胚胎干细胞 (2)讲稿.ppt

关于胚胎干细胞(2)第一页，讲稿共六十九页哦一、概述一、概述 n基本概念基本概念n干细胞分化发育干细胞分化发育 n干细胞分类干细胞分类 n干细胞的特点干细胞的特点n胚胎性干细胞类型胚胎性干细胞类型第二页，讲稿共六十九页哦干细胞干细胞 n干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。n包括胚胎干细胞和成体干细胞。包括胚胎干细胞和成体干细胞。n干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。（一）基本概念（一）基本概念第三页，讲稿共六十九页哦干细胞干细胞功功 能能 组织发生组织发生 全能干细胞全能干细胞 多能干细胞多能干细胞 专能干细胞专能干细胞 胚胎干细胞胚胎干细胞 组织干细胞组织干细胞 （二）干细胞分类（二）干细胞分类 第四页，讲稿共六十九页哦全能干细胞全能干细胞Totipotent stem cells 具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官。胞，这些细胞构成人体的各种组织器官。八细胞阶段八细胞阶段八细胞阶段八细胞阶段第五页，讲稿共六十九页哦多能干细胞多能干细胞Multipotent stem cells 具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，即能够形成具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。第六页，讲稿共六十九页哦专能干细胞专能干细胞 多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一类型的细胞。又称单能干细胞。类型的细胞。又称单能干细胞。如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。第七页，讲稿共六十九页哦胚胎干细胞胚胎干细胞Embryonic stem(ES)CellsEmbryonic stem(ES)Cells 来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞体发育，又称为万能细胞(Multipotent stem cells)。第八页，讲稿共六十九页哦组织干细胞组织干细胞 Tissue-specific stem cellTissue-specific stem cell 指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(Adult stem Adult stem cellscells)。第九页，讲稿共六十九页哦（三）干细胞分化发育（三）干细胞分化发育n干细胞的增殖速度一般比较慢。干细胞的增殖速度一般比较慢。n一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化过程，以适应组织一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化过程，以适应组织器官生长、发育和修复的需要，当干细胞进入分化期时，其增器官生长、发育和修复的需要，当干细胞进入分化期时，其增殖速度开始逐渐加快。殖速度开始逐渐加快。n干细胞增殖具有自稳性，指干细胞会自我更新维持自身数目干细胞增殖具有自稳性，指干细胞会自我更新维持自身数目的恒定，这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。的恒定，这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。第十页，讲稿共六十九页哦发育早期发育早期囊胚（受精后囊胚（受精后5 57 7天）中未分化的细胞。天）中未分化的细胞。囊胚含有约囊胚含有约140140个细胞，中心囊胚腔，腔内一侧为内细胞群个细胞，中心囊胚腔，腔内一侧为内细胞群可以发育成各种组织器官，具有全能性。可以发育成各种组织器官，具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，称之为胚胎干细胞。当内细胞群在培养皿中培养时，称之为胚胎干细胞。第十一页，讲稿共六十九页哦胚胎干细胞继续进行分化，形成专能干细胞在胎儿、儿童和成人组织中的专能干细胞统称为成体干细胞在特定的外加条件下，一种组织的的成体干细胞可以“横向分化”成其它组织的功能细胞。第十二页，讲稿共六十九页哦第十三页，讲稿共六十九页哦干细胞分化为不同血细胞干细胞分化为不同血细胞 第十四页，讲稿共六十九页哦（四）干细胞的特点（四）干细胞的特点n干细胞具有自我更新和分化潜能。干细胞具有自我更新和分化潜能。n干细胞体积小，核质比例大，端粒酶活性高，能无限增殖。干细胞体积小，核质比例大，端粒酶活性高，能无限增殖。n干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。n干细胞通过两种方式生长。干细胞通过两种方式生长。第十五页，讲稿共六十九页哦对称分裂对称分裂 非对称分裂非对称分裂 两种方式生长两种方式生长n形成两个相同的形成两个相同的干细胞。干细胞。n调节分化蛋白不均匀地分配，一个子细胞不可逆的走向分化终端成为功能专一调节分化蛋白不均匀地分配，一个子细胞不可逆的走向分化终端成为功能专一的分化细胞；的分化细胞；n另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。第十六页，讲稿共六十九页哦（五）胚胎干细胞类型（五）胚胎干细胞类型胚胎干细胞胚胎干细胞全能性胚胎性干细胞全能性胚胎性干细胞 多能性胚胎性干细胞多能性胚胎性干细胞 在胚胎发育最早阶段，各个卵裂球发育潜能几乎是等同的，每个细胞在胚胎发育最早阶段，各个卵裂球发育潜能几乎是等同的，每个细胞可独立地产生完整的机体；可独立地产生完整的机体；能诱导分化为几乎所有类型的细胞，具有很强的生物学可塑性，已属于多能性，能诱导分化为几乎所有类型的细胞，具有很强的生物学可塑性，已属于多能性，略强于组织干细胞。略强于组织干细胞。第十七页，讲稿共六十九页哦组织来源组织来源 胚胎性癌细胞胚胎性癌细胞，EC embryonal carcinoma cell全能性胚胎干细胞全能性胚胎干细胞，ESembryonic stem cell多能性胚胎干细胞多能性胚胎干细胞，EG embryonic germ cell第十八页，讲稿共六十九页哦二、二、ESES细胞和细胞和EGEG细胞培养建系技术细胞培养建系技术 n饲养层细胞培养法饲养层细胞培养法 n无饲养层细胞培养法无饲养层细胞培养法 n胚胎细胞来源胚胎细胞来源 nESES细胞和细胞和EGEG细胞的培养过程细胞的培养过程 nESES细胞和细胞和EGEG细胞系的特性和鉴定细胞系的特性和鉴定 第十九页，讲稿共六十九页哦n体外培养建系体外培养建系ESES细胞和细胞和EGEG细胞的技术以小鼠最为成熟，成功率最高。细胞的技术以小鼠最为成熟，成功率最高。n培养原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团，并建立体外适合其增殖和培养原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团，并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。抑制分化的培养系统。n早期胚胎细胞离体后极易发生分化，解决阻止其分化、确保维持其全能性或多早期胚胎细胞离体后极易发生分化，解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性是关键。能性是关键。第二十页，讲稿共六十九页哦分化抑分化抑制物制物饲养层细胞（饲养层细胞（feeder layerfeeder layer）特殊细胞的条件培养液（特殊细胞的条件培养液（conditioned mediumconditioned medium）分化抑制因子（分化抑制因子（differentiation inhibitory differentiation inhibitory factorfactor，DIFDIF）第二十一页，讲稿共六十九页哦体外培养体外培养ESES和和EGEG细胞两大方法细胞两大方法 饲养层细胞培养法饲养层细胞培养法 无饲养层细胞培养法无饲养层细胞培养法 原代或初期培养阶段一般都需要原代或初期培养阶段一般都需要依赖于能分泌必需生长因子的饲依赖于能分泌必需生长因子的饲养层细胞。养层细胞。以添加以添加LIFLIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含FCSFCS的正常培养液，来的正常培养液，来替代饲养细胞。替代饲养细胞。第二十二页，讲稿共六十九页哦（一）饲养层细胞培养法（一）饲养层细胞培养法 常常用用的的饲饲养养层层细细胞胞 MEFMEF细胞细胞 STOSTO细胞细胞 取自各种品系小鼠的取自各种品系小鼠的12dpc的胚胎，经剪碎和胰蛋白的胚胎，经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分离细胞培养为单层散布的成纤维细胞。酶消化，常规分离细胞培养为单层散布的成纤维细胞。经丝裂霉素经丝裂霉素C处理终止细胞分裂后，用作处理终止细胞分裂后，用作ES细胞培养细胞培养的饲养层。的饲养层。来自来自SIM小鼠（小鼠（S）胚胎的对硫代鸟嘌呤）胚胎的对硫代鸟嘌呤（tyioguanine,T）和乌本苷（）和乌本苷（ouabain,O）有抗性的）有抗性的成纤维细胞系，主要分泌干细胞生长因子（成纤维细胞系，主要分泌干细胞生长因子（SCF）和白血）和白血病抑制因子（病抑制因子（LIF）。）。用作用作ES细胞或细胞或EGEG细胞培养的饲养层的细胞培养的饲养层的MEF或或STO细胞均需用细胞均需用10mg/L丝裂丝裂霉素霉素C在在37处理处理4h，用前经，用前经PBS彻底洗涤。彻底洗涤。第二十三页，讲稿共六十九页哦（二）无饲养层细胞培养法（二）无饲养层细胞培养法 小鼠小鼠ESES细胞细胞培养培养液液 n直接在直接在ES细胞基础培养液中加入重组细胞基础培养液中加入重组LIF；nBuffalo大鼠肝细胞条件培养液（大鼠肝细胞条件培养液（BRLCM）；）；n23周幼年大鼠心肌细胞条件培养液（周幼年大鼠心肌细胞条件培养液（RHCM）。）。第二十四页，讲稿共六十九页哦n无饲养层的无饲养层的ES细胞培养系统细胞培养系统 n23份细胞条件培养液份细胞条件培养液n12份新鲜的份新鲜的ES细胞培养液细胞培养液n10%20%胎牛血清胎牛血清 第二十五页，讲稿共六十九页哦n在胚胎干细胞原代和建系初期，培养在胚胎干细胞原代和建系初期，培养ES/EG细胞的成功率不高，还需补细胞的成功率不高，还需补充适当的生长因子。建系成功后，可使用无饲养层培养法。充适当的生长因子。建系成功后，可使用无饲养层培养法。n不同种属的不同种属的ES/EG细胞对生长因子的要求不同，如人细胞对生长因子的要求不同，如人ES细胞不能和细胞不能和LIF起反应，难以抑制人起反应，难以抑制人ES细胞的分化。细胞的分化。第二十六页，讲稿共六十九页哦（三）胚胎细胞来源（三）胚胎细胞来源 n不同胚胎发育不同胚胎发育速度和方式存在速度和方式存在较大差异。较大差异。n小鼠多用小鼠多用34天的胚泡或天的胚泡或23天的桑椹胚，天的桑椹胚，n猪取猪取810天的胚泡，天的胚泡，n绵羊取绵羊取89天的胚泡，天的胚泡，n人和牛取人和牛取78天的胚泡。天的胚泡。体外授精胚胎或重构胚胎在体外培养至所需发育阶段时，也是体外授精胚胎或重构胚胎在体外培养至所需发育阶段时，也是ES细胞细胞培养的有效材料来源。培养的有效材料来源。第二十七页，讲稿共六十九页哦n小鼠采用超排卵途径收集胚胎小鼠采用超排卵途径收集胚胎 雌性成年小鼠注射雌性成年小鼠注射5U孕马血清促性腺激素（孕马血清促性腺激素（MPS），），48h后再注射后再注射5U人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激素（HCG）；）；与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为0天（即天（即0.5dpc）；）；第三天至第四天中午（即第三天至第四天中午（即3.5 dpc4.5 dpc）分别剖取孕鼠子宫，冲出早）分别剖取孕鼠子宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立期胚泡，进一步分离培养建立ES细胞系；细胞系；剖取发育至剖取发育至8.5 dpc10.5 dpc时的胚胎，可建立小鼠时的胚胎，可建立小鼠EG细胞细胞系。系。第二十八页，讲稿共六十九页哦n人早期胚胎和生殖腺采集人早期胚胎和生殖腺采集 新鲜或冷冻保存的受精卵或卵裂期人胚培养至胚泡期，进一步分新鲜或冷冻保存的受精卵或卵裂期人胚培养至胚泡期，进一步分离离ICM细胞，可建立人细胞，可建立人ES细胞系；细胞系；经人流途径获取经人流途径获取78天胚泡或天胚泡或59周胚胎的生殖腺，从中分别分离和培周胚胎的生殖腺，从中分别分离和培养人养人ES和和EG细胞系。细胞系。第二十九页，讲稿共六十九页哦（四）（四）ES细胞和细胞和EG细胞的培养过程细胞的培养过程 nES细胞的培养过程细胞的培养过程 基本培养液基本培养液nDMEM液液n 15%20%FCSn0.1mmol/L巯基乙醇巯基乙醇n50U/ml青霉素、青霉素、50ug/ml链霉素链霉素第三十页，讲稿共六十九页哦将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单层层MEF细胞的培养皿中细胞的培养皿中 用免疫手术法分离胚泡的用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离出细胞，或用常规培养法分离出ICM细胞细胞进一步培养。进一步培养。培养培养23天天 第三十一页，讲稿共六十九页哦免疫手术法免疫手术法 44.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分化的的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。导致细胞发生免疫溶解。具体操作如下：具体操作如下：第三十二页，讲稿共六十九页哦体外培养的胚泡，用酸性体外培养的胚泡，用酸性Tyrodes液（液（pH2.5）处理，去除透明带；）处理，去除透明带；Hanks洗涤，加入兔抗洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗小鼠脾脏细胞抗血清（抗H2b）；）；移至含新鲜豚鼠血清的培养液，移至含新鲜豚鼠血清的培养液，Hanks液洗涤后，移至液洗涤后，移至96孔铺有孔铺有MEF或或STO饲养层细胞和饲养层细胞和DMEM基本培养基本培养液的板内进一步培养。液的板内进一步培养。30min胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具细胞不具H2b抗原，抗原，细胞完整；细胞完整；30min第三十三页，讲稿共六十九页哦常规培养法常规培养法 未去透明带的胚泡培养未去透明带的胚泡培养34天，天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来；细胞团从贴壁胚泡内长出来；胰蛋白酶和胰蛋白酶和EDTA混合消化液在混合消化液在37消化消化5min；解离的细胞团移至滋养层的解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团；到巢状胚胎干细胞团；胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。细胞。视视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。第三十四页，讲稿共六十九页哦nEG细胞的培养过程细胞的培养过程 哺乳动物原始生殖细胞（哺乳动物原始生殖细胞（PGC）最早发生于近尿囊基部）最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内，随着胚胎发育和纵向转折，卵黄囊的一部分的卵黄内胚层内，随着胚胎发育和纵向转折，卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠，成为胚胎的后肠，PGC取材主要根据其在不同物种的早期胚取材主要根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。胎中所处迁移位置而定。第三十五页，讲稿共六十九页哦1、原始生殖细胞的分离和原代培养、原始生殖细胞的分离和原代培养 收集收集8.510.5dpc小鼠胚胎，用小鼠胚胎，用DHanks液轻洗后，在解剖镜下用镊液轻洗后，在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞（子剖取包含原始生殖细胞（PGC）的生殖嵴组织；）的生殖嵴组织；以以0.02%EDTA液孵育含液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织，细胞的生殖嵴组织，37,15min；吸管轻吹打散，接种于铺有滋养层的吸管轻吹打散，接种于铺有滋养层的4孔培养板内。孔培养板内。第三十六页，讲稿共六十九页哦基本培养液基本培养液nDMEM液液n 15%20%FCSn0.1mmol/L巯基乙醇巯基乙醇n50U/ml青霉素、青霉素、50ug/ml链霉素链霉素n2mmol/L谷氨酰胺、谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠丙酮酸钠第三十七页，讲稿共六十九页哦2、滋养层细胞、滋养层细胞 宜用宜用8代以内的小鼠代以内的小鼠MEF细胞或细胞或STO细胞系。细胞系。用前经用前经10ug/ml丝裂霉素丝裂霉素C在在37处理处理23h；接种于包被接种于包被0.1%明胶的培养板或细胞瓶内，培养液明胶的培养板或细胞瓶内，培养液为含为含10%小牛血清的小牛血清的DMEM。第三十八页，讲稿共六十九页哦3、EG细胞纯化和建系细胞纯化和建系 培养物在滋养层细胞上分裂增殖，培养物在滋养层细胞上分裂增殖，46天后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞天后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新滋养层细胞上增殖；团用胰蛋白酶消化并转移至新滋养层细胞上增殖；重复用胰蛋白酶消化并转移至新的滋养层细胞，经过重复用胰蛋白酶消化并转移至新的滋养层细胞，经过23次过程，一般可产次过程，一般可产生巢状（生巢状（nests）生长的干细胞集落；）生长的干细胞集落；最后将它转移到铺有滋养层细胞的培养瓶内进一步扩增，此时培养液中可最后将它转移到铺有滋养层细胞的培养瓶内进一步扩增，此时培养液中可减少或省略减少或省略LIF、SCF和和bFGF等生长因子。等生长因子。第三十九页，讲稿共六十九页哦（五）五）ES细胞和细胞和EG细胞系的特性和鉴定细胞系的特性和鉴定 1形形态态学学特特征征 n将克隆挑出，用胰蛋白酶消化并接种于新的滋养层或特定的将克隆挑出，用胰蛋白酶消化并接种于新的滋养层或特定的条件培养液中，培养条件培养液中，培养34天后，分散的细胞又重新呈岛状或天后，分散的细胞又重新呈岛状或巢状的细胞克隆。巢状的细胞克隆。n圆形或卵圆形，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或圆形或卵圆形，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态；巢状群体生长形态；n呈现一个或几个核仁、核质比例高；呈现一个或几个核仁、核质比例高；第四十页，讲稿共六十九页哦n不同种的不同种的ES细胞形态学特征有所不同。细胞形态学特征有所不同。n人体人体ES细胞呈扁平状群落，而且细胞界限清楚；细胞呈扁平状群落，而且细胞界限清楚；n小鼠小鼠ES细胞或细胞或EG细胞虽然聚集成团，但呈悬浮状态，细胞界限也细胞虽然聚集成团，但呈悬浮状态，细胞界限也较清楚；较清楚；n猪猪ES细胞具有特征性细胞骨架蛋白表达的上皮细胞表型。细胞具有特征性细胞骨架蛋白表达的上皮细胞表型。第四十一页，讲稿共六十九页哦2、发育全能性和分化潜能鉴定、发育全能性和分化潜能鉴定 免免疫疫组组织织化化学学n时期专一性胚胎抗原（时期专一性胚胎抗原（SSEA）n碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）nOct4基因表达基因表达 n端粒酶（端粒酶（telomerase）n体外分化潜能体外分化潜能 n体内分化体内分化 第四十二页，讲稿共六十九页哦n时期专一性胚胎抗原时期专一性胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen,SSEA）n间接免疫荧光法检测间接免疫荧光法检测ES和和EG细胞表面抗原。细胞表面抗原。n不同种属具有亚型，小鼠不同种属具有亚型，小鼠SSEA1型，人型，人SSEA3或或SSEA4亚型。亚型。第四十三页，讲稿共六十九页哦n碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）n小鼠胚胎干细胞中活性较高，已分化细胞中活性明显降低。小鼠胚胎干细胞中活性较高，已分化细胞中活性明显降低。n细胞经细胞经1%多聚甲醛固定，直接用多聚甲醛固定，直接用AKP底物底物NBT液染色，未分化细胞液染色，未分化细胞具有较高的具有较高的AKP酶活性，显示深蓝紫色。酶活性，显示深蓝紫色。第四十四页，讲稿共六十九页哦nOct4基因表达基因表达 nOct4是生殖系专一性转录因子，在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及是生殖系专一性转录因子，在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞是特异性表达的标志基因；体外培养的多能干细胞是特异性表达的标志基因；n人类人类ES、EG细胞中细胞中Oct4的表达情况尚不明确。的表达情况尚不明确。第四十五页，讲稿共六十九页哦n端粒酶（端粒酶（telomerase）n端粒酶是一类核糖核蛋白，与控制细胞寿命有关。端粒酶是一类核糖核蛋白，与控制细胞寿命有关。n人人ES细胞的端粒酶活性特别高，分化细胞一般难以检测到其活性。细胞的端粒酶活性特别高，分化细胞一般难以检测到其活性。第四十六页，讲稿共六十九页哦n体外分化潜能体外分化潜能 n将将ES细胞和细胞和EG细胞接种于缺乏滋养层细胞和细胞接种于缺乏滋养层细胞和LIF生长因子培养液生长因子培养液的琼脂板上，或添加适当的分化诱导物质（如维甲酸），或悬滴培的琼脂板上，或添加适当的分化诱导物质（如维甲酸），或悬滴培养，细胞黏附成团；养，细胞黏附成团；n培养培养34天后形成拟胚体，最外层分化为较大细胞组成的内胚层天后形成拟胚体，最外层分化为较大细胞组成的内胚层样结构，中间为未分化的干细胞；样结构，中间为未分化的干细胞；n培养培养810天，拟胚体增大，内部出现囊腔，形成囊状胚体，这样的天，拟胚体增大，内部出现囊腔，形成囊状胚体，这样的结构可持续结构可持续3周左右。周左右。第四十七页，讲稿共六十九页哦n体内分化体内分化 n不不同同品品系系小小鼠鼠的的ES细细胞胞和和EG细细胞胞在在体体内内生生长长速速度度和和分分化化能能力力会会有有所所区区别。别。n接接种种于于同同一一品品系系的的小小鼠鼠或或免免疫疫缺缺损损小小鼠鼠腹腹股股沟沟、眼眼窝窝和和腹腹腔腔，可可形形成成由由内内胚胚层层、中中胚胚层层和和外外胚胚层层构构成成的的畸畸胎胎瘤瘤，通通达达组组织织学学检检查查，可可以以分分析析ES细胞或细胞或EG细胞的全能性或多能性或限能性的发育潜能。细胞的全能性或多能性或限能性的发育潜能。第四十八页，讲稿共六十九页哦三、ES细胞和EG细胞体外诱导分化 基本原理基本原理ESES细胞和细胞和EGEG细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化 ESES细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法 ESES细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞 第四十九页，讲稿共六十九页哦（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理 n诱导分化是胚胎正常发育过程中最重要而基本的现象；诱导分化是胚胎正常发育过程中最重要而基本的现象；n在胚胎细胞被诱导分化实验中，所用诱导物质种类繁多，诱导模在胚胎细胞被诱导分化实验中，所用诱导物质种类繁多，诱导模式也不尽相同，按作用机理大致可分为两类：式也不尽相同，按作用机理大致可分为两类：n诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力；于被诱导细胞的反应能力；第五十页，讲稿共六十九页哦诱导细胞可逆性地轻度损诱导细胞可逆性地轻度损伤，导致细胞分化伤，导致细胞分化 如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物，使细胞渗透压改变致成硫氢化物，使细胞渗透压改变致成轻度损伤轻度损伤与诱导细胞表面各自受体与诱导细胞表面各自受体结合而诱导分化结合而诱导分化如类固醇激素、维甲酸如类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子衍生物、多肽生长因子等。等。第五十一页，讲稿共六十九页哦（二）（二）（二）（二）（二）（二）ESESES细胞和细胞和细胞和细胞和细胞和细胞和EGEGEG细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化细胞定向诱导分化 体外体外诱导分化诱导分化 谱系分化谱系分化（lineage differentiation）定向分化定向分化（committed differentiation）包括谱系祖细胞、谱系定型细胞到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程。包括谱系祖细胞、谱系定型细胞到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程。设法控制导向产生单一类型的分化细胞，这是至今仍未解决的难题。设法控制导向产生单一类型的分化细胞，这是至今仍未解决的难题。第五十二页，讲稿共六十九页哦（三）（三）（三）（三）（三）（三）ESESESESESES细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法 1 1、单层、单层ESES细胞培养和诱导分化细胞培养和诱导分化 2 2、ESES细胞拟胚体形成和诱导分化细胞拟胚体形成和诱导分化 第五十三页，讲稿共六十九页哦每隔每隔两天两天 1 1 1 1、单层、单层、单层、单层ESESESES细胞培养和诱导分化细胞培养和诱导分化细胞培养和诱导分化细胞培养和诱导分化 0.25%0.25%胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞2 25105104 4个个/ml/ml密度接种于密度接种于0.1%0.1%白明胶包被的培养皿白明胶包被的培养皿 更换含诱导剂的新鲜培养液更换含诱导剂的新鲜培养液 添加适当浓度的细胞分化诱导剂添加适当浓度的细胞分化诱导剂 第五十四页，讲稿共六十九页哦常用分化诱导剂常用分化诱导剂 n维甲酸维甲酸n二甲亚砜二甲亚砜n环六亚甲基双乙酰胺等环六亚甲基双乙酰胺等 n通常单层培养的通常单层培养的ESES细胞较难分化为单一类型的细胞，常出细胞较难分化为单一类型的细胞，常出现以某种类型分化细胞为优势、杂有一些其他类型分化细胞。现以某种类型分化细胞为优势、杂有一些其他类型分化细胞。第五十五页，讲稿共六十九页哦2 2 2 2、ESESESES细胞拟胚体形成和诱导分化细胞拟胚体形成和诱导分化细胞拟胚体形成和诱导分化细胞拟胚体形成和诱导分化 软软琼琼脂脂培培养养 彼此黏附聚集而形成拟胚体彼此黏附聚集而形成拟胚体胰酶消化，吹打成单细胞胰酶消化，吹打成单细胞10104 4/ml/ml接种于接种于1%1%软琼脂的培养皿，呈悬浮生长软琼脂的培养皿，呈悬浮生长第五十六页，讲稿共六十九页哦悬悬滴滴培培养养 胰酶消化，制成胰酶消化，制成2 25105104 4个个/ml/ml的悬浮液，摇匀的悬浮液，摇匀 以以20ul/20ul/滴滴 接种于培养皿盖子上，制成悬浮接种于培养皿盖子上，制成悬浮培养皿内加培养皿内加PBSPBS，使盖子上的小滴成悬滴，加封，使盖子上的小滴成悬滴，加封37,5%CO2,37,5%CO2,3d 3d 悬滴中的悬滴中的ESES细胞聚集形成拟胚体细胞聚集形成拟胚体 第五十七页，讲稿共六十九页哦移至含细胞分化诱导剂的培养皿板进一步培养移至含细胞分化诱导剂的培养皿板进一步培养 移入铺有移入铺有0.1%0.1%白明胶的培养皿，分化诱导剂培养液中白明胶的培养皿，分化诱导剂培养液中被诱导分化为不同类型的细胞被诱导分化为不同类型的细胞被诱导分化为不同类型的细胞被诱导分化为不同类型的细胞 第五十八页，讲稿共六十九页哦四、四、四、四、四、四、ESESESESESES细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞细胞体外诱导分化的几种细胞 n小鼠模型，且偏重混合型分化细胞。小鼠模型，且偏重混合型分化细胞。n人类人类ES/EGES/EG细胞建系成功，致力于将人细胞建系成功，致力于将人ESES细胞改造成以临床细胞改造成以临床基因、细胞和组织治疗为目的的各种定向诱导分化细胞研究。基因、细胞和组织治疗为目的的各种定向诱导分化细胞研究。n主要是将克隆技术和核移植技术融合于干细胞研究。主要是将克隆技术和核移植技术融合于干细胞研究。第五十九页，讲稿共六十九页哦n 软骨细胞软骨细胞n 脂肪细胞脂肪细胞 n 心肌和其他肌肉细胞心肌和其他肌肉细胞n 神经细胞神经细胞n 内皮细胞与血管内皮细胞与血管n 造血细胞造血细胞 n 胰岛细胞胰岛细胞 第六十页，讲稿共六十九页哦四、细胞治疗的临床应用前景四、细胞治疗的临床应用前景 神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病 骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病 血液病血液病血液病血液病血液病血液病 肝病肝病肝病肝病肝病肝病 第六十一页，讲稿共六十九页哦神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病神经系统疾病 n帕帕金森病是因缺损产生神经递质多巴胺的神经细胞。n产生多巴胺的神经干细胞已能从小鼠ES细胞衍生而来，体外培养后，移植入患有实验性帕金森病的鼠类脑部，则动物明显地改善了对运动和动作的控制及协调性。n人人们正在探索、发展和培养神经胶质细胞、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞，以用于临床神经损伤的病人。第六十二页，讲稿共六十九页哦骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病骨和软骨疾病 nES和EG细胞具有自我更新的能力，可被培养产生在数量上比从组织得到的多得多的骨和软骨细胞。n受控制的干细胞群落在被移植的受体中，对许多骨和软骨细胞数量不足和功能缺损损的疾病起长期补充作用，有希望治疗骨和软骨的遗传缺损和发育异常等骨和软骨疾病。n从ES细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。第六十三页，讲稿共六十九页哦血液病血液病血液病血液病血液病血液病 n珠蛋白基因在镰刀状血球病人中被激活时，则能封阻含有镰刀状血球珠蛋白基因在镰刀状血球病人中被激活时，则能封阻含有镰刀状血球血红蛋白的红细胞被镰状化。血红蛋白的红细胞被镰状化。nES细胞及其基因操作可能回答如何在成年镰刀状血球病人中启动细胞及其基因操作可能回答如何在成年镰刀状血球病人中启动珠蛋白基因表达，阻止疾病的进展。珠蛋白基因表达，阻止疾病的进展。nES细胞和造血干细胞也有助于产生供细胞治疗移植用的、不含有镰细胞和造血干细胞也有助于产生供细胞治疗移植用的、不含有镰状血球突变的血细胞。状血球突变的血细胞。第六十四页，讲稿共六十九页哦肝病肝病肝病肝病肝病肝病 n通过移植分离的肝细胞可以治疗肝功能严重损伤的病人，然而供者通过移植分离的肝细胞可以治疗肝功能严重损伤的病人，然而供者原代肝细胞一般不能在组织培养中增殖。原代肝细胞一般不能在组织培养中增殖。n将人肝干细胞通过转基因导入生长促进基因成为永生化细胞时，可在体外大量将人肝干细胞通过转基因导入生长促进基因成为永生化细胞时，可在体外大量增殖，同时保留分化的能力，移植入肝病动物模型，改善动物的肝功能。增殖，同时保留分化的能力，移植入肝病动物模型，改善动物的肝功能。n但，利用永生化细胞时，却存在着易发生肿瘤的危险。有人提出，给予但，利用永生化细胞时，却存在着易发生肿瘤的危险。有人提出，给予一种药物激活一种药物激活“细胞自杀细胞自杀”基因，控制在一定数量范围内。基因，控制在一定数量范围内。第六十五页，讲稿共六十九页哦n组织工程的种子细胞来源组织工程的种子细胞来源 n目前，缺损组织或器官的修复主要有目前，缺损组织或器官的修复主要有3 3种方法，即自体移植、种方法，即自体移植、异体移植和组织代用品。这异体移植和组织代用品。这3 3种方法都受到客观条件的限制。种方法都受到客观条件的限制。第六十六页，讲稿共六十九页哦n基本的设想是：基本的设想是：n选择与人体细胞兼容性较好的生物材料；选择与人体细胞兼容性较好的生物材料；n按缺损组织或器官的要求设计并制成模型或支架放在体外培养系统按缺损组织或器官的要求设计并制成模型或支架放在体外培养系统中；中；n使使ES细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织或器官。构建成新的组织或器官。第六十七页，讲稿共六十九页哦n要在人类临床医学中应用，尚需时日，特别是要解决有效地改造基因要在人类临床医学中应用，尚需时日，特别是要解决有效地改造基因组、克服细胞移植中的免疫学障碍、定向诱导分化、细胞纯化、永生组、克服细胞移植中的免疫学障碍、定向诱导分化、细胞纯化、永生化和体外组织构建等一系列复杂问题，多数研究还处在实验室阶段。化和体外组织构建等一系列复杂问题，多数研究还处在实验室阶段。n同时，有关伦理道德和法律及商业应用等问题尚需规范。同时，有关伦理道德和法律及商业应用等问题尚需规范。n已经证明有可能使已经证明有可能使ES细胞分化为特殊类型的细胞，作为组织或器官体细胞分化为特殊类型的细胞，作为组织或器官体外生长的重要种子细胞来源。外生长的重要种子细胞来源。第六十八页，讲稿共六十九页哦2022/9/28感谢大家观看第六十九页，讲稿共六十九页哦