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关于基因重组与基因工程现在学习的是第1页，共49页第二节 工具酶第三节 自然界的基因转移和重组第一节 概述第四节 基因载体第五节 目的基因第六节 重组DNA技术的基本过程第七节 基因工程在医学上的应用第第十十五五章章基基因因重重组组与与基基因因工工程程现在学习的是第2页，共49页分子克隆：在体外对分子克隆：在体外对DNA分子按照既定的目地分子按照既定的目地和方案进行人工重组，将重组和方案进行人工重组，将重组DNA分子导入合适分子导入合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增繁殖，以获得的受体细胞中，使其在细胞中扩增繁殖，以获得目地目地DNA分子的大量拷贝，并使受体细胞获得分子的大量拷贝，并使受体细胞获得新的遗传性状的过程。新的遗传性状的过程。基因工程：利用分子克隆技术操作目地基因，并改基因工程：利用分子克隆技术操作目地基因，并改变生物遗传性状的过程，即采用类似工程技术的方变生物遗传性状的过程，即采用类似工程技术的方法，在体外进行基因重组，使重组基因在适当的宿法，在体外进行基因重组，使重组基因在适当的宿主细胞中得到表达。主细胞中得到表达。第一节第一节 概述概述 结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第3页，共49页第第二节二节 工具工具酶酶 指指能用于能用于DNADNA和和RNARNA分子分子的的切割、连接、聚合、反转录等切割、连接、聚合、反转录等基因操作基因操作有关的各种酶有关的各种酶系，系，统统称为工具酶称为工具酶。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第4页，共49页结束放映结束放映返回目录返回目录常常 用用 的的 工工 具具 酶酶(接下表)DNA连接酶连接酶连接连接双链双链DNA分子分子中的中的单链切口单链切口形成磷形成磷酸二酯键酸二酯键工具工具 酶名称酶名称 主主 要要 功功 能能DNA聚合酶聚合酶I53DNA聚合酶活性聚合酶活性限制性核酸限制性核酸识别双链识别双链DNA的特异序列，切割的特异序列，切割DNA53外切酶活性外切酶活性35 35 外切酶活性外切酶活性内切酶内切酶现在学习的是第5页，共49页常常 用用 的的 工工 具具 酶酶 工具工具 酶名称酶名称 主主 要要 功功 能能在在3-OH末端进行同一多聚物加尾末端进行同一多聚物加尾反转录酶反转录酶DNA末端转末端转移酶移酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶去除去除DNA、RNA、dNTP的的5磷酸基团磷酸基团结束放映结束放映返回目录返回目录以以RNA或或DNA链为模板合成互补的链为模板合成互补的cDNA链链，水解杂化双链中的水解杂化双链中的RNATaq DNA 聚聚合酶合酶能在高温（能在高温（72）下）下，以，以单链单链DNA为模板，为模板，从从53方向合成新生的互补方向合成新生的互补DNA链链现在学习的是第6页，共49页 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶按限制性核酸内切酶的分解模式，分为三类按限制性核酸内切酶的分解模式，分为三类类型类型I I 有识别位点有识别位点,切割长短不一且无特异性切割长短不一且无特异性类型类型II II 具有识别和具有识别和切割的特异性，切割后产切割的特异性，切割后产 生粘性末端或平头末端生粘性末端或平头末端类型类型IIIIII 界于界于I I和和IIII之间之间1 1、限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第7页，共49页 均能严格地识别特定核苷酸的序列（均能严格地识别特定核苷酸的序列（4 4 8 8个碱基对个碱基对 ）。）。大多数识别位点具有大多数识别位点具有180180度旋转对称的度旋转对称的 结构形式（回文结构）。结构形式（回文结构）。能在能在识别的核苷酸序列当中或附近切割识别的核苷酸序列当中或附近切割 双链双链DNADNA。2 2、IIII型酶识别序列特点：型酶识别序列特点：结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第8页，共49页3 3、IIII型限制性内切酶的切割方式型限制性内切酶的切割方式三种切割方式三种切割方式 一种是在对称轴一种是在对称轴5 5 侧切割产生侧切割产生55粘端，粘端，EcoRI 5-N GAATTC N-3 5-NG AATTGN-3 结束放映结束放映返回目录返回目录 3-N CTTAAG N-53-NCTTAACN-5 5粘性末端粘性末端GAATTCCTTAAG现在学习的是第9页，共49页结束放映结束放映返回目录返回目录另一种是在对称轴的另一种是在对称轴的33侧切割产生侧切割产生33粘端，粘端，PstI5-N CTGCAG N-33-N GACGTC N-5CTGCAGGACGTC5-N CTGCA3-N GCTGCAGG N-3ACGTC N-5GACGTC3-粘性末端粘性末端现在学习的是第10页，共49页第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末端端 SmaI5-N CCC GGG N-33-N GGG CCC N-5CCC GGGGGG CCC5-N CCC3-N GGGCCCGGGGGG N-3CCC N-5GGGCCC平头末端平头末端结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第11页，共49页4 4、某些、某些限制性内切酶的识别切割序列限制性内切酶的识别切割序列结束放映结束放映返回目录返回目录Hind NotPst Pvu TthBamHCla EcoREcoRHae5-GGATCC-3 5-ATCGAT-3 5-GAATTC-3 5-GATATC-3 5-GGCC-3 5-AAGCTT-3 5-GCGGCCGC-3 5-CTGCAG-3 5-CAGCTG-3 5-GACNNNGTC-3 现在学习的是第12页，共49页 DNA DNA连接酶连接酶 连接连接双链双链DNADNA分子分子中的中的单链切口单链切口,形成磷形成磷酸二酯键酸二酯键 主要应用：主要应用：DNADNA片段粘性末端连接。片段粘性末端连接。DNADNA片段平片段平头末端连接（效率低头末端连接（效率低100-200100-200倍）倍）结束放映结束放映返回目录返回目录OHOH55553333P P连接酶连接酶55553333现在学习的是第13页，共49页 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶能催化能催化dNTPdNTP依次聚合到依次聚合到DNADNA的的33末端。末端。以以33端突出的端突出的DNADNA末端最好。末端最好。主要主要应用：给目的应用：给目的DNADNA、cDNAcDNA和载体和载体加上互补的多聚脱氧核苷酸尾巴加上互补的多聚脱氧核苷酸尾巴 (人工粘性末端人工粘性末端)。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第14页，共49页结束放映结束放映返回目录返回目录5 53 33 35 55 55 53 33 3载体载体DNA+dGTPDNA+dGTP目的目的DNA+dCTPDNA+dCTP末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶33333333PolyGPolyGPolyGPolyGPolyCPolyCPolyCPolyCPolyGPolyGPolyCPolyC同聚物加尾连接法同聚物加尾连接法现在学习的是第15页，共49页 逆转录酶逆转录酶以以mRNAmRNA为模板，利用逆转录酶催化合为模板，利用逆转录酶催化合成与成与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA。合成的产物称。合成的产物称cDNA(complementary DNA)cDNA(complementary DNA)主要应用：逆转录合成主要应用：逆转录合成cDNAcDNA及及DNADNA探针，探针，补平和标记粘性末端。补平和标记粘性末端。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第16页，共49页mRNAmRNA33AAAAAAAAAAAA55TTTTTTTTTTTT55逆转录酶逆转录酶4 4种种dNTPdNTPRNA-DNARNA-DNAAAAAAAAAAAAA553333TTTTTTTTTTTT55结束放映结束放映返回目录返回目录RNA-DNARNA-DNA杂交体的生成杂交体的生成现在学习的是第17页，共49页 DNADNA聚合酶聚合酶I I 主要主要应用：应用：DNADNA序列分析、催化序列分析、催化DNADNA切口平移制备探针、切口平移制备探针、DNA 3DNA 3端端标记、标记、cDNAcDNA第二链的合成。第二链的合成。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第18页，共49页第三节第三节 自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组-细菌中遗传物质的几种转移形式细菌中遗传物质的几种转移形式:接合转化转导转座结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第19页，共49页接合接合染色体染色体DNADNAF F因子因子转移转移细菌接合：指通过细菌鞭毛的直接接触，细菌接合：指通过细菌鞭毛的直接接触，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。的过程。1、接合作用、接合作用结束放映结束放映返回目录返回目录供体细胞供体细胞受体细胞受体细胞现在学习的是第20页，共49页2 2、转化作用、转化作用转化：自动的获取或人为的供给外源转化：自动的获取或人为的供给外源DNADNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。细胞溶解细胞溶解新细菌摄取新细菌摄取DNADNA重组重组图图 15-2 15-2 转化作用转化作用结束放映结束放映返回目录返回目录供体细胞供体细胞受体细胞受体细胞现在学习的是第21页，共49页3、转导作用、转导作用转导：通过病毒或噬菌体介导发生在供体细胞与转导：通过病毒或噬菌体介导发生在供体细胞与受体细胞之间的受体细胞之间的DNADNA转移及基因重组。转移及基因重组。溶溶 菌菌感感 染染重重 组组感感 染染细细 菌菌噬菌体噬菌体结束放映结束放映返回目录返回目录供体细胞供体细胞受体细胞受体细胞现在学习的是第22页，共49页4、转座、转座转座：由插入序列和转座子介转座：由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。导的基因转移或重排。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第23页，共49页第四节第四节 基因载体基因载体一、载体的概念一、载体的概念 携带和运载目的携带和运载目的DNADNA进入宿主细胞进入宿主细胞的一些的一些DNADNA分子分子,它可以使目的它可以使目的DNADNA随随着宿主细胞的增殖而无性繁殖或着宿主细胞的增殖而无性繁殖或/和和在宿主细胞中表达目的在宿主细胞中表达目的DNADNA。可分为克隆载体和表达载体。可分为克隆载体和表达载体。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第24页，共49页 作为载体的作为载体的DNADNA分子有质粒分子有质粒DNADNA，噬，噬菌体菌体DNADNA和病毒和病毒DNADNA等。它们经人为改造等。它们经人为改造后在宿主细胞中只具有自我复制能力的后在宿主细胞中只具有自我复制能力的DNADNA为克隆载体；能使插入的目的为克隆载体；能使插入的目的DNADNA无无性繁殖，并使其在宿主细胞中表达而特性繁殖，并使其在宿主细胞中表达而特意设计的意设计的DNADNA为表达载体。为表达载体。结束放映结束放映返回目录返回目录二、载体的种类二、载体的种类现在学习的是第25页，共49页 质粒：质粒：是是存在于细菌染色体外小存在于细菌染色体外小型双链环状型双链环状DNADNA，能在宿主细胞中，能在宿主细胞中独立地复制，并在细胞分裂时传递独立地复制，并在细胞分裂时传递给子代细胞，其给子代细胞，其DNADNA分子上的基因分子上的基因对宿主细胞的代谢活动和抗药性对宿主细胞的代谢活动和抗药性的表型均有一定的作用的表型均有一定的作用。可赋予细可赋予细菌特定的表型，如抗生素抗性，菌特定的表型，如抗生素抗性，是是筛选转化子细菌的遗传标志。筛选转化子细菌的遗传标志。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第26页，共49页pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmal XmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllac Zori0447Amlll 806Ppai 1765Ctr10i1 1779Gsul 1784Scal 2177Xmnl 2294Sspl 2501Aatll 26117EcoO 1092674Ndel 183Narl 235Plac质粒质粒 pUC19pUC19结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第27页，共49页三、载体的特点三、载体的特点1 1、载体必须是复制子，在宿主、载体必须是复制子，在宿主 细胞中能大量复制。细胞中能大量复制。2 2、同一限制性核酸内切酶在载、同一限制性核酸内切酶在载 体上只有单一酶切位点。体上只有单一酶切位点。3 3、具有选择性遗传标志。、具有选择性遗传标志。现在学习的是第28页，共49页 一、概念 为基础研究和应用研究的需要而分离获得的某一感兴趣的基因（DNA序列），或者是为得到某一感兴趣的蛋白质或RNA所对应的DNA序列。有两种类型，既cDNA和基因组DNA。二、目的基因的获取（见后）第五节 目的基因结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第29页，共49页第六节第六节 重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程制备目的基因和相关载体。制备目的基因和相关载体。将目的基因和载体进行体外连接。将目的基因和载体进行体外连接。将重组的载体将重组的载体DNADNA导入宿主细胞。导入宿主细胞。DNADNA重组体的筛选和鉴定。重组体的筛选和鉴定。DNADNA重组体的扩增表达。重组体的扩增表达。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第30页，共49页载载 体体+重组子重组子转化或转染转化或转染目的目的DNA细细 菌菌重组重组DNA增殖增殖筛选含重组质粒的细菌筛选含重组质粒的细菌（以质粒为载体的（以质粒为载体的DNA克隆过程）克隆过程）结束放映结束放映返回目录返回目录阳性克隆的筛选及扩增阳性克隆的筛选及扩增现在学习的是第31页，共49页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、从基因组、从基因组DNADNA中分离获得中分离获得2 2、从基因文库中筛选获得、从基因文库中筛选获得 （基因组文库及（基因组文库及cDNAcDNA文库）文库）3 3、化学合成法、化学合成法4 4、PCRPCR扩增扩增5 5、mRNAmRNA逆转录逆转录结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第32页，共49页1 1、从基因组、从基因组DNADNA文库中筛选获得文库中筛选获得（1 1）基因组基因组DNADNA文库文库：分离组织或分离组织或细胞染色体细胞染色体DNADNA，用限制性核酸内切酶，用限制性核酸内切酶将其切割成许多片段后将它们与克隆将其切割成许多片段后将它们与克隆载体拼接成重组载体拼接成重组DNADNA，将所有的重组，将所有的重组DNADNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称基因组得到分子克隆的混合体称基因组DNADNA文文库。库。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第33页，共49页（2）文库的筛选：n直接选择法：抗药性选择、分子探针、标志补救（如-互补筛选）。免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行的筛选（如酶免检测分析）。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第34页，共49页多克隆位点多克隆位点 启动子启动子裂开的裂开的N N端端裂开的裂开的N N端端外源外源DNADNA 半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端编码序列编码序列染色体染色体重组体重组体pUC18pUC18细菌在含细菌在含X-galX-gal和乳糖操纵子和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养细菌在含细菌在含X-galX-gal和乳糖操纵子和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养诱导剂的琼脂上培养pUC18pUC18含重组体含重组体pUC18pUC18的白色的白色菌落菌落蓝色菌落蓝色菌落含载体含载体pUC18pUC18的的蓝色菌落蓝色菌落b 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端编码序列端编码序列转化转化转化转化 ampr Ampr(利用利用 互补原理筛选重组子互补原理筛选重组子Puc18)Puc18)pUC182686bppUC182686bp结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第35页，共49页蓝白斑筛选重组质粒与蓝白斑筛选重组质粒与PCRPCR鉴定重组质粒鉴定重组质粒结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第36页，共49页硝酸纤维膜硝酸纤维膜菌落菌落琼脂培养板琼脂培养板硝酸纤维膜硝酸纤维膜复制培养复制培养溶菌、中和溶菌、中和蛋白酶处理蛋白酶处理漂洗、烘干漂洗、烘干 1 1、3232P P探针杂交探针杂交 2 2、放射自显影、放射自显影 鉴定克隆鉴定克隆（含感兴趣（含感兴趣DNADNA）原位杂交原位杂交结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第37页，共49页2 2、从、从cDNAcDNA文库中筛选获得文库中筛选获得（1 1）cDNAcDNA文库文库：将总：将总mRNAmRNA逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA，再复制成双链，再复制成双链cDNAcDNA的混合体的混合体并与适当的并与适当的载体进行拼接成重组载体进行拼接成重组DNADNA，使每一个，使每一个cDNAcDNA分子分子只与一个载体分子拼接成重组只与一个载体分子拼接成重组DNADNA。将所有的。将所有的重组重组DNADNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为为cDNAcDNA文库文库（2 2）cDNAcDNA文库的筛选文库的筛选：（见上：（见上）结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第38页，共49页3、化学合成法、化学合成法 用用DNA合成仪合成所需要的目合成仪合成所需要的目的基因片断。的基因片断。结束放映结束放映返回目录返回目录 PCRPCR是一种在体外利用是一种在体外利用DNADNA聚合聚合酶催化反应获得特异序列的基因组酶催化反应获得特异序列的基因组DNADNA或或cDNAcDNA的技术。的技术。（详见后第（详见后第2222章章PCRPCR）4 4、PCRPCR法：法：现在学习的是第39页，共49页二、目的基因与载体的连接二、目的基因与载体的连接粘性末端连接粘性末端连接利用人工接头连接利用人工接头连接加入同聚体尾连接加入同聚体尾连接结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第40页，共49页细菌质粒细菌质粒CCGGGGCCHpaIICGG C C GGCCCGG CCGGGGCC GGCC哺乳动物哺乳动物DNADNA片断片断HpaIICGG C C GGC+混合、混合、DNA连接酶催化连接酶催化细菌质粒与哺乳动细菌质粒与哺乳动物物DNA片断共同构重片断共同构重的重组质粒的重组质粒(同一限制酶切割同一限制酶切割DNA粘性末端的连接粘性末端的连接)CCGGGGCCCCGGGGCC结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第41页，共49页三、重组三、重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞常用的方法有以下几种：常用的方法有以下几种：（一）转化（一）转化（二）感染（二）感染（三）转染（三）转染结束放映结束放映返回目录返回目录 选择适当的宿主细胞，处理选择适当的宿主细胞，处理使之成为感受态细胞，然后导入使之成为感受态细胞，然后导入重组重组DNADNA。现在学习的是第42页，共49页四、目的基因的筛选和鉴定四、目的基因的筛选和鉴定 （见前（见前DNADNA文库的筛选）文库的筛选）结束放映结束放映返回目录返回目录 举例：以质粒举例：以质粒PBR322PBR322为载体的目为载体的目的基因的基因DNADNA克隆过程克隆过程现在学习的是第43页，共49页质粒载体质粒载体PBR322PBR322现在学习的是第44页，共49页pstIpstI限制性内切酶限制性内切酶目的基因目的基因DNADNADNADNA连接酶连接酶转化转化E.coliE.coli细胞细胞宿主宿主r rr r结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第45页，共49页宿主宿主转化转化E.coliE.coli细胞细胞转化细胞的筛选转化细胞的筛选所有的克隆都含质粒所有的克隆都含质粒含四环素的琼脂平板含四环素的琼脂平板转移接种检测克隆转移接种检测克隆含有重组质粒的克隆含有重组质粒的克隆含四环素的琼脂平板（对照）含四环素的琼脂平板（对照）含氨苄青霉素含氨苄青霉素+四环素的琼脂平板四环素的琼脂平板现在学习的是第46页，共49页五、克隆基因的表达五、克隆基因的表达 以上部分内容为基因克隆，采以上部分内容为基因克隆，采用该技术还可进行基因表达以实现用该技术还可进行基因表达以实现研究、医药或商业目的。克隆基因研究、医药或商业目的。克隆基因的表达是指通过将外源目的基因克的表达是指通过将外源目的基因克隆后在宿主细胞中通过正确的转录、隆后在宿主细胞中通过正确的转录、翻译合成相应的蛋白质或翻译合成相应的蛋白质或RNARNA的过程。的过程。表达可以在原核及真核系统中进行。表达可以在原核及真核系统中进行。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第47页，共49页 外源基因在载体上表达必须具备：强的启动外源基因在载体上表达必须具备：强的启动子、核糖体结合位点、翻译起始位点。子、核糖体结合位点、翻译起始位点。1 1、原核表达体系、原核表达体系 如：大肠杆菌、枯草杆菌表达系统。如：大肠杆菌、枯草杆菌表达系统。2 2、真核表达体系、真核表达体系 如：酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统。如：酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统。结束放映结束放映返回目录返回目录现在学习的是第48页，共49页感谢大家观看现在学习的是第49页，共49页