高效液相色谱 (2)精选PPT讲稿.ppt

关于高效液相色谱(2)第一页，讲稿共一百一十一页哦定义定义色谱法色谱法(Chromatography)：利用组分在：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。两相间分配系数不同而进行分离的技术。第二页，讲稿共一百一十一页哦色谱法的分离原理色谱法的分离原理利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以及在两相间分配系数的差异,当两相相对移动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。两相中，固定不动的一相称固定相(Stationary phase)；移动的一相称流动相(Mobile phase)，携带样品流过整个系统的流体。第三页，讲稿共一百一十一页哦色谱发展史色谱发展史100年前，俄国的植物学家Tswett创立了色谱法。由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paperchromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layerchromatography,TLC)。特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gaschromatography,GC)特点：以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵敏度的检测器的出现，发展出了高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatography,HPLC）。第四页，讲稿共一百一十一页哦液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法v适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析的分析v流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用第五页，讲稿共一百一十一页哦一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱（一）分离原理（二）常用吸附剂（三）吸附剂和流动相的选择经典液相色谱经典液相色谱第六页，讲稿共一百一十一页哦（一）分离原理（一）分离原理各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离现分离（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质1.硅胶2.氧化铝3.聚酰胺第七页，讲稿共一百一十一页哦1.硅胶硅胶结构结构：内部硅氧交联结构多孔结构表面有硅醇基氢键作用吸附活性中心特性特性：1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性，吸附能力强极性吸附中心，不易洗脱2）吸水失活105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力最大500OC烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力适用适用适用适用：分析酸性或中性物质第八页，讲稿共一百一十一页哦2.氧化铝氧化铝碱性氧化铝pH910适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH7.5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH45适于分析酸性、中性物质3.聚酰胺聚酰胺氢键作用氢键能力强，组分越后出柱第九页，讲稿共一百一十一页哦（三）吸附剂和流动相的选择：（三）吸附剂和流动相的选择：依据被测组分、吸附剂和流动相的性质依据被测组分、吸附剂和流动相的性质1.被测组分性质（极性大小）：被测组分性质（极性大小）：烃-羧酸，醇2.吸附剂的活性：吸附剂的活性：吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力强强极性物质强极性物质选择弱吸附剂选择弱吸附剂弱极性物质弱极性物质选择强吸附剂选择强吸附剂3.流动相的极性：流动相的极性：流动相极性大，对被测组分的洗脱能力大“相似相溶相似相溶”原则原则：根据组分性质、吸附剂的活根据组分性质、吸附剂的活性，性，选择适当极性的流动相选择适当极性的流动相第十页，讲稿共一百一十一页哦4.4.三者关系图示三者关系图示：组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性第十一页，讲稿共一百一十一页哦二、薄层色谱法二、薄层色谱法（一）概述（二）定性参数（三）吸附剂的选择（四）展开剂的选择（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析第十二页，讲稿共一百一十一页哦（一）概述（一）概述1定义定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程：铺板活化点样展开定位(定性)/洗脱(定量)3分离机制：吸附吸附（分配，离子交换，空间排阻）4特点：分析快速、灵敏、显色方便5应用：药物杂质检查、纯度测定第十三页，讲稿共一百一十一页哦第十四页，讲稿共一百一十一页哦L0L1L2第十五页，讲稿共一百一十一页哦（二）定性参数（二）定性参数1.比移值比移值Rf讨论讨论Rf与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为第十六页，讲稿共一百一十一页哦1）K大，Rf小 2）薄层板一定，对于极性组分 展开剂极性大，Rf大（容易洗脱）展开剂极性小，Rf小（不容易洗脱）3）Rf范围：0 Rf 1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）Rf =0.20.8（常用）0.30.5（最佳）第十七页，讲稿共一百一十一页哦2.相对比移值相对比移值Rs参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可为样品中已知组分相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1第十八页，讲稿共一百一十一页哦（三）吸附剂的选择（三）吸附剂的选择根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强弱极性吸附剂被测物极性弱强极性吸附剂（四）展开剂的选择（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择）根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性第十九页，讲稿共一百一十一页哦（五）薄层板的制备（五）薄层板的制备硅胶G自含粘和剂硅胶H不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶FH254含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶FH365含荧光剂，365nm紫外光照发光（六）定性与定量分析（六）定性与定量分析定性分析日光，紫外光，显色定量分析洗脱法，薄层扫描法第二十页，讲稿共一百一十一页哦三、纸色谱法三、纸色谱法将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：同液-液分配色谱定性参数：Rf Rf f与组分性质、流动相及溶解度有关极性组分极性组分易保留，易保留，Rf f小（流动相极性，Rf f）非极性组分易流出，R Rf f大（流动相极性大（流动相极性，R Rf f）第二十一页，讲稿共一百一十一页哦高效液相色谱知识高效液相色谱知识第二十二页，讲稿共一百一十一页哦 经典经典经典经典LCLCHPLCHPLC柱之内径柱之内径柱之内径柱之内径15cm15cm0.4cm0.4cm长度长度长度长度50100cm50100cm1550cm1550cm填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度150150 m200m200 m m 4 4 m10m10 mm使用压力使用压力使用压力使用压力110atm110atm50200atm50200atm分离时间分离时间分离时间分离时间0.5h0.5h天天天天10min10min经典经典LC与与HPLC比较比较HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便 HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 第二十三页，讲稿共一百一十一页哦GCGC与与HPLCHPLC比较比较GCHPLC流动相流动相惰惰性性气气体体（无无亲亲和和性性，只只起起运载作用）运载作用）气体、沸点较低的化合物气体、沸点较低的化合物不不同同极极性性的的液液体体（有有一一定定亲和作用）亲和作用）温温度度较高较高一般室温一般室温分析对象分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物大分子、高分子化合物第二十四页，讲稿共一百一十一页哦高效液相色谱的固定相和流动相（）固定相高效液相色谱固定相依据承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。第二十五页，讲稿共一百一十一页哦1.表面多孔型固定相基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。特点：多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。第二十六页，讲稿共一百一十一页哦2全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的LichrosorbALOXT。特点：颗粒很细（5-10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析第二十七页，讲稿共一百一十一页哦第二十八页，讲稿共一百一十一页哦（二）流动相 高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-220-2列出了一列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。第二十九页，讲稿共一百一十一页哦第三十页，讲稿共一百一十一页哦（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加501OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第三十一页，讲稿共一百一十一页哦高效液相色谱法分类及分离机理高效液相色谱法分类及分离机理分配色谱样品组分在吸附于惰性载体上的固定液和流动相之间分配系数不同键合相色谱样品组分在键合于惰性载体上的固定液和流动相之间的分配系数不同吸附色谱样品组分对固定相表面吸附力不同体积排阻色谱利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开离子交换色谱不同离子与固定相上相反电荷间的作用力大小不同亲和色谱利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法第三十二页，讲稿共一百一十一页哦（一）分配色谱（partition chromatography）原理：固定液吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相分配而实现分离。适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液，一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。第三十三页，讲稿共一百一十一页哦流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分正相分配色谱配色谱和反相分配色谱反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。第三十四页，讲稿共一百一十一页哦反相色谱最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水甲醇体系：大约60水的时候粘度最大水乙腈体系：35水的时候粘度最大。第三十五页，讲稿共一百一十一页哦(二)键合相色谱（Covalentstationary phase chromatography）为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。目前应用最广泛的一种固定相，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。键合固定相优点：对极性有机溶剂有良好的化学稳定性；使色谱柱的柱效高、寿命长；实验重现性好；几乎适于各种有机化合物的分离；可以梯度洗脱。缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。第三十六页，讲稿共一百一十一页哦1键合固定相类型用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅硅胶胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)反应成键,可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等.第三十七页，讲稿共一百一十一页哦2键合固定相的制备（l）硅酸酯（Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的键合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：Si0HROHSiORH20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。（2）SiC或Si一N共价键合固定相 制备反应如下 第三十八页，讲稿共一百一十一页哦共价键键合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4-8范围内。第三十九页，讲稿共一百一十一页哦（3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相制备反应如下：这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，pH=2-8范围内正常工作，应用较广泛。第四十页，讲稿共一百一十一页哦3反相键合相色谱法反相键合相色谱固定相极性流动相极性固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。流动相：极性较强的溶剂，如甲醇一水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。适于分离非极性、弱极性离子型样品，是当今液相色谱的最主要分离模式。若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。第四十一页，讲稿共一百一十一页哦4.正相键合相色谱法正相键合相色谱固定相极性流动相极性固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。流动相：非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如醇）适合分离脂溶、水溶性的极性、强极性化合物。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。第四十二页，讲稿共一百一十一页哦5.离子性键合相色谱法v固定相：以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2N（CH3)2等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；v流动相：一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。第四十三页，讲稿共一百一十一页哦 第四十四页，讲稿共一百一十一页哦（三）液一固吸附色谱法(LSAC)分离原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质，表面有吸附中心，样品组分与流动相竞争吸附中心。各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同而实现分离。当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子），在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS第四十五页，讲稿共一百一十一页哦达平衡时,有其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。第四十六页，讲稿共一百一十一页哦固定相：通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。应用：对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。第四十七页，讲稿共一百一十一页哦极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：氟碳化合物饱和烃 烯烃芳烃有机卤化物醚硝基化合物腈叔胺酯醛酮醇伯胺酰胺羧酸磺酸第四十八页，讲稿共一百一十一页哦正相正相HPLCHPLC（normal phase HPLCnormal phase HPLC）：由极性固定相和非极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相反相HPLCHPLC（reversed phase HPLCreversed phase HPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流动相是甲醇和乙腈。第四十九页，讲稿共一百一十一页哦（四）体积排阻色谱（SEC，size exclusion chromatography）排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。第五十页，讲稿共一百一十一页哦原理：以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。根据样品性质分类：凝胶过滤（GFC）用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核酸、多糖。凝胶渗透（GPC）用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。SEC主要依据分子量大小进行分离，因此与样品、流动相间的相互作用无关。不采用改变流动相的组成来改善分离度。第五十一页，讲稿共一百一十一页哦固定相排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。（2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。（3）刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。第五十二页，讲稿共一百一十一页哦流动相1）排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品。2）与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。3）溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。4）选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。第五十三页，讲稿共一百一十一页哦（五）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。第五十四页，讲稿共一百一十一页哦分离原理：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。第五十五页，讲稿共一百一十一页哦1离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：第五十六页，讲稿共一百一十一页哦达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：式中Ar，Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，A、B则代表它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般形式：R一ABRBA第五十七页，讲稿共一百一十一页哦对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+对于季铵型强阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF第五十八页，讲稿共一百一十一页哦2固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分，再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。第五十九页，讲稿共一百一十一页哦分类分类按离子交换剂类型：按离子交换剂类型：1.1.强阳离子交换剂强阳离子交换剂 以磺酸基为代表（以磺酸基为代表（-SO-SO3 3-)2.2.强阴离子交换剂强阴离子交换剂 以季胺基为代表以季胺基为代表 (-NR(-NR3 3+)3.3.弱阳离子交换剂弱阳离子交换剂 以羧酸基为代表以羧酸基为代表 (-COO(-COO-)4.4.弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂 以二乙基氨基为代表以二乙基氨基为代表(-CH(-CH2 2N(CN(C2 2H H5 5)2 2H H+)第六十页，讲稿共一百一十一页哦按固定相制作方法：按固定相制作方法：1.多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂2.薄膜型离子交换树脂薄膜型离子交换树脂3.表面多孔型离子交换树脂表面多孔型离子交换树脂4.离子交换键合固定相离子交换键合固定相第六十一页，讲稿共一百一十一页哦（l）多孔型离子交换树脂 主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为5-20m，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型离子交换树脂 是在直径约30m的固体惰性核上，凝聚1-2m厚的树脂层。（3）表面多孔型离子交换树脂 是在固体惰性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。（4）离子交换键合固定相 是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。第六十二页，讲稿共一百一十一页哦流动相 1）离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。2）通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3C00-OH-F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+MgAg+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十 差别不如阴离子明显。3）关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。第六十三页，讲稿共一百一十一页哦(六)亲和色谱法（AC）1）亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。2）通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。3）固载化的配基只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。图20-9为亲和色谱法示意图。第六十四页，讲稿共一百一十一页哦固定相：固定相：载体和配基载体和配基载体：载体：具有多孔网状结构，具有相当数量可供耦联的基团，具有多孔网状结构，具有相当数量可供耦联的基团，能结合配基，无吸附性，均一，有一定硬度，性质稳定。能结合配基，无吸附性，均一，有一定硬度，性质稳定。常用的有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、常用的有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、多孔玻璃多孔玻璃配基：配基：对亲和物有专一的亲和力，有能与载体相连的基团，对亲和物有专一的亲和力，有能与载体相连的基团，如腺嘌呤核苷酸吸附剂，核苷酸吸附剂等如腺嘌呤核苷酸吸附剂，核苷酸吸附剂等流动相：流动相：缓冲溶液缓冲溶液应用：应用：生物大分子分离和分析生物大分子分离和分析第六十五页，讲稿共一百一十一页哦分离类型的选择分离类型的选择1根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用排阻法为最佳。2根据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸第六十六页，讲稿共一百一十一页哦附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。3根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物或不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。现列表作为选择分离类型的参考。第六十七页，讲稿共一百一十一页哦液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表溶于水排阻色谱，水为流动相相对分子质量2000不溶于水排阻色谱，非水流动相同系物分配色谱不溶于水异构体吸附色谱样品分子大小差异排阻色谱反相液一液色谱相对分子质量溶于水，不离解2000排阻色谱，水为流动相碱阳离子交换色谱溶于水，可离解酸阴离子交换色谱第六十八页，讲稿共一百一十一页哦HPLC仪器仪器:HPLC仪器1.流动相系统4.其他辅助系统2.分离系统3.检测系统第六十九页，讲稿共一百一十一页哦Agilent 1100系列高效液相色谱系统系列高效液相色谱系统 第七十页，讲稿共一百一十一页哦储液槽储液槽第七十一页，讲稿共一百一十一页哦贮液槽贮液槽材料：应当耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚酮（PEEK）。贮液槽容积：0.5-2.0L。要求：1.贮液槽放置位置要高于泵体，以保持一定的输液静压。2.贮液槽在使用中应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，并可防止空气中的CO2,O2重新溶解于脱气的流动相中。第七十二页，讲稿共一百一十一页哦采用采用“HPLC”级溶剂级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配与检测器相匹配流动相的选择第七十三页，讲稿共一百一十一页哦溶剂前处理过滤过滤：0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时其在使用无机盐配制的缓冲液时脱气脱气目的：除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡目的：除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡第七十四页，讲稿共一百一十一页哦脱气装置脱气装置氦气脱气法在线脱气法第七十五页，讲稿共一百一十一页哦脱气脱气吹氦气脱气法适于给所有溶剂脱气，脱气效率高，但价格昂贵。(如上图：左图)加热回流法抽真空脱气法外接真空泵，对溶剂抽真空。由于抽真空会引起溶剂组成的改变，故不适于混合溶剂。因此要对每种溶剂预先脱气后再进行混合。超声波脱气法将溶剂倒入超声波清洗器中，用超声波震荡赶走气泡。脱气效果最差。以上方法均为离线脱气，随溶剂存放时间延长又会有空气进入溶剂。在线真空脱气法将真空脱气装置串接到贮液罐于高压泵之间，实现溶剂在进入高压泵之前的连续脱气。脱气效果最优(如上图:右图)。第七十六页，讲稿共一百一十一页哦高压输液泵高压输液泵恒流泵第七十七页，讲稿共一百一十一页哦高压输液泵高压输液泵在高效液相色谱分析中，色谱柱装填5-10m的固定相，对流动相的通过有很大的阻力。高压输液泵的作用就是用较高的压力推动流动相进入色谱柱。高压输液泵分两类：恒流泵恒压泵恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。（1）单柱塞注射型泵（2）双柱塞往复型并联泵恒压泵，是输出恒定压力的泵。以压缩空气为驱动力，高压推动活塞往复运动完成流动相的吸入和输出。以改变气体压力调节载液流速。第七十八页，讲稿共一百一十一页哦等度洗脱等度洗脱输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器单单一或混合溶一或混合溶剂剂第七十九页，讲稿共一百一十一页哦梯度洗脱梯度洗脱A泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器B泵泵AB时间时间B浓浓度度第八十页，讲稿共一百一十一页哦分析分析时间长时间长分离度差分离度差 MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脱等度洗脱第八十一页，讲稿共一百一十一页哦95%30%甲甲醇醇浓浓度度梯度洗脱梯度洗脱第八十二页，讲稿共一百一十一页哦混合器混合器低低压压梯度比例梯度比例阀阀高高压压梯度梯度低低压压梯度梯度脱气机脱气机高压高压/低压梯度系统低压梯度系统第八十三页，讲稿共一百一十一页哦高压梯度系统高压梯度系统梯度准确度好梯度准确度好系统复杂系统复杂(需两台或三台泵需两台或三台泵)低压梯度系统低压梯度系统系统简单系统简单需在线脱气机需在线脱气机存在时间滞后效应存在时间滞后效应高压高压/低压梯度系统低压梯度系统第八十四页，讲稿共一百一十一页哦Agilent四元梯度泵第八十五页，讲稿共一百一十一页哦进样器手动进样器手动进样器自动进样器自动进样器第八十六页，讲稿共一百一十一页哦手动进样器的原理图 装填状态装填状态进样状态进样状态第八十七页，讲稿共一百一十一页哦部分注入和全量注入部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20l的定量环最多进样10l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。第八十八页，讲稿共一百一十一页哦 手动进样器操作注意点：手动进样器操作注意点：1 1）进样应使用液相色谱专用平头进样针）进样应使用液相色谱专用平头进样针2 2）进样时，进样针应插到底）进样时，进样针应插到底3 3）转动手柄时应尽快，不要停留在中途）转动手柄时应尽快，不要停留在中途4 4）样品溶液）样品溶液pHpH小于小于1010,常用密封垫的材质适用常用密封垫的材质适用pH10,pH10,否则否则换特氟隆材质的密封垫换特氟隆材质的密封垫pH10-13pH10-13第八十九页，讲稿共一百一十一页哦交叉污染微量注射器微量注射器红色表示残留样品红色表示残留样品第九十页，讲稿共一百一十一页哦手动进样法便捷的方法（不需清洗）便捷的方法（不需清洗）1.1.进样状态下插入微量注射器进样状态下插入微量注射器 2.2.切到装填状态切到装填状态 3.3.注入样品注入样品 4.4.切回到进样状态切回到进样状态第九十一页，讲稿共一百一十一页哦自动进样器自动进样器自动进样器适合大量样品分析。由计算机控制取样、进样、复位、样品管路清洗、样品盘转动程序自动进行。第九十二页，讲稿共一百一十一页哦色谱柱色谱柱第九十三页，讲稿共一百一十一页哦色谱柱色谱柱材质：内壁抛光的不锈钢。直型柱内径几个毫米；长度10-50cm；填料颗粒度5-10m。根据被分离样品的性质,选择不同填料的色谱柱。轻拿轻放，注意方向，柱子使用用前后要充分平衡，避免干柱。第九十四页，讲稿共一百一十一页哦柱温箱分析结果重现性好分析结果重现性好提高柱效提高柱效降低柱压降低柱压保证检测稳定性保证检测稳定性柱温控制的优点：柱温控制的优点：第九十五页，讲稿共一百一十一页哦检测器检测器检测器作用检测器作用用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置第九十六页，讲稿共一百一十一页哦紫外可见检测器（紫外可见检测器（UV/VISUV/VIS）二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（PDAPDA）示差检测器（示差检测器（RIDRID）电导检测器（电导检测器（CDDCDD）荧光检测器（荧光检测器（RFRF）电化学检测器（电化学检测器（L-ECDL-ECD）质谱检测器（质谱检测器（MSMS）蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELS