基因工程基本操作程序精选PPT.ppt

关于基因工程基本操作程序第1页，讲稿共52张，创作于星期日一一、目的基因的获取目的基因的获取 1.基因的结构基因的结构2.目的基因的概念目的基因的概念3.3.目的基因的获取的方法目的基因的获取的方法第2页，讲稿共52张，创作于星期日1.基因的结构基因的结构（1）原核生物基因结构原核生物基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游编码蛋白质编码蛋白质调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达（调控程序）（调控程序）AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC启动子启动子终止子终止子第3页，讲稿共52张，创作于星期日编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶AUGUGCACGUAGUUA 启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶聚合酶结合并能起始结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA RNA聚合酶聚合酶:能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结合的一并与其结合的一种蛋白质种蛋白质.终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻碍片断，它能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，使转模板链上脱离下来，使转录终止。录终止。第4页，讲稿共52张，创作于星期日编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）（能编码蛋白质）启动子启动子终止子终止子（2）真核与）真核与原核生物基因结构的比较原核生物基因结构的比较外显子外显子内含子内含子编码蛋白质编码蛋白质（不能编码蛋白质）（不能编码蛋白质）相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。作用的非编码区。不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。胞的编码区是间隔的，不连续的。真核生物基因结构真核生物基因结构第5页，讲稿共52张，创作于星期日外显子：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。第6页，讲稿共52张，创作于星期日2.目的基因的概念目的基因的概念 主要是指编码主要是指编码蛋白质蛋白质基因，也可以是一些具有调控作基因，也可以是一些具有调控作用的因子。用的因子。例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质相关的基因，药物和保健品相关的基良品质相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。需要酶相关的基因。目前被广泛提取使用的目的基因有：目前被广泛提取使用的目的基因有：苏苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病（抗病毒、抗细菌毒、抗细菌)、人胰岛素基因人胰岛素基因等。等。第7页，讲稿共52张，创作于星期日3.3.目的基因的获取的方法目的基因的获取的方法（3 3）用化学方法直接）用化学方法直接人工合成目的基因人工合成目的基因（1 1）从基因库中获取目的基因从基因库中获取目的基因（2 2）应用应用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第8页，讲稿共52张，创作于星期日（1 1）从基因库中获取目的基因）从基因库中获取目的基因基因文库和部分基因文库的慨念基因文库和部分基因文库的慨念基因组文库和基因组文库和cDNA文库的主要区别文库的主要区别怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因因第9页，讲稿共52张，创作于星期日基因文库和部分基因文库的慨念基因文库和部分基因文库的慨念：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受导入受体菌的群体中储存体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因同的基因,称为基因文库。称为基因文库。基因文库中包含了一种生物基因文库中包含了一种生物所有的基因所有的基因,这种基因文库叫做基这种基因文库叫做基因组文库。因组文库。基因文库中包含了基因文库中包含了一种生物的一部分基因一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分这种基因文库叫做部分基因文库。如：基因文库。如：cDNA文文库。库。第10页，讲稿共52张，创作于星期日部分基因文库的建立方法部分基因文库的建立方法 mRNA mRNA反转录酶反转录酶单链单链DNADNA合成合成 双链双链DNADNA（cDNAcDNA）载体载体插入插入导入导入受体菌群（受体菌群（cDNA文库）文库）分离分离目的基因目的基因基因组文库的建立方法基因组文库的建立方法提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与运载体连接片段与运载体连接导入受体菌中储存（导入受体菌中储存（基因组文库）基因组文库）分离分离目的基因目的基因第11页，讲稿共52张，创作于星期日cDNA合成过程 第一步：反转录酶以第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互补的互补的 DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。第二步：核酸酶第二步：核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降链降 解，使之变成单链的解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链第三步：以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下合聚合酶的作用下合 成另一条互补的成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。01.10.202201.10.20221212第12页，讲稿共52张，创作于星期日基因组文库和基因组文库和cDNA文库的主要区别文库的主要区别 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的DNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNA片段）片段）基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以第13页，讲稿共52张，创作于星期日（2）应用）应用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因定义：定义：原理：原理：DNA双链双链复制复制 PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因间内大量扩增目的基因 DNA分子热变性（在分子热变性（在9095 OC时，解时，解旋，双链分旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要技术中不需要解旋酶（与复制不同之处解旋酶（与复制不同之处)仪器：仪器：PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）扩增仪（自动调控温度的仪器）条件：条件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，三磷酸脱氧核苷酸这一序列合成引物，三磷酸脱氧核苷酸dNTP，酶等。，酶等。第14页，讲稿共52张，创作于星期日过程：过程：a.DNA热变性（热变性（909095 95 O OC C)：b.复性或退火复性或退火（555560 60 O OC C)：c.延伸延伸（707075 75 O OC C)：d.重复重复a.b.c步骤：步骤：双链双链DNA模板在热的作用下，氢模板在热的作用下，氢键断裂形成单键键断裂形成单键DNA系统温度降低，引物结合到互补系统温度降低，引物结合到互补DNA链链上，形成局部的双链上，形成局部的双链DNA 在在Taq酶作用下，合成与模板互补的酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链子链，形成双链DNA 每重复一次，目的基因增加一倍每重复一次，目的基因增加一倍PCR扩增为指数形式扩增扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。，在短时间内扩增大量目的基因。第15页，讲稿共52张，创作于星期日怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的根据基因的核苷酸序列核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。等特性来获取目的基因。第16页，讲稿共52张，创作于星期日以以哺乳动物哺乳动物基因组基因组DNA为例，介绍为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤印迹杂交的基本步骤 一、一、待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备（一）制备待测（一）制备待测DNA 将基因文库中的所有菌落裂解，用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA（如量不够可用PCR扩增）（二）（二）DNA限制酶消化限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。消化后电泳分离DNA（三）（三）DNA变性：变性：分离后移至于碱性溶液中浸泡，DNA片段经过碱变性作用，形成单链状态。单链DNA片段转移到固相（一种特制的膜）支持物上。第17页，讲稿共52张，创作于星期日以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤二、探针标记：二、探针标记：通过PCR方法将目的基因已知的部分核酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记，即用标记标记了放射性同位素的目的了放射性同位素的目的DNA片段作为探针片段作为探针，将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性成单链单链。三、三、Southern杂交杂交：将待测单链DNA滤膜和标记的探针单链DNA放入杂交液中即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。第18页，讲稿共52张，创作于星期日以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤四、放射性自显影检测四、放射性自显影检测 将杂交后的滤膜，放入有2张X光底片暗盒中，使滤膜对X光底片曝光然后冲洗X光底片，在膜上阳性反应（杂交带）。主要应用主要应用 1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析 第19页，讲稿共52张，创作于星期日(3)(3)用化学方法直接用化学方法直接人工合成目的基因人工合成目的基因蛋白质氨基酸序列蛋白质氨基酸序列mRNA的核苷酸的核苷酸序列序列目目的基因序列的基因序列目的基因目的基因针对：基因比较小，核苷酸序列又已知针对：基因比较小，核苷酸序列又已知推测推测化学合化学合成成思考：思考：不具有，缺少非编码区不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。序列（如内含子），要人工构建。人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？基因？推测推测第20页，讲稿共52张，创作于星期日1.1.1.1.作用：作用：作用：作用：二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心IMNIMN2.2.组成：组成：使目的基因在受体细胞中稳定存在并使目的基因在受体细胞中稳定存在并使目的基因在受体细胞中稳定存在并使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。遗传给子代。遗传给子代。遗传给子代。同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。(3)(3)终止子：是使转录在需要的地方停止终止子：是使转录在需要的地方停止(4)(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来而将含有目的基因的细胞筛选出来(2)(2)启动子：是启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位聚合酶识别和结合部位(1)(1)目的基因目的基因 不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。因表达载体的构建有所差异。第21页，讲稿共52张，创作于星期日质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种基因表达载体的构建基因表达载体的构建01.10.202201.10.20222222第22页，讲稿共52张，创作于星期日寻根问底：寻根问底：将生物的所有将生物的所有DNA直接导入受体细胞不直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。细胞，没有进行表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。说不算基因工程。第23页，讲稿共52张，创作于星期日资资 料料:科学家在培育抗虫棉时，起初把苏科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料证明：载体构建组成要完整资料证明：载体构建组成要完整第24页，讲稿共52张，创作于星期日三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程内维持稳定和表达的工程2.常见转化方法：常见转化方法：农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。（1 1）将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 基因枪法：单子叶植物。基因枪法：单子叶植物。花粉管通道法花粉管通道法（3 3）将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞法。感受态细胞法。（2）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞显微注射法。显微注射法。第25页，讲稿共52张，创作于星期日特点特点特点特点:农杆菌转化法：农杆菌转化法：（1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞能感染能感染能感染能感染双子叶植物双子叶植物双子叶植物双子叶植物和和和和祼子植物祼子植物祼子植物祼子植物,对大多数单子对大多数单子对大多数单子对大多数单子叶植物没有感染能力叶植物没有感染能力叶植物没有感染能力叶植物没有感染能力过程过程：适用生物：适用生物：双子叶植物、祼子植物。双子叶植物、祼子植物。双子叶植物、祼子植物。双子叶植物、祼子植物。第26页，讲稿共52张，创作于星期日Hin d限制性酶限制性酶Hin dIIIHin dIII目的目的DNATi质粒质粒苏云金杆菌苏云金杆菌构建表达载体构建表达载体Bt毒素蛋白基因毒素蛋白基因 苏云金杆菌苏云金杆菌DNA连接酶连接酶 T-DNA(可转移可转移-DNA)知识拓展知识拓展农杆菌转化法的过程：农杆菌转化法的过程：第27页，讲稿共52张，创作于星期日花粉管通道法：花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞操作方法：操作方法：特点：特点：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞借助花粉管通道进入受体细胞十分简便经济十分简便经济例：例：转基因抗虫棉转基因抗虫棉第28页，讲稿共52张，创作于星期日基因枪法：基因枪法：利用压缩气体产生的动力利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表，将包裹在金属粒表面的表达载体达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法的方法操作方法：操作方法：金属粒：金属粒：将目的基因导入单子叶植物细胞将目的基因导入单子叶植物细胞 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：单子叶植物适用：单子叶植物第29页，讲稿共52张，创作于星期日细胞类型：细胞类型：操作程序：操作程序：_显微注射法：显微注射法：（2）将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞发育成新性状动物发育成新性状动物发育成新性状动物发育成新性状动物移植到子宫或输卵管移植到子宫或输卵管移植到子宫或输卵管移植到子宫或输卵管培养成早期胚胎培养成早期胚胎显微显微显微显微注射注射注射注射取受精卵取受精卵（体内或体外（体内或体外（体内或体外（体内或体外 受精）受精）受精）受精）提纯含目提纯含目提纯含目提纯含目的基因表的基因表的基因表的基因表达载体达载体达载体达载体受精卵受精卵第30页，讲稿共52张，创作于星期日常用法：常用法：常用菌：常用菌：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：大肠杆菌大肠杆菌CaCa2+2+处理获得感受态细胞处理获得感受态细胞CaCaCaCa2+2+2+2+处理处理处理处理大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌感感感感 受受受受 态态态态 细细细细 胞胞胞胞表达载体表达载体表达载体表达载体与感受态与感受态与感受态与感受态细胞混合细胞混合细胞混合细胞混合感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收吸收吸收DNADNA_感受态细胞法感受态细胞法（3）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞第31页，讲稿共52张，创作于星期日例：例：第32页，讲稿共52张，创作于星期日 若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗？杆菌作为工程菌吗？答：不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和答：不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器。胞中不含这两种细胞器。以酵母菌作为工程菌可以吗以酵母菌作为工程菌可以吗?答：可以，酵母菌为真核生物（真菌类）。答：可以，酵母菌为真核生物（真菌类）。第33页，讲稿共52张，创作于星期日四四 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组 DNADNA分子吗？分子吗？分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？和表达？和表达？和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测1.检测方法：检测方法：分子杂交技术：分子杂交技术：（1 1）DNA分子与分子与DNA分子的之间杂交分子的之间杂交（2 2）DNA分子与分子与RNA分子的之间杂交分子的之间杂交（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交2.个体生物学水平的鉴定：个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病结种实验，活性比较实验抗虫、抗病结种实验，活性比较实验第34页，讲稿共52张，创作于星期日1.检测检测转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的DNA分子分子方法：方法：DNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性变性变性变性变性第35页，讲稿共52张，创作于星期日 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。第36页，讲稿共52张，创作于星期日变性变性方法：方法：DNA分子杂交（分子杂交（northern杂交）杂交）（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N14N N如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。第37页，讲稿共52张，创作于星期日提提取取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原方法：抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出血液从小鼠血管抽出血液分离出抗分离出抗Bt毒素的毒素的抗体抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现杂出现杂交带交带脱脱分分化化组组织织培培养养证明：证明：提取蛋白质与提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样毒素蛋白质一样第38页，讲稿共52张，创作于星期日例：用棉铃饲喂棉铃虫，如例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。基因并得到表达。2.2.鉴定鉴定个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定（1）多细胞个体）多细胞个体抗虫、抗病接种实验，活性比较实验抗虫、抗病接种实验，活性比较实验第39页，讲稿共52张，创作于星期日 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完分子后就说明目的基因完成了表达吗？成了表达吗？若不能表达，要若不能表达，要对抗虫基因再进对抗虫基因再进行行修饰修饰。第40页，讲稿共52张，创作于星期日细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。产物的进一步培养、研究。（2）单细胞生物）单细胞生物无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物第41页，讲稿共52张，创作于星期日1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶课堂练习课堂练习第42页，讲稿共52张，创作于星期日2 2、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.B.A.B.C.D.C.D.课堂练习课堂练习第43页，讲稿共52张，创作于星期日3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料第44页，讲稿共52张，创作于星期日4 4、基因工程是在、基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的，分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是的步骤是 （）A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达1 A 2D 3 D 4 C1 A 2D 3 D 4 C第45页，讲稿共52张，创作于星期日培培养养培培养养导入导入含目的基因的重组含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌质粒导入农杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完全培养基的完全培养基不不能能存存活活 Ca2+处理细胞形处理细胞形成感受态细胞成感受态细胞检测检测农杆菌农杆菌农杆菌农杆菌（培养不具有氨苄青霉素（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性基因的农杆菌）抗性基因和四环素抗性基因的农杆菌）具有氨苄青霉素抗具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌性基因的农杆菌农杆菌农杆菌不不具具有有氨氨苄苄青青霉霉素素 抗抗性性基基因因的的农农杆杆菌菌完全培养基完全培养基含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完的完全培养基全培养基农杆菌农杆菌证明：证明：目的基目的基因已导因已导入入存活存活第46页，讲稿共52张，创作于星期日脱分化脱分化组织培养组织培养脱分化脱分化农杆菌农杆菌导入植物细胞通过组织培养产生新个体导入植物细胞通过组织培养产生新个体再再分分化化移植移植个体生物学水个体生物学水平的鉴定平的鉴定如虫吃后中毒死亡，则说明摄如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达入了抗虫基因并得到表达导入植导入植物细胞物细胞组织培养组织培养第47页，讲稿共52张，创作于星期日下课了!第48页，讲稿共52张，创作于星期日存存活活的的大大肠肠杆杆菌菌培培养养培培养养质粒来源：质粒来源：大肠杆菌大肠杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的的完全培养基完全培养基含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基人工改造质粒人工改造质粒（选择具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因农杆菌）（选择具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因农杆菌）质粒质粒知识拓展知识拓展第49页，讲稿共52张，创作于星期日Hin d限制性酶限制性酶Hin dIIIHin dIII目的目的DNA质粒质粒构建表达载体构建表达载体四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因形成只具有氨苄青霉素抗性基因DNA连接酶连接酶人类胰岛素的基因人类胰岛素的基因第50页，讲稿共52张，创作于星期日培培养养培培养养培培养养导入导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完的完全培养基全培养基含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基两两种种培培养养基基均均不不能能生生长长大大肠肠杆杆菌菌 Ca2+处理细胞形处理细胞形成感受态细胞成感受态细胞检测检测（培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）（培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素抗只有氨苄青霉素抗性基因质粒性基因质粒只具有氨苄青霉素抗只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌性基因大肠杆菌不不具具有有氨氨苄苄青青霉霉素素 抗抗性性基基因因和和四四环环素素抗抗性性基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌完全培养基完全培养基第51页，讲稿共52张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第52页，讲稿共52张，创作于星期日