第20章 高效 液相色谱法精选文档.ppt

第20章 高效 液相色谱法本讲稿第一页，共二十九页 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 适于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效适于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。分离分析方法。本讲稿第二页，共二十九页20.2 20.2 基本理论和条件选择基本理论和条件选择一、塔板理论一、塔板理论二、速率理论二、速率理论 三、三、HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择本讲稿第三页，共二十九页一、塔板理论一、塔板理论本讲稿第四页，共二十九页二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC对比）对比）1.1.本讲稿第五页，共二十九页2.本讲稿第六页，共二十九页图示back本讲稿第七页，共二十九页本讲稿第八页，共二十九页1.1.固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布选粒径小的、分布均匀的球形固定相（均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，）首选化学键合相，匀浆法装柱匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：柱温的选择：选室温选室温250C左右左右HPLC分离条件的选择分离条件的选择本讲稿第九页，共二十九页本讲稿第十页，共二十九页20.3 20.3 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法 一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPC）本讲稿第十一页，共二十九页本讲稿第十二页，共二十九页三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPC）（一）化学键合相（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（二）反相键合相色谱（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱本讲稿第十三页，共二十九页（一）化学键合相（一）化学键合相 P526利用化学反应将固定液的官能团键合在硅胶利用化学反应将固定液的官能团键合在硅胶载体表面载体表面特点：特点：1）不易流失）不易流失 2）热稳定性好）热稳定性好 3）化学性能好）化学性能好 4）载样量大）载样量大 5）适于梯度洗脱）适于梯度洗脱本讲稿第十四页，共二十九页（二）反相键合相色谱（二）反相键合相色谱 流动相极性流动相极性 固定相极性固定相极性1固定相：固定相：非极性的烷基键合相非极性的烷基键合相 C8柱，柱，C18柱（柱（ODS柱柱HPLC约约80%）非极性的烷基非极性的烷基C数越大，极性越低。数越大，极性越低。2流动相：流动相：极性大的甲醇极性大的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水，水，pH=283流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k，组分，组分tR4出柱顺序：极性大的组分先出柱出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱5适用：非极性适用：非极性中等极性的分子型化合物中等极性的分子型化合物本讲稿第十五页，共二十九页（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱 流动相极性流动相极性 固定相极性固定相极性1固定相：固定相：极性大的氨基或键合相极性大的氨基或键合相2流动相：极性小（同流动相：极性小（同LSC）例：正己烷例：正己烷 +氯仿氯仿-甲醇，氯仿甲醇，氯仿-乙醇乙醇3流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k,组分组分tR.4出柱顺序：结构相近组分，出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性大的组分后出柱5适用：分析极性大物质、糖类分子型化合物等适用：分析极性大物质、糖类分子型化合物等本讲稿第十六页，共二十九页（四）（四）反相离子对色谱反相离子对色谱(RPIC)流动相极性流动相极性 固定相极性固定相极性1固定相：固定相：非极性的烷基键合相非极性的烷基键合相2流动相：流动相：在反相色谱的流动相中加进离子对在反相色谱的流动相中加进离子对 试剂调节适当的试剂调节适当的pH。3 常用离子对试剂常用离子对试剂：分析样品 离于对试剂 碱 烷基磺酸钠烷基磺酸钠 酸 四丁基季铵盐四丁基季铵盐4适用：离子型的有机酸、生物碱及抗生素等。适用：离子型的有机酸、生物碱及抗生素等。本讲稿第十七页，共二十九页20.5 反相键合相色谱中的流动相反相键合相色谱中的流动相(1)GC：？：？(2(2）HPLCHPLC：选择流动相即改变流动相的组成与浓度配：选择流动相即改变流动相的组成与浓度配：选择流动相即改变流动相的组成与浓度配：选择流动相即改变流动相的组成与浓度配 比来提高分离度，途径有比来提高分离度，途径有比来提高分离度，途径有比来提高分离度，途径有提高提高提高提高n n：选择较小的：选择较小的：选择较小的：选择较小的u,u,长柱，采用长柱，采用长柱，采用长柱，采用dpdp小的小的小的小的 固定相，固定相，固定相，固定相，匀匀 浆装柱。浆装柱。提高提高提高提高：改变溶剂填料等。：改变溶剂填料等。提高提高提高提高k k：改变溶剂的配比、极性，使：改变溶剂的配比、极性，使：改变溶剂的配比、极性，使：改变溶剂的配比、极性，使k在在在在2 2一一一一5 5。梯度洗脱：在同一分析周期内。按一定程序不梯度洗脱：在同一分析周期内。按一定程序不梯度洗脱：在同一分析周期内。按一定程序不梯度洗脱：在同一分析周期内。按一定程序不 断改变流动相的浓度配比。断改变流动相的浓度配比。本讲稿第十八页，共二十九页1对流动相的要求：对流动相的要求：1）与固定液不反应）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的最理想的3）与检测器匹配：）与检测器匹配：UV ,荧光，电化学荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气本讲稿第十九页，共二十九页2洗脱方式洗脱方式 1）等度洗脱（恒定组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒定组成溶剂洗脱）类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱2）梯度洗脱：）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和配比在一定分析周期内不断变换流动相的种类和配比适适于于分分析析极极性性差差别别较较大大的的复复杂杂样样品品（类类似似GC的的程程序序升升温温（沸程较长样品）（沸程较长样品）本讲稿第二十页，共二十九页反相离子对梯度洗脱色谱法测定反相离子对梯度洗脱色谱法测定甲麻芩苷那敏片中甲麻芩苷那敏片中3 组分含量组分含量 色谱柱色谱柱:Inertsil ODS23(250 mm 4.6 mm,5m);进样量进样量:50L;流速流速:1 mL/min;检测波长检测波长:215 nm。流动相。流动相:0.12%辛烷磺酸钠溶液三辛烷磺酸钠溶液三乙胺乙胺(100 0.12,磷酸调磷酸调pH 至至4.13)甲醇甲醇(50 50)为流动相为流动相A,甲醇为流动相甲醇为流动相B。030 min 内流动相内流动相B 的比例由的比例由1%匀速递增至匀速递增至98%,30 min 以后以后,用流动相用流动相A进行洗脱。进行洗脱。本讲稿第二十一页，共二十九页20.6 20.6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪本讲稿第二十二页，共二十九页1输液泵：输液泵：本讲稿第二十三页，共二十九页2进样装置六通进样阀进样装置六通进样阀本讲稿第二十四页，共二十九页3 色谱柱色谱柱直径直径46mm,柱长柱长1030cm柱效评价：色谱系统适应性试验柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子）（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗柱再生：维护、保养、柱子的冲洗本讲稿第二十五页，共二十九页4检测器检测器 1）紫外检测器：特点）紫外检测器：特点 2）荧光检测器：）荧光检测器：3）示差折光检测器：）示差折光检测器：4）电化学检测器）电化学检测器 5）化学发光）化学发光本讲稿第二十六页，共二十九页光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器本讲稿第二十七页，共二十九页1)观察流动相流路观察流动相流路;2)开电源开关；开电源开关；3)启动泵、检测器启动泵、检测器4)设定分析流速及压力上下限；设定分析流速及压力上下限；5)将进样阀手柄向上扳动停将进样阀手柄向上扳动停load位置，下扳动最后停在位置，下扳动最后停在INJECT(采样采样)位置；位置；6)进样分析进样分析;7)记录数据与数据处理记录数据与数据处理;8)分析结束后将进样阀手柄置分析结束后将进样阀手柄置LOAD位置；位置；9)停停泵、泵、检测器；检测器；10)关闭电源关闭电源开关开关操作步骤操作步骤:本讲稿第二十八页，共二十九页小结小结n n掌握范式方程及分离度方程的物理意义掌握范式方程及分离度方程的物理意义n n掌握正相色谱反相色谱掌握正相色谱反相色谱n n掌握反相键合相色谱法的概念及实验条掌握反相键合相色谱法的概念及实验条件的选择件的选择n n掌握定量计算掌握定量计算外标法外标法内标法（内标法（内标对比法内标对比法）本讲稿第二十九页，共二十九页