动物细胞工程制药 (3)讲稿.ppt

关于动物细胞工程制药(3)第一页，讲稿共一百一十二页哦Robert Hooke 及其制作的显微镜及其制作的显微镜第一节第一节 概述概述第二页，讲稿共一百一十二页哦Leeuwenhoek首次观察到了活的细胞首次观察到了活的细胞第三页，讲稿共一百一十二页哦p德国植物学家德国植物学家Schleiden和动物学家和动物学家Schwann创立创立了细胞学说了细胞学说p1885年年Roux用生理盐水成功培养鸡胚组织用生理盐水成功培养鸡胚组织p1907年年Harrison成功培养了离体的蛙胚神经组织，成功培养了离体的蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程。开创现代细并观察到神经细胞突起的生长过程。开创现代细胞培养的新纪元。胞培养的新纪元。第四页，讲稿共一百一十二页哦p细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到特性发生改变，从而达到改良或产生新品种改良或产生新品种的目的目的，以及使的，以及使细胞增加细胞增加或或重新获得产生某种特定产重新获得产生某种特定产物物的能力，从而在离体条件下进行的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增大量培养、增殖殖，并提取出对人类有用的产品。，并提取出对人类有用的产品。第五页，讲稿共一百一十二页哦二、动物细胞的化学组成和代谢二、动物细胞的化学组成和代谢p动物细胞的化学组成动物细胞的化学组成 无机成分：水、无机盐无机成分：水、无机盐 有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸p动物细胞的代谢动物细胞的代谢 糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）第六页，讲稿共一百一十二页哦三、动物细胞的生理特点三、动物细胞的生理特点1.细胞的分裂周期长：一般细胞的分裂周期长：一般1248 h2.细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象接触抑制现象：指细胞在生长过程中达到相互接触时停接触抑制现象：指细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象。止分裂的现象。3.3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的正常二倍体细胞的生长寿命是有限的:时间长短决定时间长短决定于细胞来源的种族和年龄于细胞来源的种族和年龄 原代培养原代培养 有限细胞系有限细胞系 无限细胞系（连续细胞系）无限细胞系（连续细胞系）第七页，讲稿共一百一十二页哦4.4.动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对周围环境十分敏感 对理化因素敏感：如渗透压、对理化因素敏感：如渗透压、pH、离子强度、剪切、离子强度、剪切力、微量元素等。力、微量元素等。5.5.动物细胞对培养基的要求高动物细胞对培养基的要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。细胞生长因子、贴壁因子等。6.6.动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 第八页，讲稿共一百一十二页哦p动物细胞生产药物动物细胞生产药物缺点：缺点：培养条件高、成本贵、产量低培养条件高、成本贵、产量低优点：优点：分泌胞外、收集纯化方便，较完善的翻译后分泌胞外、收集纯化方便，较完善的翻译后修饰，与天然产品一致修饰，与天然产品一致第九页，讲稿共一百一十二页哦第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求二、生产动物细胞的获得二、生产动物细胞的获得三、基因工程细胞的构建和筛选三、基因工程细胞的构建和筛选四、常用生产用动物细胞的特性四、常用生产用动物细胞的特性五、细胞库的建立五、细胞库的建立第十页，讲稿共一百一十二页哦一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求1.只有从正常组织中分离的只有从正常组织中分离的原代细胞原代细胞才能用来生产才能用来生产生物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞等生物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞等2.二倍体细胞二倍体细胞，即使经过多次传代也可用于生产，即使经过多次传代也可用于生产，如如WI-38，2BS细胞等细胞等3.用用异倍体传代细胞异倍体传代细胞生产重组基因产品，如生产重组基因产品，如t-PA、EPO、因子等因子等4.按照按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量残留量第十一页，讲稿共一百一十二页哦二、生产用动物细胞的获得二、生产用动物细胞的获得1.原代细胞：原代细胞：直接取自动物组织、器官，经过粉碎、直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。如鸡胚细胞、原代兔肾消化而获得的细胞悬液。如鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、淋巴细胞等细胞或鼠肾细胞、淋巴细胞等p用原代细胞生产生物制品常需要大量的动物，费用原代细胞生产生物制品常需要大量的动物，费钱费力钱费力第十二页，讲稿共一百一十二页哦2.二倍体细胞系：二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株一定特征的细胞株p由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织中获取。如中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等等第十三页，讲稿共一百一十二页哦3.转化细胞系：转化细胞系：失去了正常细胞的特点，获得了无失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力限增殖的能力p转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规模工业化生产。如模工业化生产。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等细胞等第十四页，讲稿共一百一十二页哦4.融合细胞系融合细胞系p细胞融合细胞融合：指两个或两个以上的细胞合并成一个：指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程细胞的过程p目前常用的融合方法有：目前常用的融合方法有：仙台病毒融合法仙台病毒融合法、聚乙聚乙二醇融合法二醇融合法、电融合法电融合法第十五页，讲稿共一百一十二页哦仙台病毒融合法仙台病毒融合法（很少使用）（很少使用）融合过程融合过程：a.病毒加入两种细胞（病毒加入两种细胞（4），附膜，细胞凝聚），附膜，细胞凝聚b.37，病毒与细胞膜反应，细胞膜被破坏，病毒与细胞膜反应，细胞膜被破坏c.两细胞连接部穿通，周边连接部修复两细胞连接部穿通，周边连接部修复d.细胞融合细胞融合第十六页，讲稿共一百一十二页哦聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法p常用相对分子量为常用相对分子量为1000，浓度为，浓度为50%，pH在在8.08.2时融合率可达时融合率可达100%p目前主要用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制目前主要用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备备第十七页，讲稿共一百一十二页哦电融合法电融合法：在短时间的强电场作用下，细胞膜发：在短时间的强电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，使相邻细胞的细胞膜发生继发生可逆性的电击穿，使相邻细胞的细胞膜发生继发性融合。性融合。优点：优点：操作简单，无化学毒性、对细胞损伤小、融操作简单，无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步、融合率高，可在显微镜下直接观察合同步、融合率高，可在显微镜下直接观察决定因素决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的性质（性质（pH、离子强度、渗透压）、离子强度、渗透压）第十八页，讲稿共一百一十二页哦5.重组工程细胞系重组工程细胞系p可采用基因工程的手段构建各种工程细胞可采用基因工程的手段构建各种工程细胞第十九页，讲稿共一百一十二页哦三、基因工程细胞的构建和筛选三、基因工程细胞的构建和筛选1.1.真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建病毒载体病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转率病毒、：如牛痘病毒、腺病毒、反转率病毒、杆杆 状病毒状病毒等等质粒载体质粒载体：穿梭质粒载体穿梭质粒载体第二十页，讲稿共一百一十二页哦用杆状病毒做载体的优点用杆状病毒做载体的优点该病毒基因组是双链该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组；，容易进行重组；插入插入78kb的的DNA不影响正常病毒粒子的形成；不影响正常病毒粒子的形成；多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的部蛋白质的2030%；用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆；用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆；如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。第二十一页，讲稿共一百一十二页哦构建质粒载体一般含有如下基本成分：构建质粒载体一般含有如下基本成分：允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。含有能使基因转录表达的调控元件。含有能使基因转录表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。a.仅适用于密切相关的突变细胞株，如仅适用于密切相关的突变细胞株，如tk基因基因b.显性作用基因，如显性作用基因，如neo基因基因 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。第二十二页，讲稿共一百一十二页哦2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 融合法融合法 化学法化学法 物理法物理法 病毒法病毒法细胞融合法细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 电穿孔法电穿孔法 重组逆转录病毒介导法重组逆转录病毒介导法 脂质体介导法脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法葡聚糖法 显微注射法显微注射法 重组重组DNA病毒病毒介导法介导法 原生质融合法原生质融合法 染色体介导法染色体介导法 基因枪法基因枪法 多瘤病毒样颗粒多瘤病毒样颗粒介导法介导法 微细胞介导法微细胞介导法鬼影红细胞介导法鬼影红细胞介导法DNA导入动物细胞的常用方法导入动物细胞的常用方法第二十三页，讲稿共一百一十二页哦a.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法：将溶解的：将溶解的DNA加在加在Na2HPO4中，逐渐加入中，逐渐加入CaCl2溶液溶液，当当 Na2HPO4和和CaCl2形成形成沉淀，沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉磷酸钙共沉淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用将将DNA导入胞内。导入胞内。优点优点：方法简单，可进行共转化：方法简单，可进行共转化第二十四页，讲稿共一百一十二页哦b.电穿孔法电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA沿小孔沿小孔进入细胞。进入细胞。特点：特点：转化效率较高，转化效率较高，但进入的但进入的DNADNA拷贝数较低拷贝数较低第二十五页，讲稿共一百一十二页哦如何筛选工程细胞如何筛选工程细胞？a.依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统：统：如用如用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用的转化细胞；用G418（Geneticin）选择系统，筛选）选择系统，筛选neor的转化细胞。的转化细胞。b.对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。c.利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高效表达而稳定的工程细胞株。效表达而稳定的工程细胞株。第二十六页，讲稿共一百一十二页哦四、常用生产用细胞的特性四、常用生产用细胞的特性（1）WI-38：1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系。倍体细胞系。该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagles basal medium）加小牛血清，）加小牛血清，pH控控制在制在7.2。细胞的倍增时间为。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为，有限寿命为50代，上世纪代，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。年代被广泛用于制备疫苗。第二十七页，讲稿共一百一十二页哦（2）BHK-21：1961年从年从5只生长只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经年用单细胞分离的方法经13次的克隆的次的克隆的细胞。细胞。成纤维细胞，成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基为。通常用的培养基为DMEM培养培养基，添加基，添加7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。胞。第二十八页，讲稿共一百一十二页哦（3）Vero：1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率，高倍体率为为1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培养基，添加培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。批准用于人体。第二十九页，讲稿共一百一十二页哦（4）Namalwa：1972年来源于肯尼亚患有年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。该细胞有该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有的高倍体率，多数细胞有1214条标记染色体，单条条标记染色体，单条X染色体，无染色体，无Y染色体。通常用染色体。通常用的培养基为的培养基为RPMI 1640，添加，添加7%胎牛血清。用于大胎牛血清。用于大规模生产规模生产-干扰素。干扰素。第三十页，讲稿共一百一十二页哦五、细胞库的建立五、细胞库的建立用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：1.原始细胞库原始细胞库（master cell bank，MCB）2.生产用细胞库生产用细胞库（manugactures working cell bank，MWCB），或称工作细胞库（），或称工作细胞库（working cell bank，WCB）。）。第三十一页，讲稿共一百一十二页哦原始细胞库原始细胞库是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮存时须有该细胞的应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮存时须有该细胞的详细档案，包括：详细档案，包括：该细胞系的历史：该细胞系的历史：来源、年龄和性别、细胞分离的方法、所用来源、年龄和性别、细胞分离的方法、所用的培养材料等；的培养材料等；该细胞系的特性：该细胞系的特性：形态、生长的特性、种源的特性等；形态、生长的特性、种源的特性等；对各种有害因子检查的结果。对各种有害因子检查的结果。第三十二页，讲稿共一百一十二页哦p生产用细胞库生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿：从原始细胞库来，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。细胞库。p生产用细胞库也必须建立档案，而且需要生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无进行无菌性和无细胞交叉污染的检查菌性和无细胞交叉污染的检查，生产时需，生产时需确定其确定其最高使用的传代数。最高使用的传代数。第三十三页，讲稿共一百一十二页哦第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基培养成功必备条件：培养成功必备条件：所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染免细胞外微生物的污染必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入使是极微量的有害离子的掺入保证有适量的氧气供应保证有适量的氧气供应需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物有良好的适于生存的外界环境有良好的适于生存的外界环境及时分种，保持合适的细胞密度及时分种，保持合适的细胞密度第三十四页，讲稿共一百一十二页哦一、动物细胞的培养条件一、动物细胞的培养条件1.器材的清洗和消毒器材的清洗和消毒2.水质水质3.pH4.渗透压渗透压5.温度温度6.空气空气第三十五页，讲稿共一百一十二页哦1.器材的清洗和消毒器材的清洗和消毒（1）器材的清洗：）器材的清洗：a.浸泡（浸泡（3%磷酸三钠）磷酸三钠）b.刷洗刷洗c.泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）d.冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）（2）器材的消毒灭菌：）器材的消毒灭菌：物理方法物理方法：如紫外线、干热、湿热、过滤：如紫外线、干热、湿热、过滤 化学方法化学方法：如化学消毒剂、抗生素：如化学消毒剂、抗生素第三十六页，讲稿共一百一十二页哦2.水质水质p细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使用。细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使用。p除微生物、有毒元素、金属离子、热原质除微生物、有毒元素、金属离子、热原质p当前当前处理水质的方法处理水质的方法有：蒸馏、离子交换、电渗有：蒸馏、离子交换、电渗透、反渗透、中空纤维过滤等透、反渗透、中空纤维过滤等第三十七页，讲稿共一百一十二页哦3.pHp动物细胞培养的动物细胞培养的最适最适pH为为7.27.4，低于，低于6.8或高于或高于7.6会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退变甚至死亡。变甚至死亡。p培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系统：统：如如HEPES、Na2HPO4/NaH2PO4缓冲系统、缓冲系统、NaHCO3/CO2缓冲系统等缓冲系统等第三十八页，讲稿共一百一十二页哦4.渗透压渗透压p细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。性。p最理想的渗透压为最理想的渗透压为290300mOsm/kgp为调整培养液的渗透压，一般采用加减为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法：的方法：1mg/ml NaCl-32mOsm/kgp在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和pH，一般都使用，一般都使用平平衡盐溶液（衡盐溶液（BBS），由无机盐和葡萄糖组成。，由无机盐和葡萄糖组成。第三十九页，讲稿共一百一十二页哦5.温度温度p动物细胞最佳培养温度动物细胞最佳培养温度：370.5p昆虫细胞最佳培养温度昆虫细胞最佳培养温度：27 p温度过高：细胞退变甚至死亡温度过高：细胞退变甚至死亡p温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量第四十页，讲稿共一百一十二页哦6.空气空气p方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空间，即方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空间，即培养的液体量不超过总体积的培养的液体量不超过总体积的30%。p采用生物反应器需通气，采用不同比例的采用生物反应器需通气，采用不同比例的O2、N2、CO2和空气。和空气。第四十一页，讲稿共一百一十二页哦无毒、无污染无毒、无污染p体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，因此培养基应达到：因此培养基应达到：无化学物质污染无化学物质污染无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）p对于对于天然培养基天然培养基，污染主要来源于，污染主要来源于取材过程取材过程及及生物材料生物材料本身，应当本身，应当严格选材，严格操作严格选材，严格操作p对于对于合成培养基合成培养基，污染主要来源于，污染主要来源于配置过程配置过程，配制所用的水、器，配制所用的水、器皿应十分洁净，配置后应严格皿应十分洁净，配置后应严格过滤除菌过滤除菌。第四十二页，讲稿共一百一十二页哦二、动物细胞培养基的种类和组成二、动物细胞培养基的种类和组成1.1.天然培养基天然培养基p指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。羊水、腹水等。p缺点缺点：成分复杂，制作过程复杂，组分不稳定，：成分复杂，制作过程复杂，组分不稳定，批间差异大，来源有限，不适于大量培养和生产批间差异大，来源有限，不适于大量培养和生产的需要，逐渐为合成培养基所替代。的需要，逐渐为合成培养基所替代。第四十三页，讲稿共一百一十二页哦2.2.合成培养基合成培养基优点优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应：成分明确，组分稳定，可大量生产供应其组成大致如下：其组成大致如下：氨基酸氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要需要1212种必需氨基酸种必需氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。此外还需要此外还需要谷氨酰胺谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。本物质。第四十四页，讲稿共一百一十二页哦维生素维生素：主要是形成酶的辅酶、辅基，维持细胞：主要是形成酶的辅酶、辅基，维持细胞生命活动的低分子活性物质。脂溶性（生命活动的低分子活性物质。脂溶性（A、D、E、K），水溶性维生素（），水溶性维生素（C、B1、B2、B12、生物、生物素、叶酸、胆碱）等都是常用的成分。素、叶酸、胆碱）等都是常用的成分。糖类糖类:培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是也是合成某。此外六碳糖也是也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。吸收能力最高，半乳糖最低。第四十五页，讲稿共一百一十二页哦无机盐无机盐：保持细胞的渗透压，缓冲：保持细胞的渗透压，缓冲pH的变化，并积极参与细的变化，并积极参与细胞的代谢。细胞生长除需胞的代谢。细胞生长除需Na、K、Ca、Mg、N、P等等基本元基本元素素，还需要，还需要Fe、Cu、Zn、Mn等等微量元素微量元素。其它成分其它成分：有些合成培养基中还加有核酸的前体、氧化还原剂等。：有些合成培养基中还加有核酸的前体、氧化还原剂等。一般都需要加入一般都需要加入510%的的小牛血清小牛血清。除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入一种要加入一种pH指示剂指示剂酚红酚红。当溶液酸性时。当溶液酸性时pH6.8呈黄色，呈黄色，当溶液碱性时当溶液碱性时pH8.4呈红色。呈红色。第四十六页，讲稿共一百一十二页哦血清的主要成分血清的主要成分p血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等长因子、激素、无机物等第四十七页，讲稿共一百一十二页哦血清的种类血清的种类p小牛血清：取自出生小牛血清：取自出生10-30天的小牛天的小牛p新牛血清：取自出生新牛血清：取自出生24h之内的新生牛之内的新生牛p胎牛血清：取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗胎牛血清：取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。体、补体等对细胞有害的成分最少。第四十八页，讲稿共一百一十二页哦血清的外观血清的外观p好的血清好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。沉淀或极少沉淀，比较粘稠。p如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性。污染或血清中的蛋白质变性。p若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象。高，取材时有溶血现象。p摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。水太多。第四十九页，讲稿共一百一十二页哦血清的作用机制血清的作用机制提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素激素提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白白提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素提供良好的提供良好的pHpH缓冲系统缓冲系统第五十页，讲稿共一百一十二页哦3.3.无血清培养基无血清培养基优点：优点：提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响；影响；减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。的分析。第五十一页，讲稿共一百一十二页哦无血清培养基：合成培养基无血清培养基：合成培养基+不同种类的添加剂不同种类的添加剂添加剂大致有以下几类：添加剂大致有以下几类：激素和生长因子激素和生长因子：各种激素、生长因子的功能各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化）保持细胞的状态（分化或未分化）使用最多的是使用最多的是胰岛素胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。成，对细胞生长有刺激作用。无血清培养基无血清培养基第五十二页，讲稿共一百一十二页哦结合蛋白结合蛋白：最经常被补充的是：最经常被补充的是铁传递蛋白铁传递蛋白和和白蛋白白蛋白。为了便于。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。贴附和伸展因子贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子。除贴附因子（纤维结合蛋白、缺少必需的贴附和伸展因子。除贴附因子（纤维结合蛋白、胶原）、多肽生长因子，有的还添加维生素胶原）、多肽生长因子，有的还添加维生素A A酸和重组的小肽，酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。它可与细胞的受体结合。其它有利于细胞生长的因子和元素其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基：它们包括有消除氧自由基损害的损害的谷胱甘肽谷胱甘肽，某些微量元素某些微量元素，如硒等。，如硒等。第五十三页，讲稿共一百一十二页哦如何选择培养基如何选择培养基选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：p建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。株时咨询。p根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。p用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法。结果选择最佳培养基，这是最客观的方法。第五十四页，讲稿共一百一十二页哦p培养细胞的种类：培养细胞的种类：原代细胞培养原代细胞培养 传代细胞培养传代细胞培养p培养基不同：培养基不同：液体培养液体培养 固体培养固体培养p培养容器和方式不同：培养容器和方式不同：静止培养静止培养 旋转培养旋转培养 微载体培养微载体培养 中空纤维培养中空纤维培养 固定化培养固定化培养第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法第五十五页，讲稿共一百一十二页哦一、细胞分离一、细胞分离1.离心分离法离心分离法：主要用于从含有细胞的体液，如血：主要用于从含有细胞的体液，如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，液、羊水、胸腹水中分离细胞，8001000 r/min离心离心510min2.消化分离法消化分离法：将生物体的组织块剪碎将生物体的组织块剪碎-用用消化消化液液消化，使组织松散成细胞悬液消化，使组织松散成细胞悬液-用缓冲液洗用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液涤、离心、去除残留的消化液-获得所需细胞获得所需细胞第五十六页，讲稿共一百一十二页哦p消化液的用途消化液的用途：取材进行原代培养时需要将组织：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。胞从瓶壁上消化下来。p常用的消化液常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、）、胰酶胰酶-柠檬酸盐、胰酶柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等第五十七页，讲稿共一百一十二页哦二、细胞计数二、细胞计数1.自动细胞计数器计数自动细胞计数器计数p原理：原理：让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来。在电子计数器上形成一个信号被记录下来。p优点：优点：计数速度快计数速度快p缺点：缺点：无法分辨活细胞和死细胞，误将细胞结团无法分辨活细胞和死细胞，误将细胞结团记录为单个细胞，使计数值偏低记录为单个细胞，使计数值偏低第五十八页，讲稿共一百一十二页哦2.血球计数板计数血球计数板计数第五十九页，讲稿共一百一十二页哦2.2.血球计数板计数血球计数板计数台酚蓝染色：死细胞呈蓝色台酚蓝染色：死细胞呈蓝色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色第六十页，讲稿共一百一十二页哦3.结晶紫染色细胞核计数法结晶紫染色细胞核计数法p原理：原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。计数细胞核即细胞数。第六十一页，讲稿共一百一十二页哦4.MTT染色计数法染色计数法pMTT:3-(4，5-二甲基噻唑二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。p原理：原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。）。MTT结晶形成的量与细胞数成正结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在比。用酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。反映活细胞数量。p灵敏度高；灵敏度高；MTT有致癌性，有致癌性，DMSO极易渗透皮极易渗透皮肤肤第六十二页，讲稿共一百一十二页哦三、细胞传代三、细胞传代p悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶后分种两只或多只培养瓶p贴壁细胞的传代贴壁细胞的传代：先消化再分种：先消化再分种第六十三页，讲稿共一百一十二页哦贴壁细胞传代的注意事项贴壁细胞传代的注意事项消化前确定细胞有无污染消化前确定细胞有无污染加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可消化时间不宜过长，室温静置消化时间不宜过长，室温静置2-5min终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以20-30万个万个/ml，每，每次次1传传2或或1传传3为宜；为宜；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次次二倍体细胞每次传代时应写上传代次数二倍体细胞每次传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次传代一次第六十四页，讲稿共一百一十二页哦四、细胞的冻存和复苏四、细胞的冻存和复苏1.细胞的冻存细胞的冻存p采用液氮低温（采用液氮低温（-196）冻存：加保护剂如）冻存：加保护剂如甘油甘油和和二甲亚砜二甲亚砜；冷冻速度以冷冻速度以1/min的速度下降为宜的速度下降为宜注意事项注意事项：p冻存前一天换液培养；冻存前一天换液培养；p细胞密度以细胞密度以1-2106个个/ml为宜；为宜；p冻存用培养基应与实际使用的一致，冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；过滤除菌；p检查安踣的密封性；检查安踣的密封性；p标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。第六十五页，讲稿共一百一十二页哦2.2.细胞的复苏细胞的复苏（总的要求是（总的要求是快融快融）注意事项注意事项：p操作中注意防护，戴面罩和手套；操作中注意防护，戴面罩和手套；p从液氮中取出后，立即丢入从液氮中取出后，立即丢入37-4037-40温水的搪瓷杯温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；中，并搅动加速融化；p用乙醇消毒安踣外表；用乙醇消毒安踣外表；p尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；p隔天观察细胞生长情况，再换液一次。隔天观察细胞生长情况，再换液一次。第六十六页，讲稿共一百一十二页哦一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式第六节第六节 动物细胞