高效液相色谱 (4)精选PPT讲稿.ppt

关于高效液相色谱(4)第一页，讲稿共九十七页哦导导 学学 以以色谱法导论和气相色谱法色谱法导论和气相色谱法两章为基础，两章为基础，通过学习，掌握通过学习，掌握分离原理分离原理及分类，了解液相色及分类，了解液相色谱和气相色谱的异同，对高效液相色谱仪的流程谱和气相色谱的异同，对高效液相色谱仪的流程了解的前提下，注意了解的前提下，注意梯度洗脱梯度洗脱装置；对本章中装置；对本章中提及的几种液相色谱法，应侧重掌握其原理和提及的几种液相色谱法，应侧重掌握其原理和其固定相及流动相的要求，主要是其固定相及流动相的要求，主要是化学键合相化学键合相色谱法色谱法，而对，而对“色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择”，是对，是对P445的表进行理解。的表进行理解。第二页，讲稿共九十七页哦20-1 概述概述一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法二、液相色谱分离原理及分类二、液相色谱分离原理及分类第三页，讲稿共九十七页哦高压液相色谱法在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法，也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。第四页，讲稿共九十七页哦分离原理分离原理色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用力，作用力的大小，决定或洗脱液）以及固定相分子间的作用力，作用力的大小，决定或洗脱液）以及固定相分子间的作用力，作用力的大小，决定或洗脱液）以及固定相分子间的作用力，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为色谱过程的保留行为色谱过程的保留行为色谱过程的保留行为。第五页，讲稿共九十七页哦20-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液高效液相色谱仪相色谱仪由由高压输高压输液系统液系统、进样系统、进样系统、分离系统分离系统分离系统分离系统、检测系统、检测系统、记录系统记录系统等五大部分等五大部分等五大部分等五大部分组成。组成。组成。组成。第六页，讲稿共九十七页哦一、高压输液系统一、高压输液系统 高压输液系统由高压输液系统由溶剂贮存器溶剂贮存器、高压泵高压泵、梯度洗脱装置梯度洗脱装置和和压力表压力表等组成。等组成。1、溶剂贮存器、溶剂贮存器2、高压输液泵、高压输液泵 3、梯度洗脱装置梯度洗脱装置第七页，讲稿共九十七页哦输液泵输液泵高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。第八页，讲稿共九十七页哦.对输液泵的基本要求流量准确可调。流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于0.5%。耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10um粒径）的填料，在高压下填充到柱管中，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动。泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。第九页，讲稿共九十七页哦输液泵输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。第十页，讲稿共九十七页哦脱气装置脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。第十一页，讲稿共九十七页哦梯度洗脱装置梯度洗脱装置为什么要进行梯度洗脱？在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。第十二页，讲稿共九十七页哦梯度洗脱操作线性梯度线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。第十三页，讲稿共九十七页哦(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第十四页，讲稿共九十七页哦二、进样系统二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。液相色谱的进样方式有两种。试样有效地送入色谱柱上进行分离。液相色谱的进样方式有两种。试样有效地送入色谱柱上进行分离。液相色谱的进样方式有两种。试样有效地送入色谱柱上进行分离。液相色谱的进样方式有两种。进样器：微量注射器和进样阀。进样器：微量注射器和进样阀。进样器：微量注射器和进样阀。进样器：微量注射器和进样阀。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器。方便的六通阀进样器。方便的六通阀进样器。方便的六通阀进样器。第十五页，讲稿共九十七页哦分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10微米粒径的球形颗粒。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的,第十六页，讲稿共九十七页哦填料的结构色谱填料是由基质和功能层两部分构成。基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。填料的物理结构：分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型。第十七页，讲稿共九十七页哦四、检测器四、检测器 检测器是液相色谱仪的三大关键部件检测器是液相色谱仪的三大关键部件之一。对检测器的要求是，灵敏度高、之一。对检测器的要求是，灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死体积小以及重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。对温度和流量的变化不敏感等。第十八页，讲稿共九十七页哦检测器的分类检测器的分类 在液相色谱中，有两种类型的检测器，在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组分的，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于这类的检物理或物理化学特性有响应。属于这类的检测器有紫外、荧光、电化学检测器等。另一测器有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。属于这类的检测器有示差或化学性质有响应。属于这类的检测器有示差折光检测器等。折光检测器等。第十九页，讲稿共九十七页哦紫外紫外-可见光检测器可见光检测器原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。第二十页，讲稿共九十七页哦二极管阵列检测器 以光电二极管阵列（作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。第二十一页，讲稿共九十七页哦第二十二页，讲稿共九十七页哦直接紫外检测：所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。间接紫外检测：使用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。柱后衍生化光度检测：对于那些可以与显色剂反应生成有色配合物的组分，可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色配合物。第二十三页，讲稿共九十七页哦示差折光检测器示差折光检测器原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。第二十四页，讲稿共九十七页哦荧光检测器荧光检测器原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。第二十五页，讲稿共九十七页哦电导检测器（电导检测器（conductivitydetector,CD）原理：基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导池是其核心。电导池的结构：检测体积可达到微升甚至纳升级。基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。第二十六页，讲稿共九十七页哦蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管、激光光源和光检测器等部件构成。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。第二十七页，讲稿共九十七页哦第二十八页，讲稿共九十七页哦三、三、影响分离的因素影响分离的因素 在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即：H=A+C u 故高效液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。第二十九页，讲稿共九十七页哦1.影响分离的因素影响分离的因素流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。第三十页，讲稿共九十七页哦2.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。第三十一页，讲稿共九十七页哦液相色谱流动相液相色谱流动相（1 1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。）能溶解样品，但不能与样品发生反应。）能溶解样品，但不能与样品发生反应。）能溶解样品，但不能与样品发生反应。（2 2）与固定相不互溶，而使柱效下降或损坏柱子。也不发生不可）与固定相不互溶，而使柱效下降或损坏柱子。也不发生不可）与固定相不互溶，而使柱效下降或损坏柱子。也不发生不可）与固定相不互溶，而使柱效下降或损坏柱子。也不发生不可逆反应。逆反应。逆反应。逆反应。（3 3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效（）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效（）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效（）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效（4 4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。要不吸收紫外光。要不吸收紫外光。要不吸收紫外光。（5 5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。等。等。等。第三十二页，讲稿共九十七页哦3.流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1）可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得得特特别别重重要要。液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗脱剂。洗脱剂。（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的的出出峰顺序相反。峰顺序相反。第三十三页，讲稿共九十七页哦流动相组成流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相相的的极极性性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第三十四页，讲稿共九十七页哦20-3 液固色谱法液固色谱法 液液-固固色谱的固定相是固体吸附剂。吸色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，存在一附剂是一些多孔的固体颗粒物质，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异来进行分离的，故也称附能力的差异来进行分离的，故也称液固液固吸附色谱吸附色谱。第三十五页，讲稿共九十七页哦吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短第三十六页，讲稿共九十七页哦 吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。洗脱次序一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相非极性有机溶剂，如己烷常用固定相硅胶、氧化铝。第三十七页，讲稿共九十七页哦二、二、LSC固定相固定相 液固吸附色谱法采用的固体吸附剂按其性质可液固吸附色谱法采用的固体吸附剂按其性质可液固吸附色谱法采用的固体吸附剂按其性质可液固吸附色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。分为极性和非极性两种类型。分为极性和非极性两种类型。分为极性和非极性两种类型。非极性吸附剂非极性吸附剂最常最常最常最常见的是活性炭。见的是活性炭。见的是活性炭。见的是活性炭。极性吸附剂极性吸附剂极性吸附剂极性吸附剂包括硅胶、氧化铝包括硅胶、氧化铝等。等。极性吸附剂可进一步分为极性吸附剂可进一步分为极性吸附剂可进一步分为极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂酸性吸附剂和和和和碱性碱性吸附剂吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶等，碱性吸附剂有。酸性吸附剂包括硅胶等，碱性吸附剂有。酸性吸附剂包括硅胶等，碱性吸附剂有。酸性吸附剂包括硅胶等，碱性吸附剂有氧化铝等。酸性吸附剂适于分离碱，如芳香胺。碱氧化铝等。酸性吸附剂适于分离碱，如芳香胺。碱氧化铝等。酸性吸附剂适于分离碱，如芳香胺。碱氧化铝等。酸性吸附剂适于分离碱，如芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、和吡咯衍生性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、和吡咯衍生性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、和吡咯衍生性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、和吡咯衍生物等。物等。物等。物等。第三十八页，讲稿共九十七页哦流动相的选择流动相的选择 在液一固色谱中，选择流动相的基本原则是极性在液一固色谱中，选择流动相的基本原则是极性在液一固色谱中，选择流动相的基本原则是极性在液一固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。性流动相。性流动相。性流动相。第三十九页，讲稿共九十七页哦应用由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定几何规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离 第四十页，讲稿共九十七页哦1 1、脲和氨基甲酸酯的分离、脲和氨基甲酸酯的分离、脲和氨基甲酸酯的分离、脲和氨基甲酸酯的分离 硝基苯胺异构体的硝基苯胺异构体的硝基苯胺异构体的硝基苯胺异构体的分离分离分离分离第四十一页，讲稿共九十七页哦20-4 液液色谱法液液色谱法一、分离原理一、分离原理二、固定相二、固定相三、流动相三、流动相四、应用实例四、应用实例第四十二页，讲稿共九十七页哦分配色谱的分离机理基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式第四十三页，讲稿共九十七页哦分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相第四十四页，讲稿共九十七页哦流动相流动相 在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小。因此，固定液和流动相的固定相的溶解度尽可能小。因此，固定液和流动相的固定相的溶解度尽可能小。因此，固定液和流动相的固定相的溶解度尽可能小。因此，固定液和流动相的性质往往处于两个极端。以极性物质作固定相，非极性质往往处于两个极端。以极性物质作固定相，非极性质往往处于两个极端。以极性物质作固定相，非极性质往往处于两个极端。以极性物质作固定相，非极性溶剂作流动相的液液分配色谱，被称为正相分配色性溶剂作流动相的液液分配色谱，被称为正相分配色性溶剂作流动相的液液分配色谱，被称为正相分配色性溶剂作流动相的液液分配色谱，被称为正相分配色谱，适合于分离极性化合物；选用非极性物质为固定谱，适合于分离极性化合物；选用非极性物质为固定谱，适合于分离极性化合物；选用非极性物质为固定谱，适合于分离极性化合物；选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液一液色谱称为反相分配相，而极性溶剂为流动相的液一液色谱称为反相分配相，而极性溶剂为流动相的液一液色谱称为反相分配相，而极性溶剂为流动相的液一液色谱称为反相分配色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃，稠环芳烃及烷色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃，稠环芳烃及烷色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃，稠环芳烃及烷色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃，稠环芳烃及烷烃等化合物。烃等化合物。烃等化合物。烃等化合物。第四十五页，讲稿共九十七页哦四、应用实例四、应用实例用反相用反相LLC分离各稠环芳烃分离各稠环芳烃第四十六页，讲稿共九十七页哦20-5 化学键合相色谱法化学键合相色谱法 化学键合相色谱指在化学键合固定相上进行物质化学键合相色谱指在化学键合固定相上进行物质化学键合相色谱指在化学键合固定相上进行物质化学键合相色谱指在化学键合固定相上进行物质分离的一种液体色谱方法。分离的一种液体色谱方法。分离的一种液体色谱方法。分离的一种液体色谱方法。根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为合相色谱分为合相色谱分为合相色谱分为极性键合相色谱极性键合相色谱和和非极性键合相色谱非极性键合相色谱非极性键合相色谱非极性键合相色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。第四十七页，讲稿共九十七页哦键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同第四十八页，讲稿共九十七页哦一、化学键合固定相法一、化学键合固定相法 化学健合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔化学健合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔化学健合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔化学健合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为下列四种键型。学键合固定相。键合相可分为下列四种键型。学键合固定相。键合相可分为下列四种键型。学键合固定相。键合相可分为下列四种键型。1 1、硅酸酯型、硅酸酯型、硅酸酯型、硅酸酯型 2 2、硅氮型、硅氮型、硅氮型、硅氮型 3 3、硅碳型、硅碳型、硅碳型、硅碳型 4 4、硅氧烷型、硅氧烷型、硅氧烷型、硅氧烷型第四十九页，讲稿共九十七页哦二、反相键合相色谱法二、反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，用强极性的溶剂为流动相。合固定相，用强极性的溶剂为流动相。目前，对于反相色谱的保留机制还没有目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于于分配色谱分配色谱，另一种认为属于，另一种认为属于吸附色谱吸附色谱。第五十页，讲稿共九十七页哦分离机制分离机制疏溶剂理论疏溶剂理论第五十一页，讲稿共九十七页哦三、正相键合相色谱法三、正相键合相色谱法 此此此此法法法法是是是是以以以以极极极极性性性性的的的的有有有有机机机机基基基基团团团团键键键键合合合合在在在在硅硅硅硅胶胶胶胶表表表表面面面面，作作作作为为为为固固固固定定定定相相相相；而而而而以以以以非非非非极极极极性性性性或或或或极极极极性性性性小小小小的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂中中中中加加加加入入入入适适适适量量量量的的的的极极极极性性性性溶溶溶溶剂剂剂剂为为为为流流流流动动动动相相相相，分分分分离离离离极极极极性性性性化化化化合合合合物物物物。此此此此时时时时，组组组组分分分分的的的的分分分分配配配配比比比比k值值值值随随随随其其其其极极极极性性性性的的的的增增增增加加加加而而而而增增增增大大大大，但但随随流流动动相相极极性的增加而降低性的增加而降低。其其代代表表性性的的固固定定相相是是改改性性硅硅胶胶、氰氰基基柱柱等等，代代表表性性的流动相是正己烷的流动相是正己烷 这这这这种种种种色色色色谱谱谱谱方方方方法法法法主主主主要要要要用用用用于于于于分分分分离离离离异异异异构构构构体体体体、极极极极性性性性不不不不同同同同的的的的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。第五十二页，讲稿共九十七页哦反相HPLC由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。第五十三页，讲稿共九十七页哦化学键合相色谱法的优点化学键合相色谱法的优点（1）适用于分离几乎所有类型的化合物）适用于分离几乎所有类型的化合物（2）特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离）特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件创造了条件（3）有很好的化学稳定性和热稳定性）有很好的化学稳定性和热稳定性（4）柱效高，使用周期长，分析重现性好）柱效高，使用周期长，分析重现性好第五十四页，讲稿共九十七页哦20-6 离子交换色谱法离子交换色谱法一、分离原理一、分离原理二、固定相二、固定相三、流动相三、流动相四、应用四、应用第五十五页，讲稿共九十七页哦应用应用 此法是利用此法是利用此法是利用此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结离子交换原理和液相色谱技术的结离子交换原理和液相色谱技术的结离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法法法法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。围较广。第五十六页，讲稿共九十七页哦分离原理分离原理 离离离离子子子子交交交交换换换换色色色色谱谱谱谱法法法法是是是是利利利利用用用用不不不不同同同同待待待待测测测测离离离离子子子子对对对对固固固固定定定定相相相相亲亲亲亲和和和和力力力力的的的的差差差差别别别别来来来来实实实实现现现现分分分分离离离离的的的的。其其固固定定相相采采用用离离子子交交换换树树脂脂，树树脂脂上上分分布布有有固固定定的的带带电电荷荷基基团团和和可可游游离离的的平平衡衡离离子子。当当待待分分析析物物质质电电离离后后产产生生的的离离子子可可与与树树脂脂上上可可游游离离的的平平衡衡离离子子进进行行可逆交换。可逆交换。第五十七页，讲稿共九十七页哦离子交换树脂的分离机理第五十八页，讲稿共九十七页哦离子交换色谱概述适用于离子型化合物的分离分离基于离子的带电特性洗脱次序受多种因素的影响填料（离子交换树脂）的种类阴/阳，强/弱，交换基团样品分子特性盐的种类、浓度温度及pH值有机溶剂第五十九页，讲稿共九十七页哦二、固定相二、固定相第六十页，讲稿共九十七页哦三、流动相三、流动相 离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。解度。解度。解度。离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合物配制：钠、钾的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其物配制：钠、钾的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其物配制：钠、钾的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其物配制：钠、钾的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性缓冲液等。缓冲液等。缓冲液等。缓冲液等。第六十一页，讲稿共九十七页哦离子对色谱无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱进行分离。有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采用通常用于中性有机化合物分离的反相（或正相）色谱。然而，直接采用正相或反相色谱又存在困难，因为大多数可离解的有机化合物在正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保留值太大、出现拖尾峰，有时甚至不能被洗脱。在反相色谱的非极性（或弱极性）固定相中的保留又太小。在这种情况下，就可采用离子对色谱。第六十二页，讲稿共九十七页哦离子对色谱在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即离子对试剂，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。保留的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相色谱效果好，多数情况下采用反相色谱模式，所以离子对色谱也常称反相离子对色谱。第六十三页，讲稿共九十七页哦20-7 排阻色谱法排阻色谱法一、分离原理一、分离原理二、排阻色谱的填料和流动相二、排阻色谱的填料和流动相三、应用三、应用第六十四页，讲稿共九十七页哦一、分离原理一、分离原理 排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质法。其固定相为化学情性多孔物质法。其固定相为化学情性多孔物质法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似凝胶，它类似凝胶，它类似凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，小的孔穴，小的孔穴，小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样这样，样这样，样这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。第六十五页，讲稿共九十七页哦分离原理分离原理第六十六页，讲稿共九十七页哦固定相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。流动相：在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。第六十七页，讲稿共九十七页哦凝胶过滤色谱：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。第六十八页，讲稿共九十七页哦二、排阻色谱的填料和流动相二、排阻色谱的填料和流动相第六十九页，讲稿共九十七页哦三、应用三、应用 排阻色谱主要被用于分离大分子物质，其分排阻色谱主要被用于分离大分子物质，其分排阻色谱主要被用于分离大分子物质，其分排阻色谱主要被用于分离大分子物质，其分离范围从相对分子质量离范围从相对分子质量离范围从相对分子质量离范围从相对分子质量2000200020000002000000之间，这之间，这些物质大多是生物化学物质和聚合物等。此外，些物质大多是生物化学物质和聚合物等。此外，排阻色谱越来越多的应用是通过测量相对分子排阻色谱越来越多的应用是通过测量相对分子质量分布来鉴定高聚物及研究高聚物聚合机理、质量分布来鉴定高聚物及研究高聚物聚合机理、聚合工艺、条件等。聚合工艺、条件等。第七十页，讲稿共九十七页哦14-8 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择第七十一页，讲稿共九十七页哦液相色谱的方法开发第七十二页，讲稿共九十七页哦第一步干什么?想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献，如CA(化学文摘)对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品第七十三页，讲稿共九十七页哦分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精密度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?第七十四页，讲稿