第十四页，讲稿共五十一页哦二、等电点沉淀二、等电点沉淀蛋蛋白白质质与与多多肽肽一一样样，能能够够发发生生两两性性离离解解，也也有有等等电电点点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。等等电电点点沉沉淀淀法法的的一一个个主主要要优优点点是是很很多多蛋蛋白白质质的的等等电电点点都都在在偏偏酸酸性性范范围围内内，而而无无机机酸酸通通常常价价较较廉廉，并并且且某某些些酸酸，如如磷磷酸酸、盐盐酸酸和和硫硫酸酸的的应应用用能能为为蛋蛋白白质质类类食食品品所所允允许许。同同时时，常常可可直直接接进进行行其其他他纯纯化化操操作作，无无需需将将残残余余的的酸酸除除去。去。等等电电点点沉沉淀淀法法的的最最主主要要缺缺点点是是酸酸化化时时，易易使使蛋蛋白白质质失失活活，这这是由于蛋白质对低是由于蛋白质对低pH比较敏感。比较敏感。第十五页，讲稿共五十一页哦pH对对-乳球蛋白溶解度的影响乳球蛋白溶解度的影响 第十六页，讲稿共五十一页哦三、有机物沉淀三、有机物沉淀利利用用和和水水互互溶溶的的有有机机溶溶剂剂使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀的的方方法法很很早早就就用用来来纯纯化化蛋蛋白白质质。加加入入有有机机溶溶剂剂于于蛋蛋白白质质溶溶液液中中产产生生多多种种效效应应，这这些些效效应应结结合合起起来来使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀。其其中中主主要要效效应应是是水水活活度度的降低。的降低。当当有有机机溶溶剂剂浓浓度度增增大大时时，水水对对蛋蛋白白质质分分子子表表面面上上荷荷电电基基团团或或亲亲水水基基团团的的水水化化程程度度降降低低，或或者者说说溶溶剂剂的的介介电电常常数数降低，因而静电吸力增大。降低，因而静电吸力增大。在在疏疏水水区区域域附附近近近近有有序序排排列列的的水水分分子子可可以以为为有有机机溶溶剂剂所所取取代代，使使这这些些区区域域的的溶溶解解性性增增大大。但但除除了了疏疏水水性性特特别别强强的的蛋蛋白白质质外外，对对多多数数蛋蛋白白质质来来说说，后后者者影影响响较较小小，所所以以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。1.有机溶剂有机溶剂第十七页，讲稿共五十一页哦有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法的的优优点点是是溶溶剂剂容容易易蒸蒸发发除除去去，不不会会残残留留在在成成品品中中，因因此此适适用用于于制制备备食食品品蛋蛋白白质质。而而且且有有机机溶溶剂剂密密度度低低，与与沉沉淀淀物物密密度度差差大大，便便于于离离心心分分离离。有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法的的缺缺点点是是容容易易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。一一般般所所选选择择的的溶溶剂剂必必须须能能和和水水互互溶溶，而而和和蛋蛋白白质质不不发发生生化化学学反反应应，最最常常用用的的溶溶剂剂是是乙乙醇醇和和丙丙酮酮，加加量量在在20-50%（V/V）之之间间。当当蛋蛋白白质质的的溶溶液液pH接接近近等等电电点点时时，引引起起沉沉淀淀所所需需加加入入有机溶剂的量较少。有机溶剂的量较少。第十八页，讲稿共五十一页哦2.酚类化合物及有机酸沉淀酚类化合物及有机酸沉淀当当蛋蛋白白质质溶溶液液pH小小于于其其等等电电点点时时，蛋蛋白白质质颗颗粒粒带带有有正正电电荷荷，容容易易与与酚酚类类化化合合物物或或有有机机酸酸酸酸根根所所带带的的负负电电荷荷发发生生作作用用生生成成不溶性盐而沉淀。不溶性盐而沉淀。这这类类化化合合物物包包括括鞣鞣酸酸（又又称称单单宁宁）、苦苦味味酸酸（即即2,4,6-三三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀 第十九页，讲稿共五十一页哦第二十页，讲稿共五十一页哦四、聚合物沉淀四、聚合物沉淀许许多多非非离离子子型型聚聚合合物物，包包括括聚聚乙乙二二醇醇（PEG）可可用用来来进进行行选选择择性性沉沉淀淀以以纯纯化化蛋蛋白白质质。聚聚合合物物的的作作用用认认为为与与有有机机溶溶剂剂相相似似，能能降降低低水水化化度度，使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀。此此现现象象和和双双水水相相的的形形成成有有联联系系。若若使使低低分分子子量量的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀，需需加加入入大大量量PEG；而而使使高高分分子子量量的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀，加加入入的的量量较较小小。PEG是是一一种种特特别别有有用用的的沉沉淀淀剂剂，因因为为无无毒毒，不不可可燃燃性性且且对对大大多多数数蛋蛋白白质质有保护作用而被广泛使用。有保护作用而被广泛使用。一一般般PEG的的分分子子量量需需大大于于4000，最最常常用用的的是是6000和和20000。所所用用的的PEG浓浓度度通通常常为为20%，浓浓度度再再高高，会会使使粘粘度度增增大大，造造成成沉沉淀淀的的回回收收比比较较困困难难。PEG对对后后继继分分离离步步骤骤影影响响较较少少，因此可以不必除去。因此可以不必除去。1.非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法第二十一页，讲稿共五十一页哦2.聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法 有有一一些些离离子子型型多多糖糖化化合合物物可可应应用用于于沉沉淀淀食食品品蛋蛋白白质质。如如羧羧甲甲基基纤纤维维素素，海海藻藻酸酸盐盐，果果胶胶酸酸盐盐和和卡卡拉拉胶胶等等。它它们们的的作作用用主主要要是是静静电电引引力力。如如羧羧甲甲基基纤纤维维素素能能在在pH值值低低于于等等电电点点时时使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀。但但加加入入量量不不能能太太多多，否否则则会会引引起起胶胶溶溶作作用用而而重新溶解。重新溶解。一一些些阴阴离离子子聚聚合合物物，如如聚聚丙丙烯烯酸酸和和聚聚甲甲基基丙丙烯烯酸酸，以以及及一一些些阳阳离离子子聚聚合合物物如如聚聚乙乙烯烯亚亚胺胺和和以以聚聚苯苯乙乙烯烯为为骨骨架架的的季季胺胺盐盐也也曾曾用用来来沉沉淀淀乳乳清清蛋蛋白白质质。聚聚丙丙烯烯酸酸能能在在pH8.8时时沉沉淀淀90%以以上上的的蛋蛋白白质质，聚聚苯苯乙乙烯烯季季胺胺盐盐能能在在pH10.4时时沉沉淀淀95%的的蛋蛋白质。白质。聚聚乙乙烯烯亚亚胺胺能能与与蛋蛋白白质质的的酸酸性性区区域域形形成成复复合合物物，在在中中性性时时带带正正电电，可可在在污污水水处处理理中中作作絮絮凝凝剂剂，也也广广泛泛用用于于酶酶的的纯化中。纯化中。第二十二页，讲稿共五十一页哦第三节第三节化学物质对蛋白质的稳定作用化学物质对蛋白质的稳定作用 许许多多蛋蛋白白质质在在一一般般缓缓冲冲溶溶液液中中的的稳稳定定性性相相当当低低，某某些些酶酶蛋蛋白白溶液在溶液在37C 放置的半衰期仅几个小时。放置的半衰期仅几个小时。这这种种稳稳定定性性降降低低的的原原因因常常常常是是某某些些物物理理或或化化学学因因素素破破坏坏了了维维持持蛋蛋白白质质结结构构的的天天然然状状态态，引引起起蛋蛋白白质质理理化化性性质质改改变变并并导导致致其其生生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。一、蛋白质不可逆失活的化学因素一、蛋白质不可逆失活的化学因素1.强酸和强碱强酸和强碱第二十三页，讲稿共五十一页哦强强的的无无机机酸酸碱碱及及有有机机酸酸碱碱都都可可以以改改变变蛋蛋白白质质溶溶液液的的pH，引引起起蛋蛋白白质质表表面面必必需需基基团团的的电电离离，由由于于各各氨氨基基酸酸残残基基所所带带电电荷荷的的相相互互吸吸引引或或排排斥斥使使蛋蛋白白质质的的空空间间结结构构发发生生较较大大变变化化，造造成成蛋蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。白质分子聚集，导致不可逆失活。另另外外，在在强强酸酸、强强碱碱条条件件下下，肽肽键键也也容容易易被被水水解解断断裂裂，天天冬冬酰酰胺胺和和谷谷酰酰胺胺侧侧链链的的酰酰胺胺会会发发生生脱脱氨氨作作用用，改改变变了了原原来来蛋蛋白白质质表表面面的的电电荷荷分分布布，使使蛋蛋白白质质构构象象重重新新排排布布，结结果果导导致致蛋蛋白白质质失失去去活性。活性。第二十四页，讲稿共五十一页哦2.氧化剂氧化剂各各种种氧氧化化剂剂能能够够氧氧化化芳芳香香族族侧侧链链的的氨氨基基酸酸以以及及甲甲硫硫氨氨酸酸、半半胱胱氨氨酸酸和和胱胱氨氨酸酸残残基基。其其中中酪酪氨氨酸酸侧侧链链的的酚酚羟羟基基可可以以被被氧氧化化成成醌醌，后后者者可可以以与与蛋蛋白白质质表表面面的的巯巯基基、氨氨基基发发生生迈迈克克尔尔加加成成反反应应形形成成交交联联产产物物。在在碱碱性性条条件件下下，半半胱胱氨氨酸酸可可以以被被Cu2+氧氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。分分子子氧氧、H2O2以以及及过过氧氧化化物物（如如过过氧氧甲甲酸酸）、氧氧自自由由基基等等是是最最常常见见的的氧氧化化剂剂，在在生生物物体体内内，蛋蛋白白质质的的氧氧化化失失活活主主要要是是通通过过活活性性氧氧（羟羟基基自自由由基基、超超氧氧离离子子、过过氧氧化化氢氢、过过氧氧化化物物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。第二十五页，讲稿共五十一页哦3.去污剂和表面活性剂去污剂和表面活性剂去去污污剂剂一一般般分分为为离离子子型型和和非非离离子子型型两两大大类类，都都具具有有长长链链疏疏水水尾尾和和亲亲水水的的极极性性头头。当当少少量量的的阴阴离离子子去去污污剂剂（如如十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠，SDS）单单体体加加入入到到蛋蛋白白质质溶溶液液中中时时，去去污污剂剂与与蛋蛋白白质质表表面面的的疏疏水水区区域域结结合合，随随着着加加入入量量增增加加，与与蛋蛋白白质质的的结结合合位位点点达达到到饱饱和和，这这时时去去污污剂剂则则以以协协同同方方式式结结合合于于蛋蛋白白质质其其它它位位点点，导导致致蛋蛋白白质质伸伸展展，分分子子内内部部的的疏疏水水性性氨氨基基酸酸残残基基暴暴露露，并并进进一一步步与与去去污污剂剂结结合合，直直到到达达到到饱饱和和为为止止，从从而而使使蛋蛋白白质质发发生生不不可可逆变性。逆变性。第二十六页，讲稿共五十一页哦第二十七页，讲稿共五十一页哦4.变性剂变性剂高高浓浓度度脲脲（8-10mol/L）和和盐盐酸酸胍胍（6mol/L）常常常常用用于于蛋蛋白白质质变变性性和和复复性性研研究究，由由于于脲脲或或盐盐酸酸胍胍与与蛋蛋白白质质多多肽肽链链作作用用，破破坏坏了了蛋蛋白白质质分分子子内内维维持持其其二二级级结结构构和和高高级级结结构构的的氢氢键键，引引起蛋白质不可逆失活。起蛋白质不可逆失活。（1）脲和盐酸胍）脲和盐酸胍第二十八页，讲稿共五十一页哦（2）有机溶剂）有机溶剂水水互互溶溶有有机机溶溶剂剂可可以以使使酶酶、蛋蛋白白质质失失去去活活性性，是是因因为为有有机机溶溶剂剂取取代代了了蛋蛋白白质质表表面面的的结结合合水水，并并通通过过疏疏水水作作用用与与蛋蛋白白质质结结合合，改改变变了了溶溶液液的的介介电电常常数数，从从而而影影响响维维持持蛋蛋白白质质天天然构象的非共价力的平衡。然构象的非共价力的平衡。（3）螯合剂）螯合剂结结合合金金属属离离子子的的试试剂剂，如如EDTA等等可可以以使使金金属属酶酶、金金属属蛋蛋白白失失活活，这这是是因因为为EDTA与与金金属属离离子子形形成成配配位位复复合合物物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。从而使酶失去金属辅助因子造成的。失失去去金金属属辅辅助助因因子子的的酶酶或或蛋蛋白白质质可可以以引引起起蛋蛋白白质质构构象象发发生较大改变，导致蛋白质活力不可逆的丧失。生较大改变，导致蛋白质活力不可逆的丧失。但但是是，螯螯合合剂剂可可以以螯螯合合对对蛋蛋白白质质有有害害的的金金属属离离子子，使使那那些些不不需要金属离子的蛋白质稳定。需要金属离子的蛋白质稳定。第二十九页，讲稿共五十一页哦5.重金属离子和巯基试剂重金属离子和巯基试剂在在金金属属离离子子对对蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀作作用用中中，一一些些重重金金属属离离子子，如如Hg2+、Cd2+、Pb2+能能与与蛋蛋白白质质分分子子中中的的半半胱胱氨氨酸酸的的巯巯基基、组组氨氨酸酸的的咪咪唑唑基基以以及及色色氨氨酸酸的的吲吲哚哚基基反反应应，使使蛋蛋白质不可逆沉淀而变性失活。白质不可逆沉淀而变性失活。巯巯基基试试剂剂，如如巯巯基基乙乙醇醇等等通通过过还还原原蛋蛋白白质质分分子子内内的的二二硫硫键键而而使使蛋蛋白白质质失失去去活活性性，但但这这个个过过程程一一般般是是可可逆逆的的。而而低低分分子子量量的的含含二二硫硫键键的的试试剂剂可可与与蛋蛋白白质质中中的的巯巯基基作作用用，形形成成混混合二硫键，造成蛋白质结构发生变化，导致其失活。合二硫键，造成蛋白质结构发生变化，导致其失活。第三十页，讲稿共五十一页哦LysArg水第三十一页，讲稿共五十一页哦蛋白质不可逆失活的化学因素蛋白质不可逆失活的化学因素 强酸和强碱强酸和强碱 强的酸碱可强的酸碱可以改变蛋白以改变蛋白质溶液的质溶液的pH引起蛋白质引起蛋白质表面必需基表面必需基团的电离，团的电离，使蛋白质的使蛋白质的空间结构发空间结构发生变化，造生变化，造成蛋白质分成蛋白质分子聚集，导子聚集，导致变性。致变性。氧化剂氧化剂 氧化剂甲硫氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸和胱氨氨酸和胱氨酸残基。酪酸残基。酪氨酸侧链的氨酸侧链的酚羟基可以酚羟基可以被氧化成醌被氧化成醌再与巯基、再与巯基、氨基发生迈氨基发生迈克尔加成反克尔加成反应形成交联应形成交联产物。产物。表面活性剂表面活性剂变性剂变性剂 重金属离子重金属离子去污剂与蛋去污剂与蛋白质表面的白质表面的疏水区域结疏水区域结合，导致蛋合，导致蛋白质伸展，白质伸展，分子内部的分子内部的疏水性氨基疏水性氨基酸残基暴露酸残基暴露从而使蛋白从而使蛋白质发生不可质发生不可逆变性。逆变性。脲或盐酸胍脲或盐酸胍与蛋白质多与蛋白质多肽链作用，肽链作用，破坏了蛋白破坏了蛋白质分子内维质分子内维持其二级结持其二级结构和高级结构和高级结构的氢键。构的氢键。有机溶剂也有机溶剂也会会引起蛋白引起蛋白质变性失活质变性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋能与蛋白质分子中白质分子中的半胱氨酸的半胱氨酸的巯基、组的巯基、组氨酸的咪唑氨酸的咪唑基以及色氨基以及色氨酸的吲哚基酸的吲哚基反应，使蛋反应，使蛋白质不可逆白质不可逆沉淀而变性沉淀而变性失活。失活。第三十二页，讲稿共五十一页哦二、化学物质对蛋白质的稳定作用二、化学物质对蛋白质的稳定作用 蛋蛋白白质质的的稳稳定定性性是是指指蛋蛋白白质质抵抵抗抗各各种种因因素素的的影影响响，保保持持其其生生物物活活性性的的能能力力。根根据据生生物物体体内内蛋蛋白白质质等等存存在在的的状状态态，可可以以利利用用化化学学物物质质或或化化学学方方法法使使蛋蛋白白质质稳稳定定化化，以有利于蛋白质在体外的应用。以有利于蛋白质在体外的应用。通通过过研研究究蛋蛋白白质质的的变变性性及及稳稳定定性性，可可以以了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构功功能与稳定性的关系等。能与稳定性的关系等。在在蛋蛋白白质质（酶酶）分分离离、纯纯化化、储储藏藏和和应应用用中中，可可以以通通过过化化学方法使蛋白质稳定。常用的方法有：学方法使蛋白质稳定。常用的方法有：固固定定化化：将将酶酶或或蛋蛋白白质质多多点点连连接接于于载载体体上上（无无机机载载体体、高高分分子载体）；子载体）；添添加加剂剂：保保护护蛋蛋白白质质（酶酶）不不受受氧氧化化剂剂氧氧化化、不不受受变变性性剂变性等；剂变性等；化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。第三十三页，讲稿共五十一页哦稳定剂稳定剂 共溶剂共溶剂 糖类，醇糖类，醇氨基酸及氨基酸及其衍生物其衍生物无机盐，无机盐，甘油，聚甘油，聚乙二醇等乙二醇等常用常用1-4M浓度共溶浓度共溶剂来稳定剂来稳定蛋白质和蛋白质和细胞器。细胞器。抗氧化剂抗氧化剂 底物、辅酶底物、辅酶 金属离子金属离子 化学交联剂化学交联剂半胱氨酸，半胱氨酸，2-巯基乙醇巯基乙醇还原谷胱甘还原谷胱甘肽，二巯基肽，二巯基赤藓醇等巯赤藓醇等巯基试剂可防基试剂可防止巯基氧化止巯基氧化植物抗氧化植物抗氧化剂如儿茶酚剂如儿茶酚黄酮等也具黄酮等也具有保护作用有保护作用酶可被底酶可被底物辅酶、物辅酶、竞争性抑竞争性抑制剂及反制剂及反应产物等应产物等所稳定。所稳定。金属离子不金属离子不仅可以影响仅可以影响酶的活性，酶的活性，还可以影响还可以影响酶的稳定性酶的稳定性如如Ca2+多位多位点结合使得点结合使得蛋白质分子蛋白质分子成为紧密的成为紧密的活性形式。活性形式。交联剂可在交联剂可在相隔较近的相隔较近的两个氨基酸两个氨基酸残基之间，残基之间，或蛋白质与或蛋白质与其他分子之其他分子之间（如固定间（如固定化载体）发化载体）发生交联反应生交联反应使蛋白质的使蛋白质的构象稳定。构象稳定。第三十四页，讲稿共五十一页哦三、化学物质的共价修饰作用三、化学物质的共价修饰作用 化化学学物物质质与与生生物物大大分分子子的的共共价价作作用用常常常常涉涉及及到到物物质质的的生生理理活活性性（包包括括药药理理、毒毒理理等等），如如何何判判断断化化合合物物与与蛋蛋白白质质分分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。1.生物体内蛋白质加合物的形成生物体内蛋白质加合物的形成 许许多多化化学学毒毒物物对对细细胞胞产产生生的的损损害害与与其其亲亲电电代代谢谢产产物物同同细细胞胞大大分分子子的的亲亲核核部部位位(如如蛋蛋白白质质的的巯巯基基)发发生生不不可可逆逆结结合合具具有密切关系。有密切关系。第三十五页，讲稿共五十一页哦当当外外源源化化合合物物的的活活性性代代谢谢产产物物与与细细胞胞内内重重要要生生物物大大分分子子，如如核核酸酸、蛋蛋白白质质、脂脂质质等等共共价价结结合合，发发生生烷烷基基化化或或芳芳基基化化，即即导导致致DNA损损伤伤、蛋蛋白白质质正正常常功功能能丧丧失失，乃乃至至细细胞胞的的损损伤伤或或死死亡亡、外外源源化化合合物物与与生生物物大大分分子子相相互互作作用用主主要要有有两两种方式：非共价结合和共价结合。种方式：非共价结合和共价结合。(1)可与蛋白质发生反应的化合物可与蛋白质发生反应的化合物 除除少少数数烷烷化化剂剂外外，绝绝大大多多数数外外源源化化合合物物需需经经体体内内代代谢谢活活化化，转转变变成成亲亲电电子子的的活活性性代代谢谢物物，再再与与细细胞胞内内生生物物大大分分子子中中的的亲亲核核部部位位和和基基团团发发生生共共价价结结合合，例例如如蛋蛋白白质质分分子子中中的的亲亲核核基基团团、DNA、RNA及及一一些些小小分分子子物物质质如如谷胱甘肽等的亲核部位等。谷胱甘肽等的亲核部位等。第三十六页，讲稿共五十一页哦(2)蛋白质分子中的可反应基团蛋白质分子中的可反应基团 致致癌癌物物分分子子量量的的大大小小不不同同，反反应应是是不不同同的的，分分子子量量较较小小的的，如如乙乙烯烯、丙丙烷烷和和苯苯乙乙烯烯的的氧氧化化物物、尿尿烷烷和和氯氯乙乙烯烯的的环环氧氧化化物物、丙丙烯烯酰酰胺胺等等，与与蛋蛋白白质质作作用用时时，所所形形成成的的加加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。第三十七页，讲稿共五十一页哦试剂类型试剂类型化合物或前体化合物或前体反应机制反应机制烷基化烷基化芳香基化芳香基化卤代物卤代物亲核取代亲核取代环氧化物环氧化物硫酸烷基酯硫酸烷基酯活泼的烯烃活泼的烯烃1,4-加成加成羰基化合物羰基化合物醛醛形成希夫碱形成希夫碱酰基化酰基化有机酸酐、酰氯等有机酸酐、酰氯等亲核取代或加成亲核取代或加成磷酰化磷酰化有机磷有机磷亲核取代亲核取代自由基自由基OH、CCl3自由基反应自由基反应具有亲电氮化合物具有亲电氮化合物芳香胺芳香胺 亲核取代亲核取代第三十八页，讲稿共五十一页哦2.氨基酸残基侧链基团的修饰氨基酸残基侧链基团的修饰 蛋蛋白白质质侧侧链链基基团团的的修修饰饰是是通通过过选选择择性性的的试试剂剂或或亲亲和和标标记记试试剂剂与与蛋蛋白白质质分分子子侧侧链链上上特特定定的的功功能能基基团团发发生生化化合合反反应应而而实实现现的的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。理理想想情情况况下下，修修饰饰试试剂剂只只是是有有选选则则地地与与某某一一特特定定的的残残基基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。在在此此基基础础上上，从从该该基基团团的的修修饰饰对对蛋蛋白白质质分分子子的的生生物物活活性性所所造造成成的的影影响响，就就可可以以推推测测出出被被修修饰饰的的残残基基在在该该蛋蛋白白质质分分子子中中的的功能。功能。第三十九页，讲稿共五十一页哦3.巯基的化学修饰巯基的化学修饰 5,5-二二硫硫-2-硝硝基基苯苯甲甲酸酸(DTNB)，又又称称为为Ellman试试剂剂，目目前前已已成成为为最最常常用用的的巯巯基基修修饰饰试试剂剂。DTNB可可与与巯巯基基反反应应形形成成二二硫硫键键，产产生生的的5-巯巯基基-2-硝硝基基苯苯甲甲酸酸阴阴离离子子在在412nm具具有有很很强强的的吸吸收收，可以通过光吸收变化监测反应程度。可以通过光吸收变化监测反应程度。有有机机汞汞试试剂剂是是最最早早使使用用的的巯巯基基修修饰饰试试剂剂之之一一，其其中中最最常常用用的的是是对对氯氯汞汞苯苯甲甲酸酸，该该化化合合物物溶溶于于水水形形成成羟羟基基衍衍生生物物，与与巯巯基基相互作用时相互作用时255nm处光吸收具有较大的增强效应。处光吸收具有较大的增强效应。第四十页，讲稿共五十一页哦4.氨基的化学修饰氨基的化学修饰 有有许许多多化化合合物物都都可可用用来来修修饰饰赖赖氨氨酸酸残残基基，三三硝硝基基苯苯磺磺酸酸(TNBS)就就是是其其中中非非常常有有效效的的一一种种。TNBS与与赖赖氨氨酸酸残残基基反反应，在应，在420nm和和367nm能够产生特定的光吸收。能够产生特定的光吸收。在在蛋蛋白白质质序序列列分分析析中中，用用于于多多肽肽链链N-末末端端残残基基的的测测定定的的化化合合修修饰饰方方法法2,4-二二硝硝基基氟氟苯苯(DNFD)法法、丹丹磺磺酰酰氯氯(DNS)法法和和)苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修饰方法法都是常用的氨基修饰方法。第四十一页，讲稿共五十一页哦5.羧基的化学修饰羧基的化学修饰 水水溶溶性性的的碳碳化化二二亚亚胺胺类类特特定定修修饰饰蛋蛋白白质质分分子子的的羧羧基基基基团团，目目前前已已成成为为一一种种应应用用最最普普遍遍的的标标准准方方法法，它它在在比比较较温温和和的的条件下就可以进行。条件下就可以进行。第四十二页，讲稿共五十一页哦6.咪唑基的化合修饰咪唑基的化合修饰 焦焦碳碳酸酸二二乙乙酯酯(DPC)是是最最常常用用的的修修饰饰组组氨氨酸酸残残基基的的试试剂剂。该该试试剂剂在在接接近近中中性性的的情情况况下下表表现现出出比比较较好好的的专专一一性性，与与组组氨氨酸酸残残基基反反应应使使咪咪唑唑基基上上的的1个个氮氮羧羧乙乙基基化化，并并且且使使得得在在240nm处处的的光光吸吸收收增增加加。该该取取代代反反应应在在碱碱性性条条件件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。第四十三页，讲稿共五十一页哦四、