基因工程与基因组学讲稿.ppt

关于基因工程与基因组关于基因工程与基因组学学第一页，讲稿共五十二页哦第一节第一节 基因工程基因工程一、基因工程概述基因工程概述二、基因工程工具酶基因工程工具酶三、基因工程的流程及相关技术四、基因工程的发展应用第二页，讲稿共五十二页哦一、基因工程概述基因工程概述遗传工程（遗传工程（genetic engineering），），也称生物工也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。学手段。核心是利用重组核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。修饰改变生物体遗传结构。基因工程（基因工程（gene engineering）：）：利用人工的利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。程。第三页，讲稿共五十二页哦二、二、基因工程的工具酶内切核酸酶内切核酸酶(endonuclease)(endonuclease)(endonuclease)(endonuclease)DNADNADNADNA连接酶连接酶(ligase)(ligase)(ligase)(ligase)DNADNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）RNARNARNARNA聚合酶（聚合酶（RNA polymeraseRNA polymeraseRNA polymeraseRNA polymerase）反转录酶（反转录酶（反转录酶（反转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptasereverse transcriptasereverse transcriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restriction restriction restriction restriction endonucleaseendonucleaseendonucleaseendonuclease），也称限制性酶），也称限制性酶(restriction(restriction(restriction(restriction enzyme),enzyme),enzyme),enzyme),能识别双链能识别双链能识别双链能识别双链DNADNA分子中一段特异的核苷酸序列，分子中一段特异的核苷酸序列，分子中一段特异的核苷酸序列，分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连并在特定的位置将双连并在特定的位置将双连并在特定的位置将双连DNADNA分子切断。分子切断。第四页，讲稿共五十二页哦Eco R 属名属名 种名种名 菌株名菌株名 序号序号（一一）限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶第五页，讲稿共五十二页哦常常见见内内切切酶酶第六页，讲稿共五十二页哦（二）（二）DNADNA连接酶连接酶n n连接连接55磷酸和磷酸和33OHOH，形成磷酸二酯，形成磷酸二酯键，封闭键，封闭DNADNA双链上的缺刻。双链上的缺刻。如：如：EEcoli DNAcoli DNA连接酶连接酶 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 第七页，讲稿共五十二页哦 载体载体(vector)n n将外源将外源DNADNA片段运送进宿主细胞片段运送进宿主细胞(host(host cell)cell)进行扩增或表达的运载工具称为载进行扩增或表达的运载工具称为载体。体。n n载体也是载体也是载体也是载体也是DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。n n常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。经改造的黏粒(cosmid)、噬粒、噬粒(phagemid)(phagemid)n n都要经过人工改造。都要经过人工改造。都要经过人工改造。都要经过人工改造。n n细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC）、酵母菌人工染色体）、酵母菌人工染色体（YACYAC）和人类人工染色体（）和人类人工染色体（HACHAC）第八页，讲稿共五十二页哦噬菌体噬菌体载体载体YACYAC（1Mb1Mb）第九页，讲稿共五十二页哦载体的基本条件载体的基本条件有独立的复制原点有独立的复制原点(ori)(ori)，能独立地自我复，能独立地自我复制，而且能带动外源制，而且能带动外源DNADNA一起复制。一起复制。具有多种限制性酶的切点，用于连接外源具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA DNA 片段。片段。载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。来说只能有一个。具有一个选择标记基因。具有一个选择标记基因。第十页，讲稿共五十二页哦获得外源获得外源DNADNA片段（分）片段（分）限制性内切酶切割外源限制性内切酶切割外源DNADNADNADNA片段与载体（切）片段与载体（切）片段与载体（切）片段与载体（切）外源外源外源外源DNADNA片段与载体连接（接）片段与载体连接（接）片段与载体连接（接）片段与载体连接（接）重组重组重组重组DNADNADNADNA分子转入宿主细胞（转）分子转入宿主细胞（转）重组子的筛选与鉴定（筛）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析目的基因的确认与分析三、基因工程的流程及相关技术三、基因工程的流程及相关技术第十一页，讲稿共五十二页哦第十二页，讲稿共五十二页哦（一）外源DNA片段的分离方法1.1.1.1.构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法2.2.2.2.差别显示反转录差别显示反转录PCRPCR3.3.3.3.利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因第十三页，讲稿共五十二页哦1.构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法 用克隆载体将某种生物的用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库。息，即构成部分基因组文库。供体生物的基因组供体生物的基因组DNADNA切割成切割成许多片段许多片段将所有片段分别连接到载体上，将所有片段分别连接到载体上，构成一个重组构成一个重组DNADNA群体群体这个群体包含全基因组的遗传这个群体包含全基因组的遗传信息。信息。保存、筛选保存、筛选第十四页，讲稿共五十二页哦差别显示分析基本流程差别显示分析基本流程2.2.差别显示反转录差别显示反转录PCRPCR（DDRT-PCRDDRT-PCR）第十五页，讲稿共五十二页哦3 3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因（1）套式）套式PCR（2）反向）反向PCR（3）不对称）不对称PCR（4）锚定）锚定PCR（5）长程）长程PCR（6）反转录）反转录PCR第十六页，讲稿共五十二页哦4 4、人工合成基因人工合成基因n n根根据据已已知知的的基基因因序序列列，或或根根据据氨氨基基酸酸序序列列推推测测DNADNA序列序列n n将将化化学学合合成成寡寡核核苷苷酸酸的的方方法法与与酶酶促促合合成成DNADNA的的方方法法结结合合起起来来，可可以以很很快快地地人人工工合合成成基基因。因。第十七页，讲稿共五十二页哦通过用相同的通过用相同的限制性核酸内限制性核酸内切酶切割，连切酶切割，连接形成一个重接形成一个重组组DNA分子分子（二）、外源（二）、外源DNADNA片段与载体的切割和连接片段与载体的切割和连接第十八页，讲稿共五十二页哦（三）、重组DNA转入宿主细胞 1.1.重组重组DNADNA转入原核细胞转入原核细胞 热激转化法热激转化法热激转化法热激转化法 电穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法2.2.重组重组DNADNA转入真核细胞转入真核细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法第十九页，讲稿共五十二页哦重组重组DNA感受态感受态细胞细胞 冰浴冰浴混合、静置混合、静置42C 热热激激加入培养基加入培养基扩扩培培转化液涂含抗转化液涂含抗菌素的平板菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热激转化法第二十页，讲稿共五十二页哦感受态细胞感受态细胞 电转仪调为电转仪调为2.5kV 25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 质粒质粒DNA 混合混合加入加入培养液培养液37 中速震荡中速震荡涂板涂板（2）电穿孔转化法第二十一页，讲稿共五十二页哦2.2.重组重组DNADNA转入植物细胞转入植物细胞农杆菌介导的农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法第二十二页，讲稿共五十二页哦（四（四）重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 3.核酸杂交核酸杂交4.PCR检测检测5.测序测序6.生物学活性检测生物学活性检测1 1.插入抗性失活插入抗性失活2.2.蓝白斑蓝白斑筛选筛选第二十三页，讲稿共五十二页哦1.1.插入失活筛选法插入失活筛选法第二十四页，讲稿共五十二页哦蓝白斑筛选重组质粒蓝白斑筛选重组质粒第二十五页，讲稿共五十二页哦四、基因工程的发展应用四、基因工程的发展应用1 1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段、基因工程是生物科学基础研究的重要手段2 2、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产上应用上应用3 3、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物4 4、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递提供、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递提供了可能。了可能。转基因动植物转基因动植物-“-“生物工厂生物工厂”5 5、疾病诊断与基因治疗、疾病诊断与基因治疗6 6、环境保护、环境保护第二十六页，讲稿共五十二页哦第二十七页，讲稿共五十二页哦4.利用基因工程改良动物利用基因工程改良动物第二十八页，讲稿共五十二页哦推荐几本参考书：1、基因工程原理与方法，孙树汉编，人民军医出版社2、基因工程原理，吴乃虎编，科学出版社（侧重原理）3、现代基因工程技术导论，陈章良编，科学出版社（侧重应用）4、分子克隆(第三版)，J.Sambrook et al.科学出版社（具体的实验方法，分子生物学研究的圣经）第二十九页，讲稿共五十二页哦第二节第二节 基因组学基因组学一、一、基因组学基因组学概述概述二、基因组图谱的构建二、基因组图谱的构建三、基因组图谱的应用三、基因组图谱的应用四、后基因组学四、后基因组学第三十页，讲稿共五十二页哦基因组基因组(genome)泛泛指指一一个个有有生生命命体体、病病毒毒或或细细胞胞器器的的全全部部遗遗传传物物质质；在在真真核核生生物物，基基因因组组是是指指一一套套染染色色体体（单单倍倍体体）DNA。一、一、基因组学概念及范畴基因组学概念及范畴基因组学基因组学(genomics)就是发展和应用就是发展和应用DNA制图、制图、测序新技术以及计算机程序，分测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。组结构及功能。第三十一页，讲稿共五十二页哦基因组学研究的最终目标基因组学研究的最终目标n n获得生物体全部基因组序列获得生物体全部基因组序列n n鉴定所有基因的功能鉴定所有基因的功能n n明确基因之间的相互作用关系明确基因之间的相互作用关系n n阐明基因组的进化规律阐明基因组的进化规律第三十二页，讲稿共五十二页哦基因组学研究内容基因组学研究内容 结构基因组学结构基因组学(structural genomics)功能基因组学功能基因组学(functional genomics)比较基因组学比较基因组学(comparative genomics)第三十三页，讲稿共五十二页哦结构基因组学（结构基因组学（structural genomics）基因定位基因定位 基因组作图基因组作图 测定核苷酸序列测定核苷酸序列第三十四页，讲稿共五十二页哦遗传图（连锁图）遗传图（连锁图）物理图物理图转录图转录图序列图序列图二、基因组图谱的构建二、基因组图谱的构建基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱第三十五页，讲稿共五十二页哦1.1.遗传图遗传图 连锁图连锁图(linkage map)，是指基因标志在染色体，是指基因标志在染色体上的遗传距离，即确定各基因在基因组中的相对上的遗传距离，即确定各基因在基因组中的相对位置和排列顺序。位置和排列顺序。遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交换过程遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交换过程中分离的频率厘摩（中分离的频率厘摩（cM）来表示。）来表示。第三十六页，讲稿共五十二页哦遗传标记（遗传标记（Genetic marker）指可识别的等位基因。它具有）指可识别的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。表型的基因突变型均可作为遗传标记。类型：类型：形态标记（形态标记（morphological marker）细胞学标记细胞学标记(cytological marker)生化标记生化标记(biochemical marker)分子标记分子标记(molecular marker)第三十七页，讲稿共五十二页哦第三十八页，讲稿共五十二页哦2.、物理图、物理图 以已知核苷酸序列的以已知核苷酸序列的DNA片断（序列标签位片断（序列标签位点点,STS）为）为“路标路标”，以碱基对作为基本测量单，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图位（图距）的基因组图。DNADNA上两点的实际距离，即确定基因在染色体上的上两点的实际距离，即确定基因在染色体上的实际排列顺序，从而对基因定位。实际排列顺序，从而对基因定位。第三十九页，讲稿共五十二页哦3 3、转录图、转录图 以以ESTEST（expressed sequence tag expressed sequence tag，表达序列标签），表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。第四十页，讲稿共五十二页哦4.、序列图、序列图 序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图，既包括可转录序列，也包括非转是最详尽的物理图，既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。和。这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。第四十一页，讲稿共五十二页哦CREDIT:JOE SUTLIFF Science,Vol 291:1221.Fishing in a More Effective Way!第四十二页，讲稿共五十二页哦人类基因组计划人类基因组计划1990，美国国立卫生研究所和能源部投资30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱2000，完成草图2001年2月，公布人类基因组图谱的修订版2002，完成测序工作第四十三页，讲稿共五十二页哦国际人类基因组测序协作组（公共计划组）由国际人类基因组测序协作组（公共计划组）由6个个国家、国家、20个研究中心的个研究中心的2000多位科学工作者组成。多位科学工作者组成。国家承担的测序任务美国美国54%54%英国英国33%33%日本日本7%7%法国法国2.8%2.8%德国德国2.2%2.2%中国中国1%1%第四十四页，讲稿共五十二页哦 1999 1999年年9 9月月 中国获准加入人类基因组计划，中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的负责测定人类基因组全部序列的1%1%，负责第，负责第3 3号号染色体染色体3 3千万核苷酸的序列测定工作。中国是继千万核苷酸的序列测定工作。中国是继美、英、日、德、法之后第美、英、日、德、法之后第6 6个国际人类基因个国际人类基因组计划参与者，也是参与这一计划的唯一发组计划参与者，也是参与这一计划的唯一发展中国家。展中国家。第四十五页，讲稿共五十二页哦人类基因组计划1%测序中国实验室第四十六页，讲稿共五十二页哦2000年年6月月26日日 科学家公布人类科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解基因组工作草图，标志着人类在解读自身读自身“生命之书生命之书”的路上迈出了的路上迈出了重要一步。重要一步。第四十七页，讲稿共五十二页哦HGP对人类基因面貌的新发现对人类基因面貌的新发现1.基因数量少得惊人基因数量少得惊人2.人类基因组中存在人类基因组中存在“热点热点”和大片和大片“荒漠荒漠”3.三分之一为三分之一为“垃圾垃圾”DNA4.种族歧视毫无根据种族歧视毫无根据5.男性基因突变比例更高男性基因突变比例更高第四十八页，讲稿共五十二页哦 2000 2000年是基因组之年，完成了人类基因年是基因组之年，完成了人类基因组的工作框架图，完成了一系列模式生物和组的工作框架图，完成了一系列模式生物和微生物的基因组序列分析。微生物的基因组序列分析。2000 年 12 月美、英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。第四十九页，讲稿共五十二页哦三、后基因组学（postgenomics)完成一个生物体全部基因组测序后即进入功能基完成一个生物体全部基因组测序后即进入功能基因组学阶段，也称因组学阶段，也称后基因组阶段后基因组阶段详尽分析详尽分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式。因的表达及其调控模式。基因的识别、鉴定、克隆基因的识别、鉴定、克隆 基因结构、功能及其相互关系基因结构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究基因表达调控的研究第五十页，讲稿共五十二页哦（一）鉴定（一）鉴定DNA序列中的基因序列中的基因 ORF（二）（二）同源搜索同源搜索设计基因功能设计基因功能 （三）实验性设计基因功能（三）实验性设计基因功能 clon,knock-out,knock-in,clon,knock-out,knock-in,反义反义反义反义RNA,RNAi（四）描述基因表达模式（四）描述基因表达模式 主要具体内容包括以下方面主要具体内容包括以下方面:第五十一页，讲稿共五十二页哦感感谢谢大大家家观观看看第五十二页，讲稿共五十二页哦