第二章酶的生物合成法生产.ppt

第二章酶的生物合成法生产现在学习的是第1页，共90页 酶的发酵生产根据微生物培养方式的不酶的发酵生产根据微生物培养方式的不同，可以分为固体培养发酵、液体深层同，可以分为固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和固定化原生质发酵、固定化细胞发酵和固定化原生质体发酵等。体发酵等。现在学习的是第2页，共90页 固体培养发酵的培养基，以麸皮、米糠等固体培养发酵的培养基，以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或麸曲，经过灭菌、冷却后，接制成固体或麸曲，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获得所需的酶。我国传统的各种酒酵，以获得所需的酶。我国传统的各种酒曲、酱油曲等都是采用这种方式进行生产。曲、酱油曲等都是采用这种方式进行生产。其主要目的是获得所需的淀粉酶类和蛋白其主要目的是获得所需的淀粉酶类和蛋白酶类，以催化淀粉和蛋白质的水解。固体酶类，以催化淀粉和蛋白质的水解。固体培养发酵的优点是设备简单，操作方便，培养发酵的优点是设备简单，操作方便，麸曲中酶的浓度较高，特别适用于各种霉麸曲中酶的浓度较高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶；其缺点是劳动强度菌的培养和发酵产酶；其缺点是劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长。较大，原料利用率较低，生产周期较长。现在学习的是第3页，共90页液体深层发酵是采用液体培养基，置于生液体深层发酵是采用液体培养基，置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定的条件下，进行发酵，生酶细胞，在一定的条件下，进行发酵，生产得到所需的酶。液体深层发酵不仅适合产得到所需的酶。液体深层发酵不仅适合于微生物细胞的发酵生产，也可以用于植于微生物细胞的发酵生产，也可以用于植物细胞和动物细胞的培养。液体深层发酵物细胞和动物细胞的培养。液体深层发酵的机械化程度较高，技术管理较严格，酶的机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高，是目前酶发酵生产的主要方式。高，是目前酶发酵生产的主要方式。现在学习的是第4页，共90页 固定化细胞发酵是固定化细胞发酵是20世纪世纪70年代后期，在年代后期，在固定化酶的基础上发展起来的发酵技术。固定化酶的基础上发展起来的发酵技术。固定化细胞是指固定在水不溶性的载体上，固定化细胞是指固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。固定化细胞发酵具有：细胞密度大，可提固定化细胞发酵具有：细胞密度大，可提高产酶能力；发酵稳定性好，可以反复使高产酶能力；发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长的时间；细胞固定在载用或连续使用较长的时间；细胞固定在载体上，流失较少，可以在高稀释率的条件体上，流失较少，可以在高稀释率的条件下连续发酵，利于连续化、自动化生产；下连续发酵，利于连续化、自动化生产；发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等显著特点。提高产品质量等显著特点。现在学习的是第5页，共90页 固定化原生质体技术是固定化原生质体技术是20世纪世纪80年代中期年代中期发展起来的技术。固定化原生质体是指固发展起来的技术。固定化原生质体是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。原生质体由于去除了命活动的原生质体。原生质体由于去除了细胞壁这一扩散障碍，有利于胞内物质透细胞壁这一扩散障碍，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外。这样就可以不经过细胞膜分泌到细胞外。这样就可以不经过细胞破碎而直接从发酵液中分离得到所过细胞破碎而直接从发酵液中分离得到所需的发酵产物，为胞内物质的生产开辟了需的发酵产物，为胞内物质的生产开辟了新途径。由于有载体的保护作用，固定化新途径。由于有载体的保护作用，固定化原生质体有较好的稳定性，可以反复使用原生质体有较好的稳定性，可以反复使用或连续使用较长一段时间。或连续使用较长一段时间。现在学习的是第6页，共90页现在学习的是第7页，共90页现在学习的是第8页，共90页现在学习的是第9页，共90页 一、常用的产酶微生物用于酶的生产的细胞必须具备几个条件用于酶的生产的细胞必须具备几个条件酶的产量高酶的产量高容易培养和管理容易培养和管理产酶稳定性好产酶稳定性好利于酶的分离纯化利于酶的分离纯化安全可靠，无毒性安全可靠，无毒性现在学习的是第10页，共90页常用的产酶微生物常用的产酶微生物 1大肠杆菌(Escherichia coli)现在学习的是第11页，共90页 大肠杆菌细胞有的呈杆状，有的近似球状，大小为大肠杆菌细胞有的呈杆状，有的近似球状，大小为0.5m(1.03.0)m，一般无荚膜，无芽孢，革兰氏，一般无荚膜，无芽孢，革兰氏染色阴性，运动或不运动，运动者周生鞭毛。菌落从染色阴性，运动或不运动，运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色，光滑闪光，扩展。白色到黄白色，光滑闪光，扩展。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,1884年由丹麦医师年由丹麦医师Gram创立创立 细菌先经碱性染料结晶细菌先经碱性染料结晶染色染色,而经碘液媒染后而经碘液媒染后,用酒精脱色用酒精脱色,在一定条件下有的细在一定条件下有的细菌此色不被脱去菌此色不被脱去,有的可被脱去有的可被脱去,因此可把细菌分为两大因此可把细菌分为两大类类,前者叫做革兰氏阳性菌前者叫做革兰氏阳性菌(G+).现在学习的是第12页，共90页大肠杆菌谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸大肠杆菌谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或用于生产含量或用于生产-氨基丁酸；氨基丁酸；大肠杆菌天冬氨酸酶，用于催化延胡索酸大肠杆菌天冬氨酸酶，用于催化延胡索酸加氨生产加氨生产L-天冬氨酸；天冬氨酸；大肠杆菌青霉素酰化酶，用于生产新的半大肠杆菌青霉素酰化酶，用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素；合成青霉素或头孢霉素；大肠杆菌天冬酰胺酶，对白血病具有显著大肠杆菌天冬酰胺酶，对白血病具有显著疗效；疗效；大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶，用于分解乳糖或其半乳糖苷酶，用于分解乳糖或其他他-半乳糖苷。半乳糖苷。现在学习的是第13页，共90页 2枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状，枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状，大小为大小为(0.70.8)m(23)m，单个细胞，单个细胞，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。芽孢性。芽孢(0.60.9)m(1.01.5)m，椭圆，椭圆至柱状。菌落粗糙，不透明，不闪光，扩至柱状。菌落粗糙，不透明，不闪光，扩张，白色或微带黄色。张，白色或微带黄色。现在学习的是第14页，共90页 枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，可以用于生产可以用于生产a-淀粉酶，蛋白酶，淀粉酶，蛋白酶，-葡聚糖葡聚糖酶，酶，5核苷酸酶，碱性磷酸酶等。例如，枯核苷酸酶，碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌草杆菌BF7658是国内用于生产是国内用于生产a-淀粉酶的淀粉酶的主要菌株；枯草杆菌主要菌株；枯草杆菌ASl.398用于生产中性用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。蛋白酶和碱性磷酸酶。现在学习的是第15页，共90页3黑曲霉黑曲霉(Aspergillusniger)黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横膈的分支菌丝构成，菌丛黑褐由具有横膈的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。球形，平滑或粗糙。现在学习的是第16页，共90页黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶，胞内酶。例如，糖化酶，a-淀粉酶，酸性蛋淀粉酶，酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，柚苷酶等。皮苷酶，柚苷酶等。现在学习的是第17页，共90页 4米曲酶(Aspergillus oryzae)米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达2mm左右，粗糙。现在学习的是第18页，共90页 米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶核酸酶P等。等。现在学习的是第19页，共90页5青霉(Penicillium)青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横膈，分生淡色或具有鲜明的颜色，有横膈，分生孢子梗亦有横膈，光滑或粗糙，顶端形孢子梗亦有横膈，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。现在学习的是第20页，共90页青霉菌种类很多，其中产黄青霉青霉菌种类很多，其中产黄青霉(Penzcilliumchrysogenum)用于生产葡萄糖用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要作用主要作用于青霉素于青霉素)、果胶酶、纤维素酶等。橘青霉、果胶酶、纤维素酶等。橘青霉(Penicilliumcityrinum)用于生产用于生产5，磷酸二，磷酸二酯酶、脂舫酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酯酶、脂舫酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶酶、核酸酶S1、核酸酶、核酸酶P1等。等。现在学习的是第21页，共90页6木霉木霉(Trichoderma)木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二级分枝、三级分枝，分支末端为小梗，瓶状，束生、级分枝、三级分枝，分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠黏对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠黏液把他们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球液把他们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。亮黄绿色。木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有素酶中包含有C1酶、酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的木霉中含有较强的17a-羟化酶，常用于甾体转化。羟化酶，常用于甾体转化。现在学习的是第22页，共90页 7根霉根霉(Rhizopus)生产糖化酶、生产糖化酶、a淀粉酶、蔗糖酶、碱性淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。纤维素酶、半纤维素酶等。现在学习的是第23页，共90页8毛霉毛霉(Mucor)毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、a淀淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。现在学习的是第24页，共90页 9红曲霉红曲霉红曲霉可用于生产红曲霉可用于生产a-淀粉酶、糖淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。10链霉菌链霉菌链霉菌是生产葡萄糖异构酶的链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。几丁质酶等。现在学习的是第25页，共90页二、发酵工艺条件及其控制微生物发酵产酶的工艺流程微生物发酵产酶的工艺流程现在学习的是第26页，共90页保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，这个过程称为细胞活化。这个过程称为细胞活化。活化了的细胞需在种子培养基中经过一活化了的细胞需在种子培养基中经过一级乃至数级的扩大培养，以获得足够数量级乃至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。种子扩大培养所使用的培养的优质细胞。种子扩大培养所使用的培养基和培养条件，应当适合细胞生长、繁殖基和培养条件，应当适合细胞生长、繁殖的最适条件。的最适条件。现在学习的是第27页，共90页(二)培养基的配制 1培养基的基本组分培养基的基本组分(1)碳源碳源作用？如何选择？作用？如何选择？在酶的生物合成法生产中，首先要从细在酶的生物合成法生产中，首先要从细胞的营养要求和代谢调节方面考虑碳源胞的营养要求和代谢调节方面考虑碳源的选择，此外还要考虑到原料的来源是的选择，此外还要考虑到原料的来源是否充裕、价格是否低廉、对发酵工艺条否充裕、价格是否低廉、对发酵工艺条件和酶的分离纯化有否影响等因素。件和酶的分离纯化有否影响等因素。现在学习的是第28页，共90页A 不同的细胞对碳源的利用有所不同，在配制培养基时，不同的细胞对碳源的利用有所不同，在配制培养基时，应当根据细胞的营养需要而选择不同的碳源。目前，大应当根据细胞的营养需要而选择不同的碳源。目前，大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。例如，黑曲霉具有水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。例如，黑曲霉具有淀粉酶系，可以采用淀粉为碳源；酵母不能利用淀粉，淀粉酶系，可以采用淀粉为碳源；酵母不能利用淀粉，只能采用蔗糖或葡萄糖等为碳源等。植物细胞主要采用只能采用蔗糖或葡萄糖等为碳源等。植物细胞主要采用蔗糖为碳源；具有叶绿体的植物和藻类可以利用二氧化蔗糖为碳源；具有叶绿体的植物和藻类可以利用二氧化碳为碳源等。碳为碳源等。B在酶的发酵生产过程中，除了根据细胞的不同营养要在酶的发酵生产过程中，除了根据细胞的不同营养要求以外，还要充分注意到某些碳源对酶的生物合成具有求以外，还要充分注意到某些碳源对酶的生物合成具有代谢调节的功能代谢调节的功能。现在学习的是第29页，共90页(2)氮源氮源作用？作用？分类？氮源可以分为有机氮源和无机氮源分类？氮源可以分为有机氮源和无机氮源两大类。酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋两大类。酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、多白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、多肽、氨基酸、氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝肽、氨基酸、氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等铵盐和硝酸盐属酸铵、硝酸钾、硝酸钠等铵盐和硝酸盐属于什么氮源？于什么氮源？选择？动物细胞、植物细胞、微生物细胞选择？动物细胞、植物细胞、微生物细胞？现在学习的是第30页，共90页(3)无机盐 作用作用无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的pH值、氧值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。化还原电位和渗透压起调节作用。分类分类根据细胞对无机元素需要量的不同，无机元根据细胞对无机元素需要量的不同，无机元素可以分为大量元素和微量元素两大类。大量元素素可以分为大量元素和微量元素两大类。大量元素主要有：磷、硫、钾、钠、钙、镁、氯等；微量元主要有：磷、硫、钾、钠、钙、镁、氯等；微量元素是指细胞生命活动必不可少，但是需要量微小的素是指细胞生命活动必不可少，但是需要量微小的元素，主要包括：铜、锰、锌、钼、钴、溴、碘等。元素，主要包括：铜、锰、锌、钼、钴、溴、碘等。微量元素的需要量很少，过量反而对细胞的生命活微量元素的需要量很少，过量反而对细胞的生命活动有不良影响，必须严加控制。动有不良影响，必须严加控制。现在学习的是第31页，共90页(4)生长因素生长因素是指细胞生长繁殖所必需的微量生长因素是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、嘌呤、有机化合物，主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素以及动、植物生长激素等。嘧啶、维生素以及动、植物生长激素等。在酶的发酵生产中，一般在培养基中添加在酶的发酵生产中，一般在培养基中添加含有多种生长因素的天然原料的水解物，含有多种生长因素的天然原料的水解物，如酵母膏、玉米浆、麦芽汁、麸皮水解液如酵母膏、玉米浆、麦芽汁、麸皮水解液等，以提供细胞所需的各种生长因素；也等，以提供细胞所需的各种生长因素；也可以加入某种或某几种提纯的有机化合物，可以加入某种或某几种提纯的有机化合物，以满足细胞生长繁殖之需。以满足细胞生长繁殖之需。现在学习的是第32页，共90页2微生物发酵产酶的几种发酵培养基微生物发酵产酶的几种发酵培养基(1)枯草杆菌枯草杆菌BF7658a-酶发酵培养基：玉米粉酶发酵培养基：玉米粉8，豆饼，豆饼粉粉4，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠0.8%，氯化钙，氯化钙0.2%，氯化铵，氯化铵0.15(自然自然pH值值)。（2）枯草杆菌）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉米粉4，豆饼粉，豆饼粉3，麸皮，麸皮3.2，糠，糠1，磷酸氢二，磷酸氢二钠钠04，磷酸二氢钾，磷酸二氢钾0.03(自然自然pH值值)。（3）黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉）黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10，豆饼，豆饼粉粉4，麸皮，麸皮1(pH4.45.0)。(4)地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉粉5.5，豆饼，豆饼4，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾，磷酸二氢钾0.03(pH8.5)。现在学习的是第33页，共90页(三)pH值的调节控制 不同的细胞，其生长繁殖的最适不同的细胞，其生长繁殖的最适pH值有所值有所不同。不同。细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适值与生长最适pH值值往往有所不同。往往有所不同。有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的过程中，通过控制培养基的pH值，往往可值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。以改变各种酶之间的产量比例。随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的累，培养基的pH值往往会发生变化。值往往会发生变化。现在学习的是第34页，共90页在发酵过程中，必须对培养基的在发酵过程中，必须对培养基的pH值进行值进行适当的控制和调节。调节适当的控制和调节。调节PH值的方法可以值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定使用缓冲液来稳定pH值；或者在必要时通值；或者在必要时通过滴加适宜的酸、碱溶液的方法调节培养过滴加适宜的酸、碱溶液的方法调节培养基的基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。值，以满足细胞生长和产酶的要求。现在学习的是第35页，共90页(四)温度的调节控制 不同的细胞有各自不同的最适生长温度。不同的细胞有各自不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为例如，枯草杆菌的最适生长温度为3437，黑曲霉的最适生长温度为，黑曲霉的最适生长温度为2832等。等。有些细胞发酵量的最适温度与细胞生有些细胞发酵量的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。长最适温度。现在学习的是第36页，共90页 在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。两者扩散，会使培养基的温度不断降低。两者综合结果，决定了培养基的温度。由于在综合结果，决定了培养基的温度。由于在细胞生长和产酶的不同阶段，细胞新陈代细胞生长和产酶的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量有较大差别，散失的热量又谢放出的热量有较大差别，散失的热量又受到环境温度等因素的影响，使培养基的受到环境温度等因素的影响，使培养基的温度发生明显的变化。为此必须经常及时温度发生明显的变化。为此必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宣的范围内。维持在适宣的范围内。现在学习的是第37页，共90页温度的调节一般采用热水升温、冷水降温温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设有在发酵罐或其他生物反应器中，均应设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。和热水，以满足温度调控的需要。现在学习的是第38页，共90页(五)溶解氧的调节控制 调节溶解氧的方法主要有以下几种。调节溶解氧的方法主要有以下几种。(1)调节通气量调节通气量(2)调节氧的分压提高氧的分压，可以增调节氧的分压提高氧的分压，可以增加氧的溶解度，从而提高溶氧速率。加氧的溶解度，从而提高溶氧速率。(3)调节气液接触时间调节气液接触时间(4)调节气液接触面积调节气液接触面积(5)改变培养液的性质改变培养液的性质现在学习的是第39页，共90页(六)提高酶产量的措施1添加诱导物添加诱导物诱导物一般可以分为诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物、类：酶的作用底物、酶的催化反应产物和作用底物的类似物。酶的催化反应产物和作用底物的类似物。2控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据其阻遏作用根据其作用机理的不同，可以分为产物阻遏和作用机理的不同，可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。分解代谢物阻遏两种。现在学习的是第40页，共90页控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。例如，作者等人研究表明，量的有效措施。例如，作者等人研究表明，枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成受到其反枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成受到其反应产物无机磷酸的阻遏，当培养基中无机应产物无机磷酸的阻遏，当培养基中无机磷酸的含量超过磷酸的含量超过1.0mmolL的时候，该霉的时候，该霉的生物合成完全受到阻遏。当培养基中无的生物合成完全受到阻遏。当培养基中无机磷酸的含量降低到机磷酸的含量降低到0.01mmolL的时候，的时候，阻遏解除，该酶大量合成。所以，为了提阻遏解除，该酶大量合成。所以，为了提高该酶的产量，必须限制培养基中无机磷高该酶的产量，必须限制培养基中无机磷的含量。的含量。现在学习的是第41页，共90页 3添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。从而提高酶的产量。4添加产酶促进剂添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者橘青霉的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者橘青霉磷酸二酯酶的产量提高磷酸二酯酶的产量提高120倍倍现在学习的是第42页，共90页(七七)微生物发酵产酶：实例微生物发酵产酶：实例微生物发酵产酶是目前酶生产的主要方法。微生微生物发酵产酶是目前酶生产的主要方法。微生物种类繁多，产酶品种多样。现以纳豆杆菌液体物种类繁多，产酶品种多样。现以纳豆杆菌液体发酵生产纳豆激酶为例说明微生物发酵产酶的基发酵生产纳豆激酶为例说明微生物发酵产酶的基本条件和过程。本条件和过程。纳豆激酶纳豆激酶(nattokinase，简称，简称NK)是是1987年日本的须年日本的须见洋行从日本传统食品纳豆中分离得到的一种具有溶见洋行从日本传统食品纳豆中分离得到的一种具有溶血栓功效的蛋白酶，可以通过枯草杆菌血栓功效的蛋白酶，可以通过枯草杆菌(Bacillussubtis)或纳豆杆菌或纳豆杆菌(Bacillusnatto)发酵得到。从发酵得到。从1997年开始，郭勇等人进行了纳豆杆菌发酵纳豆激酶年开始，郭勇等人进行了纳豆杆菌发酵纳豆激酶的研究，取得可喜成果。现将发酵工艺过程介绍如下。的研究，取得可喜成果。现将发酵工艺过程介绍如下。现在学习的是第43页，共90页 菌株：纳豆杆菌。菌株：纳豆杆菌。固体培养基：蛋白胨固体培养基：蛋白胨1，牛肉膏，牛肉膏0.5，NaC10.5，琼脂，琼脂2%(自然自然pH值值)。液体培养基：葡萄糖液体培养基：葡萄糖2，大豆蛋白胨，大豆蛋白胨3，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠0.6，磷酸二氢钠，磷酸二氢钠0.1%,氯氯化钙化钙0.02%，硫酸镁，硫酸镁0.05(pH7.0)。工艺过程：保藏菌株工艺过程：保藏菌株菌种活化菌种活化(固体固体培养基，培养基，37培养培养24h)种子培养种子培养(液体液体培养基，培养基，37培养培养24h)发酵发酵(液体培养液体培养基，接种量基，接种量23，37发酵发酵72h)发发酵液酵液分离纯化分离纯化纳豆激酶。纳豆激酶。现在学习的是第44页，共90页三、固定化微生物细胞发酵产酶三、固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞又称固定化活细胞或固定化固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指采用各种方法固定在载增殖细胞，是指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内进行生长、体上，在一定的空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。繁殖和新陈代谢的细胞。固定化细胞是固定化细胞是20世纪世纪70后期发展起来的后期发展起来的技术。已成功生产了技术。已成功生产了-淀粉酶、糖化酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶、溶菌酶、天冬酰胺果胶酶、纤维素酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等。酶等。现在学习的是第45页，共90页（一）、固定化细胞发酵产酶的特点（一）、固定化细胞发酵产酶的特点1、提高产酶率、提高产酶率2、可以反复使用或连续使用较长时间、可以反复使用或连续使用较长时间3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失4、发酵稳定性好、发酵稳定性好5、缩短发酵周期，提高设备利用率、缩短发酵周期，提高设备利用率6、产品容易分离纯化、产品容易分离纯化7、适于胞外酶等胞外产物的生产、适于胞外酶等胞外产物的生产现在学习的是第46页，共90页（二）、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制（二）、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制1、固定化细胞的预培养、固定化细胞的预培养2、溶解氧的供给、溶解氧的供给3、温度的控制、温度的控制4、培养基组分的控制、培养基组分的控制培养基的某些组分可能影响某些固定化载体的结构，培养基的某些组分可能影响某些固定化载体的结构，为了保持固定化细胞的完整结构，应控制其含量。如为了保持固定化细胞的完整结构，应控制其含量。如采用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞，培养基中过量采用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞，培养基中过量的磷酸盐会使其结构受到破坏，应限止，在培养基中的磷酸盐会使其结构受到破坏，应限止，在培养基中添加一定浓度的钙离子，可以保持固定化细胞的稳定添加一定浓度的钙离子，可以保持固定化细胞的稳定性。性。现在学习的是第47页，共90页四、固定化微生物原生质体发酵产酶四、固定化微生物原生质体发酵产酶固定化原生质体是指固定在载体上，在一固定化原生质体是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。定的空间范围内进行生命活动的原生质体。原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。原生质体由于除去了物质组成的微球体。原生质体由于除去了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶等胞内产物的生产。等胞内产物的生产。现在学习的是第48页，共90页（一）、固定化原生质体的特点（一）、固定化原生质体的特点1、变胞内产物为胞外产物、变胞内产物为胞外产物固定化黑曲霉固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，使细胞内葡原生质体生产葡萄糖氧化酶，使细胞内葡萄糖氧化酶的萄糖氧化酶的90以上分泌到细胞外。以上分泌到细胞外。2、提高产酶率、提高产酶率固定化枯草芽孢杆菌原生固定化枯草芽孢杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中，间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中，产酶率提高产酶率提高36。3、稳定性好、稳定性好4、易于分离纯化、易于分离纯化现在学习的是第49页，共90页（二）、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件控制（二）、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件控制1、渗透压的控制、渗透压的控制添加渗透压稳定剂添加渗透压稳定剂2、防止细胞壁再生、防止细胞壁再生添加青霉素等抑制细添加青霉素等抑制细胞壁生长的物质，以保持固定化原生质体胞壁生长的物质，以保持固定化原生质体的特性的特性3、保证原生质体的浓度、保证原生质体的浓度由于固定化原生质体影响了细胞的生长繁由于固定化原生质体影响了细胞的生长繁殖，在制备时，应保证原生质体的浓度达殖，在制备时，应保证原生质体的浓度达到一定的水平。到一定的水平。现在学习的是第50页，共90页细细胞种胞种类类植物植物细细胞胞微生物微生物细细胞胞动动物物细细胞胞细细胞大小胞大小/m m20203003001 110101010100100倍增倍增时间时间/h/h12120.30.60.30.61515营营养要求养要求简单简单简单简单复复杂杂光照要求光照要求大多要求大多要求不要求不要求不要求不要求对对剪切力剪切力的敏感性的敏感性敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感敏感敏感主要主要产产物物色素、色素、药药物、香精物、香精醇、氨基酸、抗生素、核醇、氨基酸、抗生素、核苷酸、有机酸、苷酸、有机酸、酶酶等等疫苗、激素、疫苗、激素、单单克隆抗体、克隆抗体、酶酶等等现在学习的是第51页，共90页一、植物细胞的特性体积大体积大生长速率和代谢速率比微生物低生长速率和代谢速率比微生物低营养要求简单营养要求简单要求一定的光照时间和光照强度要求一定的光照时间和光照强度对剪切力敏感，这在生物反应器的研对剪切力敏感，这在生物反应器的研制和培养过程通风、搅拌方面要严加控制和培养过程通风、搅拌方面要严加控制制目的产物不同目的产物不同现在学习的是第52页，共90页二、植物细胞培养的特点1、提高产率、提高产率实例实例日本三井石油化学工业公司于日本三井石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功采用紫草细胞年在世界上首次成功采用紫草细胞培养生产紫草宁，培养生产紫草宁，750L反应器，培养反应器，培养23天，细胞中紫草宁的含量达到细胞干重天，细胞中紫草宁的含量达到细胞干重的的14，比紫草根中紫草宁的含量高，比紫草根中紫草宁的含量高10倍。倍。P68现在学习的是第53页，共90页紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系列萘醌紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系列萘醌类化合物，具有凉血、活血、解毒和透疹的作用。用于类化合物，具有凉血、活血、解毒和透疹的作用。用于子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、中耳炎、烫伤、刀伤、子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、中耳炎、烫伤、刀伤、湿疹、水疱及其他皮肤病。紫草辅助米非司酮可提高流湿疹、水疱及其他皮肤病。紫草辅助米非司酮可提高流产成功率。具有抗垂体促性腺激素的作用，可以用于经产成功率。具有抗垂体促性腺激素的作用，可以用于经期综合征，可以预防麻疹，有消肿作用，避孕作用。其期综合征，可以预防麻疹，有消肿作用，避孕作用。其中紫草宁具有抗肿瘤及活性，对细胞增殖有一中紫草宁具有抗肿瘤及活性，对细胞增殖有一定的抑制作用。减少自发性乳癌的发病率，对肝癌和定的抑制作用。减少自发性乳癌的发病率，对肝癌和肺癌有一定的放射增敏作用。紫草宁可以提取肺癌有一定的放射增敏作用。紫草宁可以提取红色素，紫草油以及紫草可生产紫草等紫草系列红色素，紫草油以及紫草可生产紫草等紫草系列保健品。可以作为如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮保健品。可以作为如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮料、熏肉、医药胶囊、防晒制品及印染等着色剂和添加料、熏肉、医药胶囊、防晒制品及印染等着色剂和添加剂。剂。现在学习的是第54页，共90页 大规模细胞培养生物反应器大规模细胞培养生物反应器市场市场前景及经济效益分析前景及经济效益分析:以年产能以年产能力力50公斤紫草宁为例，国际市场价（精品公斤紫草宁为例，国际市场价（精品干粉）每公斤价格为干粉）每公斤价格为5000-7000美元，预美元，预计每年新增利税计每年新增利税25-35万美元。除此之外，万美元。除此之外，紫草宁因其色泽鲜艳，附着力强被国际紫草宁因其色泽鲜艳，附着力强被国际誉为红色素之王，可作为保健食品、保誉为红色素之王，可作为保健食品、保健饮品、保健化妆品的添加剂。健饮品、保健化妆品的添加剂。现在学习的是第55页，共90页2、缩短周期、缩短周期细胞培养倍增时间一般为细胞培养倍增时间一般为1260h，一般生产周期，一般生产周期1530d，与完整植，与完整植株比较，大大缩短了生产周期。株比较，大大缩短了生产周期。3、易于管理，减轻劳动强度、易于管理，减轻劳动强度4、提高产品质量、提高产品质量产物浓度较高，杂质少；产物浓度较高，杂质少；污染少，易于分离纯化。污染少，易于分离纯化。5、缺点、缺点与微生物相比，植物细胞对剪切力与微生物相比，植物细胞对剪切力敏感，生产周期长，需光照。这些会在植敏感，生产周期长，需光照。这些会在植物细胞生物反应器的设计和工艺条件控制物细胞生物反应器的设计和工艺条件控制等方面引起一系列的问题，必须考虑和解等方面引起一系列的问题，必须考虑和解决。决。现在学习的是第56页，共90页三、植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制三、植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制（一）、工艺流程（一）、工艺流程外植体外植体-诱导愈伤组织诱导愈伤组织-细胞细胞培养培养-分离纯化分离纯化-酶酶现在学习的是第57页，共90页（二）、植物细胞培养的培养基1、植物细胞培养基的特点、植物细胞培养基的特点观察思考观察思考P70植物细胞培养基的特点植物细胞培养基的特点？现在学习的是第58页，共90页植物细胞培养产酶实例植物细胞培养产酶实例据报道，已经研究过据报道，已经研究过200多种植物细胞培多种植物细胞培养，其产物超过养，其产物超过400中。其中通过植物细中。其中通过植物细胞培养产生的酶有胞培养产生的酶有10多种，如表所示。多种，如表所示。现在学习的是第59页，共90页酶酶产产酶酶植物植物细细胞（年份）胞（年份）糖苷糖苷酶酶过过氧化物氧化物酶酶糖化糖化酶酶木瓜蛋白木瓜蛋白酶酶超氧化物岐化超氧化物岐化酶酶菠菠萝萝蛋白蛋白酶酶胡胡萝萝卜卜细细胞（胞（19811981）甜菜甜菜细细胞胞19831983，大豆，大豆细细胞胞19891989甜菜甜菜细细胞胞19881988番木瓜番木瓜细细胞胞19901990大蒜大蒜细细胞胞19931993