实验一细菌基本检验技术一.pptx

实验一细菌基本检验技术一现在学习的是第1页，共34页一、一、常用消毒灭菌方法介绍常用消毒灭菌方法介绍消毒与灭菌的方法消毒与灭菌的方法 加热 物理方法 过滤 照射 化学方法一）一）加热法加热法 加热法又分干热干热灭菌和湿热湿热灭菌两类。现在学习的是第2页，共34页1、干热灭菌干热灭菌 火焰烧灼灭菌 热空气灭菌 160-170 2小时 适用于玻璃器皿如吸管和 培养皿等的灭菌2、湿热灭菌湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法 煮沸消毒法现在学习的是第3页，共34页高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法1.05kgcm2(15磅/英寸2)，121.3保持15-30分钟；0.7kgcm2(10磅/英寸2)，115.6保持20-30分钟；适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌；指示菌：菌种采用USP（美国药典）31版和ISO11138（国际标准组织）指定的嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC 7953），本菌芽孢对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽孢相似。现在学习的是第4页，共34页间歇灭菌法间歇灭菌法阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌；10030分钟 室温下18-24小时 10030分钟 室温下18-24小时 10030分钟；有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。煮沸消毒法煮沸消毒法煮沸消毒时间为10-15分钟；注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。现在学习的是第5页，共34页二）过滤灭菌过滤灭菌 蔡氏(Seitz)过滤器 膜过滤器：多孔纤维素(乙酸纤维素或 硝酸纤维素)，孔径一般为 0.45m/0.22m许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。现在学习的是第6页，共34页三）紫外线灭菌紫外线灭菌（照射）（照射）紫外线波长在200-300nm，具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强；照射剂量(J/m2)=照射时间（s）UVC照射强度（w/m2）；适应于室内空气、物体表面和水及其它液体的消毒。现在学习的是第7页，共34页四）化学方法四）化学方法 常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表类 别实 例常用浓度应用范围醇 类乙 醇50-70%皮肤及器械消毒酸 类 乳 酸0.33-lmol/L空气消毒(喷雾或熏蒸)食 醋3-5m1/m3 熏蒸消毒空气，可预防流感病毒碱 类石灰水1-3%地面消毒酚 类石炭酸5%空气消毒(喷雾)来苏尔2-5%空气消毒、皮肤消毒醛 类福尔马林40%溶液2-6ml/m3 接种室、接种箱或厂房熏蒸消毒重金属离子升 汞0.1%植物组织(如根瘤)表面消毒硝酸银0.1-1%皮肤消毒氧化剂高锰酸钾0.1-3%皮肤、水果、茶杯消毒过氧化氢3%清洗伤口氯 气0.2-1ppm 饮用水清洁消毒漂白粉l-5%洗刷培养基、饮水及粪便消毒去污剂新洁尔灭水稀释20倍 皮肤，不能遇热的器皿消毒染 料 结晶紫2-4%外用紫药水，浅创伤口消毒金属螯合剂8-羟奎啉硫酸盐 0.1-0.2%外用、清洗消毒现在学习的是第8页，共34页二、二、微生物实验中常用器材的准微生物实验中常用器材的准备备实验目的：实验目的：熟悉微生物实验中常用器材；了解各种器材在使用前的准备及清洁工作。实验内容：实验内容：玻璃器皿的清洁法玻璃器皿的清洁法1、新玻璃器皿：、新玻璃器皿：因含有游离碱，应先在清洁液或2%盐酸内浸泡数小时，再用自来水清洗干净。现在学习的是第9页，共34页2、用过的玻璃器材：用过的玻璃器材：凡培养了细菌或污染有活菌的玻璃器皿，均可直接投入5碳酸氢钠水锅中煮沸30分钟，趁热倒出器皿内的内容物，再用热肥皂水洗刷，最后用自来水冲洗干净。沾有凡士林或石蜡的器皿，应单独高压灭菌，然后趁热倒出内容物，将试管等倒立于吸水纸上置100烤箱内半小时，吸出油污，再放入5碳酸氢钠水中煮两次，然后用肥皂水洗刷干净，凉干或烤干备用。现在学习的是第10页，共34页染有活菌的吸管应投入3来苏液内浸泡30分钟，再用肥皂水洗涤一次，最后用自来水冲洗干净。染有活菌的玻片，可浸入3来苏液或清洁液中过夜，取出后水洗。细菌染色之载玻片放入5肥皂水中煮沸10分钟，刷洗干净，再清水冲洗，最后浸入95酒精中片刻，取出软布擦干备用。现在学习的是第11页，共34页玻璃器皿的包扎和灭菌玻璃器皿的包扎和灭菌培养皿（简称平皿）培养皿（简称平皿）：包扎：培养皿由盖皿和底皿组成，先将盖皿和底皿套合后，数个（10个或15个或随意性）一叠用纸包裹或装在金属的平皿框架内。灭菌：160干热灭菌2小时或高压蒸汽灭菌15磅/寸2灭菌20分钟，再置烤箱内烤干备用。现在学习的是第12页，共34页试管：试管：包扎：培养用的试管，其管口必须用棉塞塞紧。棉塞制作法：取大小合适的棉花块（视管口口径大小而定），松松地卷成圆筒，将两端毛边略向内折入，再逢腰折转，在折端套一大小合适的纱布块，塞入试管口内，纱布的散端可用线扎紧，剪去须尾。棉塞的要求：、要有适当的长度，2/3塞入试管内，1/3露于管口外；、大小适宜，应手持棉塞外露部分时试管不掉离棉塞，同时又能轻轻拔出（过松达不到滤菌的目的，过紧妨碍空气流通）；现在学习的是第13页，共34页吸管及毛细吸管：吸管及毛细吸管：包扎：包扎：（管口要求塞棉花）以拇、食指持一端拉直的回形针，并以食指夹取少许棉花（根据吸管孔径大小确定棉花多少），轻轻从管口端塞入1.52cm，抽出回形针。塞入的棉花松紧必须适中，过松时使用中棉花容易脱落，过紧时吹吸时流速太慢，管口露出的棉花纤维可在酒精灯火焰上烧去。管口塞好棉花后将吸管尖斜置于一条约440cm左右的纸条上，离终端4cm，将纸条包住吸管的尖端向前稍微滚动，使将管尖包裹，再将纸条末端折叠包严吸管尖端，将吸管继续滚动至纸将吸管全部包严。现在学习的是第14页，共34页烧瓶：烧瓶：包扎：按瓶口大小，用上述方法制成棉塞塞入瓶口，再在棉塞外包以厚纸，用纱绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外界细菌污染。现在学习的是第15页，共34页棉签（棉拭）：棉签（棉拭）：棉签制作：取稍许脱脂棉，做成一定形状置于左手中指上，用一竹签自前向后卷入少许棉花，然后将竹签前端棉花折入，再继续滚动棉签（滚动过程中以食指抵住竹签前端）直至将所取棉花全部卷紧即成。包扎：取1520根棉签，用纸包好或插入试管内，塞好棉塞，灭菌备用。现在学习的是第16页，共34页三、三、常用培养基的制备常用培养基的制备实验目的：实验目的：了解细菌培养基的制备原则和基本程序，熟悉常用培养基的种类与名称。熟悉葡萄糖发酵管、肉汤、普通琼脂培养基等的配制现在学习的是第17页，共34页培养基配制的基本程序培养基配制的基本程序称量（按一定配方称量各种物质）溶解测定及调整PH滤过分装灭菌、备用。现在学习的是第18页，共34页四、四、细菌的接种培养与生长现象观察细菌的接种培养与生长现象观察实验目的：实验目的：初步掌握细菌接种的无菌操作技术要领；学会常用的几种接种细菌的方法；学会观察和描述细菌在不同培养基中的生长情况。现在学习的是第19页，共34页实验材料：实验材料：菌种：金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的24h斜面培养物培养基：普通琼脂平板、肉膏汤、半固体培养基及普通琼脂斜面培养基其它：接种环、接种针、特种蜡笔、酒精灯、37恒温培养箱等现在学习的是第20页，共34页实验方法：实验方法：细菌接种与培养方法1、液体培养基（肉汤）的接种方法液体培养基（肉汤）的接种方法：主要用于增菌培养及检测细菌的生化反应左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的培养基管使菌种管在外，培养基管位里。右手拇、食指先转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。右手持接种环，烧灼灭菌，柄部也要迅速通过火焰23次杀灭表面的杂菌，灭菌后拿在手中，勿与其它物接触。现在学习的是第21页，共34页以右手无名指与小指拔取菌种管棉塞，再用手掌与小指拔取待接种管，随后将两管管口迅速通过火焰灭菌。用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取不许菌苔，退出管后再伸入肉汤管中，在接近液面与管壁处轻轻研磨（图1）并沾取少许肉汤调和，使菌混于肉汤中。接种毕，接种环灭菌后放下。分别塞好棉塞，立于试管架上，37孵育1824小时，观察生长情况。现在学习的是第22页，共34页图1 液体培养基接种法现在学习的是第23页，共34页2、半固体培养基接种法半固体培养基接种法：只能用接种针接种，主要用于细菌动力观察，保存菌种左手握持菌种管及待接种管（方法同前）右手持接种针火焰灭菌，挑取少许菌苔，于待接种培养基中心垂直插入（图2）近管底处，然后转动接种针原路退出；接种毕，接种针灭菌后放下，分别塞好棉塞。37孵育1824小时，观察有无细菌生长，细菌有无动力。现在学习的是第24页，共34页图2 半固体培养基接种方法现在学习的是第25页，共34页3、斜面培养基接种方法：、斜面培养基接种方法：主要用于纯培养和细菌菌种保存如液体培养基接种法，左手握持菌种管及待接种管。用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取不许菌苔，退出管后再伸入待接种管，自斜面底部轻轻向上部蜿蜒划线或自斜面底部轻轻向上部划一直线，再回到斜面底部向上部蜿蜒划线（勿触破培养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及度管内避）。接种毕，接种环火焰灭菌后放下。两管口迅速通过火焰23次灭菌，先将指掌间棉塞塞入接菌管内，后将无名指、小指间棉塞塞入菌种管上，将管放回原处。37孵育1824小时，观察生长情况。现在学习的是第26页，共34页 图3 斜面培养基接种法现在学习的是第27页，共34页4、琼脂平板接种方法：、琼脂平板接种方法：只能用接种环接种连续划线法连续划线法右手持接种环在火焰上灭菌待冷（约25秒钟）取稍许菌种。左手抓握平板培养基，微开皿盖，接种环与培养基表面成45度角，在平板一侧边缘反复来回划线（此称原划线），然后运用腕力向两侧作“Z”形划线，划线向下延伸，直至划完整个平板（注意划线不能接触平皿边缘，要匀直，不划烂培养基，要充分利用平板）现在学习的是第28页，共34页 图4平板连续划线法 图5培养后菌落的分布情况现在学习的是第29页，共34页分区划线法分区划线法 用接种环取菌做原划线后先在平板1/4面积处划线，再把平板旋转一定角度，将接种环在火焰上灭菌，冷却后做第二区划线，起始每条划线都与第一区划线相交，相交数次后划线不必再相交接，待第二区划线完时，灭菌接种环，按上法划第三区、第四区划线。现在学习的是第30页，共34页图6平板分区划线法 图7培养后菌落的分布情况现在学习的是第31页，共34页细菌的生长现象观察细菌的生长现象观察1、液体培养基中生长现象观察：液体培养基中生长现象观察：培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种细菌后，由于细菌种类不同，可有以下三种生长形式。混浊：液体变为混浊。菌膜：液体澄清，表面有一薄膜。沉淀：管底有沉淀物，液体澄清。现在学习的是第32页，共34页2、半固体中生长现象观察：半固体中生长现象观察：无鞭毛（无运动）的细菌：经培养后仅沿穿刺线生长，培养基清亮。有鞭毛（有运动）的细菌：沿穿刺线向外扩散，穿刺线摸糊不清，培养基混浊。3、斜面上生长现象观察斜面上生长现象观察：可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落或菌苔出现，则表明污染了杂菌。现在学习的是第33页，共34页4、琼脂平板上菌落观察：、琼脂平板上菌落观察：菌落菌落：一个细菌在固体培养基上，经过一定时间的生长繁殖之后，所形成的肉眼可见的细菌集团。菌苔菌苔：很多菌落连在一起，融成一片。由于细菌种类不同，以及培养基的成分不同，形成的菌落的特点也不同，可呈现一定的形态、色泽等，有助于鉴别细菌。因此，应当对菌落进行认真观察。其观察要点如下：现在学习的是第34页，共34页