埃博拉出血热病毒的样本采集运送和实验室检测讲稿.ppt

埃博拉出血热病毒的样本采集运送和实验室检测第一页，讲稿共二十八页哦埃博拉出血热病毒的样本采集、运送和实验室检测浙江省CDC卢亦愚2014年8月第二页，讲稿共二十八页哦主要内容n标本采集n标本包装与运送n实验室检测第三页，讲稿共二十八页哦（一）标本采集第四页，讲稿共二十八页哦标本采集人员的防护按照2014年8月19日发布的中国疾病预防控制中心关于埃博拉出血热个人防护技术方案指南（第一版）（试行）的要求，采样人员应穿戴防护用品包括:n一次性工作帽n一次性防渗漏防护服n防水靴（或者密闭式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）n防护眼罩或防护面屏n医用防护口罩（N95及以上）或全面型自吸过滤式呼吸器n双层一次性乳胶手套第五页，讲稿共二十八页哦标本采集人员的防护穿戴顺序：n步骤1：手卫生n步骤2：一次性工作帽（如需要）n步骤3：医用防护口罩（N95及以上）或全面型自吸过滤式呼吸器n步骤4：防护眼罩或防护面屏，如选择全面型自吸过滤式呼吸器时无需佩戴n步骤5：里层一次性乳胶手套n步骤6：一次性防渗漏防护服（必要时，可加穿防水围裙）n步骤7：外层一次性乳胶手套n步骤8：防水靴或防水靴套（或者密闭式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）第六页，讲稿共二十八页哦标本采集人员的防护脱摘顺序：n步骤1：外层一次性乳胶手套n步骤2：防水靴或防水靴套（或者密闭式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）n步骤3：内层手套消毒n步骤4：一次性防渗漏防护服（需要时，先脱防水围裙）n步骤5：内层手套消毒n步骤6：防护眼罩或防护面屏n步骤7：医用防护口罩（N95及以上）或全面型自吸过滤式呼吸器n步骤8：一次性工作帽（如需要）n步骤9：里层一次性乳胶手套n步骤10：手卫生第七页，讲稿共二十八页哦标本采集n按照埃博拉出血热防控方案（第二版）规定，定点医院负责病例的标本采集工作n根据流行病学史、症状等判别结果，采集留观病例、疑似病例和确诊病例的标本n目前仅需采集血液标本，大小便、唾液和组织也可用于检测第八页，讲稿共二十八页哦标本采集n用分离胶无菌真空促凝管采集静脉血，每管3mL，标记后4保存，填写标本采集登记表n留观病例、疑似病例采集4管，其中2管尽快送省疾控中心实验室，2管保存于样本采集单位，待排除埃博拉病毒感染后用于其它病原体的筛查第九页，讲稿共二十八页哦（二）标本包装与运送第十页，讲稿共二十八页哦标本包装、运送n按照可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定要求运输至具有从事埃博拉病毒相关实验活动资质的实验室n标本应当置于符合国际民航组织规定的A类包装运输材料之中n低温冷藏运输，避免反复冻融第十一页，讲稿共二十八页哦标本包装、运送nA类包装，符合UN2814要求，按照三重包装系统包装：第一层包装（可密封样本袋、50mL离心管等）；第二层安全壳容器（防水、防漏）；外层运输包装组成n样本袋放入防水防漏的第二层安全壳容器中，为降低破碎或泄漏的风险，用吸水纸等填充物固定标本袋。安全壳容器和外包装之间放冰袋n不要打开采集管或分装样本n不要离心分离血清第十二页，讲稿共二十八页哦标本包装、运送第十三页，讲稿共二十八页哦（三）实验室检测第十四页，讲稿共二十八页哦实验室检测的生物安全要求实验室病原学和血清学检测相关活动严格按照人间传染的病原微生物名录的要求，在相应的生物安全级别实验室开展。n病毒培养在BSL-4实验室n动物感染实验在ABSL-4实验室n未经培养的感染材料的操作在BSL-3实验室n灭活材料的操作在BSL-2实验室n无感染性材料的操作在BSL-1实验室中进行第十五页，讲稿共二十八页哦实验人员个人防护口罩、帽子、防渗漏防护服、乳胶手套、高筒鞋套、防护面罩（正压头盔）等；注：手套、防护服大小要合适，检查有无破漏；手套的量要充足，满足随时更换。所有涉及感染性材料的操作均应在BSL-3实验室二级生物安全柜内进行；方便取用的消毒剂（0.5%次氯酸钠溶液、75%酒精等），空间喷雾消毒设备（使用过氧乙酸，过氧化氢等）。第十六页，讲稿共二十八页哦埃博拉出血热病毒实验室检测n实验室检测（1）病毒抗原阳性（2）血清特异性IgM抗体阳性（3）恢复期血清特异性IgG抗体滴度比急性期有4倍以上升高（4）从患者标本中检出埃博拉病毒RNA（5）从患者标本中分离到埃博拉病毒n诊断 疑似病例基础上具备诊断依据中实验室检查任一项检测阳性者第十七页，讲稿共二十八页哦检测内容目前省疾控中心实验室报送审批的检测项目包括：埃博拉病毒核酸检测抗埃博拉病毒IgM、IgG抗体检测第十八页，讲稿共二十八页哦标本处理与保存n省疾控中心在BSL-3实验室尽快分离血清，离心时使用有密封盖的离心桶或转头进行标本离心，应在生物安全柜内打开离心转头放入或取出装有标本的离心管n分离的血清标本长期保存应置于-70以下，保存不超过1周可置-20第十九页，讲稿共二十八页哦实验操作的生物安全要求核酸提取时，加入核酸提取裂解液后，可在加入核酸提取裂解液后，可在BSL-2BSL-2及以上实验及以上实验室进行室进行。血清学检测时，应先601小时灭活，灭活材料免疫学检测应在生物安全3级（BSL-3）实验室内进行在进行感染性材料操作时，每次标本份数不宜过多，每份标本量不宜过大 第二十页，讲稿共二十八页哦核酸检测n是目前早期诊断、早期发现埃博拉出血热病例的主要检测方法n采用荧光定量 PCR 进行病毒核酸检测，患者标本中扩增到特异性核酸，可确诊埃博拉病毒感染n传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列第二十一页，讲稿共二十八页哦核酸检测n发病后3天内，血标本中埃博拉病毒核酸检出率低，检测阴性不能排除埃博拉病毒感染，应结合病例的流行病学史和临床表现进行综合判断n发病后310天血标本病毒核酸检出率高，检测阴性可排除埃博拉病毒感染。第二十二页，讲稿共二十八页哦酶标检测n病毒抗原检测：用酶联免疫法检测埃博拉病毒核蛋白抗原。病毒抗原检测阳性可确诊。n血清特异性IgM抗体：采用捕获法ELISA方法检测。疑似病例具有疫区旅行史或患者接触史，IgM抗体阳性，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。n血清特异性IgG抗体：目前主要采用间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体。单份血清埃博拉病毒IgG抗体阳性为曾感染埃博拉病毒，双份血清埃博拉病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍或者以上增高者，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。第二十三页，讲稿共二十八页哦核酸检测流程图反应体系混合物正、反向引物混合物特异性荧光探针1)核酸分离，BSL-3BSL-32)Real-time PCR 检测20 l5 l反应条件取决于病原体特异性PCR仪合适的PCR管第二十四页，讲稿共二十八页哦引物/探针序列引物探针1ZEBOV-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBOV-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBOV-PFAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1引物探针2EBOGP1D-fwdTGGGCTGAAAAYTGCTACAATC EBOGP1D-revCTTTGTGMACATASCGGCAC EBOGP1DZ-PrbFAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1RNA模板5l，酶（25x）1l，缓冲液12.5l，引物（10uM）各1l，探针（10uM）0.5l，加水至总体积25l。推荐反应条件为5030min，9510min，9515s、6045s反应40个循环。结果判断：以定量荧光PCR反应的前315个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的埃博拉病毒核酸检测阳性。实时定量RT-PCR方法第二十五页，讲稿共二十八页哦ZEBOV y=-3.469x+39.75 R2=0.999SEBOV y=-3.533x+38.41 R2=1.000CEBOV y=-3.478x+38.87 R2=0.999 ZEBOV y=-3.540 x+39.69 R2=1.000REBOV y=-3.509x+38.54 R2=0.999BEBOV y=-3.470 x+38.75 R2=1.0002套实时定量PCR检测方法检出限50100拷贝体外转录RNA参考品1套引物探针序列与目前西非流行株一致；1套采用兼并引物，与目前西非流行株差别2个碱基，但理论上不影响检测。第二十六页，讲稿共二十八页哦引物引物 序列序列 大小大小 方法1EBVGP451-472 F5-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3EBVGP 1024-1003R5-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3570bp方法2Filo-A1ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT Filo-B1ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG 414bpFilo-A2GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGG Filo-B2ATAATAATCACTCACATGCATATAACA282bp常规RT-PCR方法结果判断：阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染，但一般情况下需经序列分析确诊。第二十七页，讲稿共二十八页哦谢 谢！第二十八页，讲稿共二十八页哦