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hBM P27西安交通大学口腔医院(西安710004)石建峰 李 昂 饶国洲 厉 强3目的:构建人骨形成蛋白27(hBM P27)基因重组腺相关病毒载体,并转染牙髓细胞,为牙组织损伤修复的基因治疗做探索性研究。方法:以含hBM P27全长cDNA的载体PTcDNA2hBM P27为模板进行PCR扩增,将回收产物和pAAV IRES2hrGFP分别双酶切后连接、转化大肠杆菌DH5感受态细胞,获得重组质粒pAAV IRES2hrGFP2hBM P27。采用磷酸钙共沉淀法转染293细胞进行病毒包装,收获的病毒液按氯仿处理、PEG?N aCl沉淀、酚:氯仿反复抽提法浓缩纯化,斑点杂交法测病毒滴度,并转染体外培养的牙髓细胞。结果:酶切鉴定和测序结果表明,hBM P27基因成功克隆入pAAV IRES2hrGFP载体中。在293细胞中包装出重组腺相关病毒载体rAAV IRES2hBM P27,物理滴度为3.01011v.g?m l。rAAV转染牙髓细胞后GFP表达逐渐增强,可持续表达到4周以后。结论:重组腺相关病毒载体rAAV IRES2hBM P27,能有效转染牙髓细胞表达目的基因。可用于牙组织工程基因治疗的研究。转染 细胞 牙髓 基因重排 骨形态发生蛋白质类Construction of the recombined adeno-associated viral vector ofhBM P-7 and transfection of dental pulp cellsHospital of Stomatology,Xian Jiaotong U niversity(Xian 710004)Shi JianfengL iA ngRao Guozhouet alABSTRACTObjectives:To construct the recombined adeno2associated viral vector of human bonemorphogenetic protein27(hBM P27)and transfect dental pulp cells;To explore the new gene therapy forrepairing the tooth tissue damage.M ethods:The moulds which contained hBM P27 vector were amplified byPCR.The reclai med productions and pAAV IRES2hrBM P were digested and integrated,bacillus coli DH5competent cells were transformed,and recombinant plasm id pAAV IRES2hrGFP2hBM P27 was obtained.293cells were virus2encloded by the calcium phosphate precipitation method and the virus fluid was obtained andprocessed by chloroform precipitate treatment,PEG8000?N aCl precipitation and chloroform extraction forpurification.V irus titer and transfection of dental pulp cells cultured in vitro were identified by dot blothybridization method.Results:Calcium phosphate coprecipitation methods were used in 293 cells and adeno2associated viral vector rAAV IRES2hBM P27 was recombinated.Green fluorescent protein expressing reachedpeak on day 6 in dental pulp cells after transfection by rAAV IRES2hBM P27 and the expression lasted for 4weeks.Conclusion:The recombined adeno2associated viral vector of human bone morphogenetic protein27(hBM P27)was constructed successfully,which can transfect dental pulp cells effectively.The hBM P27 anddental pulp cells can be applied to gene therapy research.KEY WORDST ransfectionCellsDental pulpGene rearrangementBone morphogeneticproteins 骨 形 成 蛋 白(Bone morphogenetic proteins,BM Ps)是目前发现的惟一的一类具有异位成骨能力的细胞因子,属于转化生长因子2超家族的成员,可促进骨、软骨、牙本质等硬组织的形成及缺损的修复。研究表明,人骨形成蛋白27(hBM P27)具有诱导牙髓细胞分3 西安交通大学医学院第二附属医院化为成牙本质细胞的作用,在牙本质复合体形成及牙髓断面修复过程中起重要作用1。本实验试图构建hBM P27基因重组腺相关病毒载体pAAV2IRES2hrGFP2hBM P27,并体外转染牙髓细胞,为研究牙组织基因治疗方式作基础性实验。1 实验材料 含hBM P27全长cDNA的质粒37陕西医学杂志2008年1月第37卷第1期 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/PTcDNA2hBM P27由西安先锋生物技术公司合成提供,pAAV2IRES2hrGFP质 粒、293细 胞 购 自 美 国Stratagene公司;质粒pAAV2RC、pHelper由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士馈赠;大肠杆菌DH5由本实验室保存;磷酸钙法细胞转染试剂盒购自碧云天(Beyoti me)公司;地高辛标记试剂盒购自Fermentas公司(立陶宛)。DM EM培养基购自Gibco;BamH I、SalI、T4连接酶、T rizol Reagent kit、PCR试剂盒购自日本Takara公司;引物合成(北京三博远志生物技术公司)。2 目的基的hBM P27的获得 从Gen bank中检索到hBM P27的序列(NM2001719),选择CDS区设计引物,以含hBM P27全长cDNA的质粒PTcDNA2hBM P27为模板进行PCR扩增。上游引物P15 2CGGGA TCCA TGCACGTGCGCTCACTGCG23 插入BamH I的 酶 切 位 点,下 游 引 物P252GCGTCGACCTA GTGGCA GCCACA GGCCCGGACC23插入SalI的酶切位点。PCR条件为:94预变性2m in,94变性30s,53退火30s,72延伸30s,共35个循环,回收产物。3 重组腺相关病毒质粒pAAV IRES2hrGFP2hBM P27的构建 将腺相关病毒真核表达质粒pAAVIRES2hrGFP和含目的基因的PCR回收产物,分别用BamH I+SalI进行双酶切,将回收的酶切产物16T4连接酶连接过夜。用连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞,转化产物涂氨苄青霉素(+)平板,37培养18h,筛选阳性克隆接种LB液体培养基,进行质粒大提。取部分所获质粒进行双酶切鉴定和测序,命名pAAV IRES2hrGFP2hBM P27。4rAAV的制备 选用生长至对数期的293细胞,转染前3060m in,吸去细胞培养液,加入新鲜的不含抗生素的DM EM培养基6m l。分别取大量制备的纯度1.80以上(A 260?280)的病毒质粒pAAV IRES2hrGFP2hBM P27、辅助质粒pAAV2Helper和包装质粒pAAV2RC各10l(1g?l),加入到200l氯化钙溶液中,按磷酸钙法细胞转染试剂盒说明转染293细胞。在37、含5%二氧化碳的细胞培养箱内培养,16h后吸去含磷酸钙沉淀的培养液,加入6m l新鲜的含10胎牛血清的DM EM培养基,继续培养72h。收集培养瓶中的细胞,-20冰冻,37融化,反复三次使细胞完全裂解,氯 仿 变 性,终 浓 度1mol?LN aCl和 终 浓 度10PEG8000各沉淀1次。酚、氯仿抽提2,得到初步浓缩纯化的rAAV。以点杂交法确定病毒滴度。命名为rAAV IRES2hBM P27。5rAAV转染牙髓细胞 取临床因正畸需要拔除的健康牙齿,按组织块法培养牙髓细胞。将获得的第4代牙髓细胞,按1105?孔接种于24孔培养板中,37、5%CO2培养至细胞80%融合,弃去旧培养液,用含有氨苄青霉素(100U?m l)和链霉素(100g?m l)的无血清高糖DM EM培养基洗涤细胞3次。转染孔分别加入200l含rAAV IRES2hBM P27病毒载体(MO I=1105)的无血清高糖DM EM培养基,对照孔不加病毒载体。孵育2h后,吸去含病毒载体的培养基,更换含10%胎牛血清的高糖DM EM培养基继续培养,每隔12h倒置荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达。并随机计数多个视野的细胞总数和发GFP荧光的细胞数。1hBM P27的获得PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,1312bp位置有DNA条带,与hBM P27基因长度相符合(见图1)。2 重组质粒pAAV IRES2hrGFP2hBM P27的鉴定 将pAAV IRES2hrGFP2hBM P27用BamH I+SalI双酶切鉴定,电泳图谱显示6100bp和1312bp两条DNA条带(见图2),与病毒载体质粒及hBM P27大小一致。测序鉴定结果(上海英骏生物技术公司)也证实hBM P27基因已成功地连接到pAAV IRES2hrGFP载体上,并与Gene bank中检索的原始序列完全一致。3rAAV的包装、浓缩及滴度测定 采用磷酸钙三质粒共沉淀法,将重组病毒质粒转入293细胞。与对照组相比,转染组培养基颜色从红色变为橙黄色,并有发绿色荧光的细胞出现,证明病毒已经开始在293细胞中包装。收获的病毒液经浓缩纯化后,采用地高辛标记试剂盒标记的GFP探针,通过斑点杂交法,对比标准质粒和rAAV IRES2hBM P27病毒DNA斑点密度的大小,估算出病毒的物理滴度约为3.01011v.g?m l,能够用于后继的实验。图1hBM P27基因PCR扩增电泳图谱M:DL 2000;1、2、3、hBM P27基因47陕西医学杂志2008年1月第37卷第1期 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/图2pAAV IRES2hrGFP2hBM P27用BamH1+Sal1双酶切M:DNAM arker,1、2 pAAV IRES2hrGFP2hBM P27双酶切段4 牙髓细胞的分离培养及rAAV的转染 采用组织块法进行人牙髓细胞体外培养中,7d左右细胞开始从组织块中游出。倒置显微镜下观察细胞主要是成纤维细胞,14d时达到70%融合,细胞排列成单层,局部 呈典型的“漩涡状”排列。此时进行传代培养。rAAV IRES2hBM P27感染第4代牙髓细胞后,24h内就有产生绿色荧光的细胞出现,第6天达到高峰。计数多个视野中发光细胞所占比率,平均后得到第6天rAAV的转染率约为84.6%。以后荧光强度逐渐下降,观察至第4周,仍有绿色荧光发生。基因治疗的关键环节是选择安全有效的载体,将目的基因导入宿主细胞,使外源基因在宿主体内持续稳定表达。重组腺相关病毒(rAAV)载体是目前发现的惟一一类能将其基因定点整合到宿主细胞染色体上的病毒,其基因组结构简单,是全长4681bp的单链线状DNA,仅编码产生rep和cap两种蛋白3,不编码任何引起免疫反应的病毒蛋白,针对AAV核衣壳的抗体也不影响再次接种载体,因此免疫原性很低,甚至没有免疫原性。目前所用的rAAV载体大多是在AAV22的基础上,去除了结构基因rep和cap,仅保留对病毒的包装和整合不可缺少的ITR(末端反转重复序列),外源基因和启动子克隆在ITR之间4。本实验中采用的AAV Helper2Free System中,病毒载体pAAV IRES2hrGFP,包含一个标记基因hrGFP,是GFP的基因修饰型,荧光强度极大增强,其上游含一个内核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES),作为一个双顺反子表达载体可快速有效地表达目的基因和报告基因。同时有加入一个CMV作为促进子,更加促进了目的基因和报告基因的表达。AAV结构基因rep和cap由pAAV2RC提供,辅助质粒pHelper则含有拯救病毒所需的腺病毒基因E2A、E4和VA RNA基因。本组使用此系统在293细胞中包装出滴度为3.01011v.g?m l的rAAV,又避免了野生型AAV和腺病毒的污染,并且通过荧光活性细胞计数定性估计出rAAV感染效率约为84.6%。BM Ps存在于骨、牙本质中,它能刺激间充质干细胞向成软骨细胞、成骨细胞及成牙本质细胞方向分化5。其中BM P27具有较强的骨诱导能力及维持软骨细胞的表型、促进细胞外基质如蛋白多糖和?型胶原合成的能力6。Rutherford等在用含BM Ps的复合材料作为盖髓剂的研究中,发现窝洞内有骨样修复性牙本质形成。在磨牙根分叉区病变的动物模型中,R ipamondli等用复合有骨形成蛋白27的I型胶原作为仿生支架,观察到有新生的牙槽骨、骨样牙本质形成。但是,BM P27作为一种细胞因子,在体外使用时容易失活,且不能达到持续治疗的目的。为探索其在体内持续表达方式及承载细胞,本组构建了含BM P27基因的rAAV载体,并转染了牙髓细胞。牙髓细胞的主要成分是成纤维细胞,此外还有组织细胞、成牙本质细胞和未分化的间充质细胞。其中未分化的间充质细胞在体外受牙本质基质、坏死组织、牙髓微环境等影响,可分化为成牙本质细胞,再形成牙本质桥,其功能类似骨髓基质干细胞7。牙髓细胞表面具有BM Ps的受体,BM P7能与之结合,诱导牙髓细胞发生一系列胞内级联反应,形成牙本质牙髓样复合体8。本实验成功构建了hBM P27基因重组腺相关病毒载体pAAV2IRES2hrGFP2hBM P27,并在293细胞内包装出具有感染性的rAAV。体外转染牙髓细胞,通过GFP的表达,说明rAAV载体可将BM P7整和进牙髓细胞基因组,为实现BM P7在体内的稳定表达奠定了基础。可用于牙组织工程基因治疗的研究。1H idaka C,Goodrich LR,Chen CT,et al.A cceleration ofcartilagerepair by genetically modified chondrocytes overexpressing bone morphogenetic protein27 J.J O rthopRes,2003;21(4):5732583.2 吴小兵,董小岩,伍志坚,等.一种快速分离腺病毒伴随病毒的方法.科学通报,2000,45(3):207122075.3 Chiriva2Internati M,L iu Y,Salati E,et al.Efficientgeneration ocytotoxic Tlymphocytes against cervicalcancercellsbyadeno2asso2ciatedvirus?humanpapillomavirus type 16E7antigen gene transduction intodendritic cells J.Eur J I mmunol,2002,32(1):30238.4Joseph E,Rabinow itz,Samulski RJ.Building a bettervector:thema2nipulation ofAAV virionsJ.V irology,(下转第79页)57陕西医学杂志2008年1月第37卷第1期 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/异,甚至病死率还低于无假体者。因此,多数学者认为乳房假体植入是安全、无害的。3免疫性疾病 虽有报道认为,硅胶假体有增加病人患结缔组织病或风湿病的危险,但这一结论尚未被多数学者接受。疏水的硅胶成分通过假体囊壁外渗量甚微,并主要被巨噬细胞吞噬,局限于包膜囊内。即便是假体包膜破裂,漏出的硅凝胶通常也被限制在周围的瘢痕性包膜内。数周后外露的硅凝胶被新的瘢痕包围,分割形成微小的异物肉芽肿。因此,对全身影响是有限的。当然最终的结论有待于大规模流行病学的研究结果。本组结果表明,在SSM术后即时乳房再造,患者早期的免疫功能未发生明显变化,但更长时间的情况仍须继续观察和评判。综上所述,对于早期乳腺癌患者在实施保留皮肤的乳腺癌切除术后,采用自体组织移植或硅胶假体植入方式即时乳房再造,患者细胞免疫功能无明显变化。在平均11月的随访中,未出现肿瘤复发和免疫性疾病,包膜挛缩的发生率较低。因此,可以说作为一种创伤小、恢复快的乳房再造方式,只要适应证选择得当,硅胶假体植入式即时乳房再造是一种较为安全、可靠的方法。1毕爱华,龚非力主编.医学免疫学.北京:人民军医出版社,1995:122248.2陈明水,陈 强,叶韵斌,等.乳腺癌病人细胞免疫功能的变化及其意义.福建医药杂志,2003,25(3):18220.3 L udw ig CU,Hartmann D,L andmann R,etal.U nalteredi mmunocompetenceinpatients w ithnon2dissem inated breast cancer at the ti me of diagnosis J.Cancer,1985,55(8):167321678.4 M c2Cluskey DR,Roy AD,A bram W P,et al.Tlymphocyte subsets in the peripheral blood of patientsw ith benign and malignant breast disease J.Br 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