基因克隆载体讲稿.ppt

关于基因克隆载体课件关于基因克隆载体课件第一页，讲稿共一百零八页哦基因克隆载体基因克隆载体定义定义通过不同途径将承载的外源通过不同途径将承载的外源DNA片段片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持（基因）带入受体细胞且能在其中维持的的DNA分子。也称分子。也称DNA克隆载体克隆载体。第二页，讲稿共一百零八页哦1.载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第三页，讲稿共一百零八页哦2.2.必备条件必备条件 1 1、克隆位点克隆位点(一个或多个一个或多个)2 2、能携带外源、能携带外源DNADNA片段进入受体细胞片段进入受体细胞:能自我能自我复制，或整入染色体随受体细胞复制，或整入染色体随受体细胞DNADNA复制而复复制而复制。制。3 3、有用于选择克隆子的、有用于选择克隆子的标记基因标记基因 4 4、安全性安全性(不含损害受体的基因不含损害受体的基因,不任意转入不任意转入别的别的,尤其人的细胞尤其人的细胞)意义：意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。建新载体一直是基础研究的优先领域。第四页，讲稿共一百零八页哦按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：质粒质粒 病毒或噬菌体病毒或噬菌体 质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体DNADNA组成的组成的 质粒与染色体质粒与染色体DNADNA片段组成的片段组成的分分类类第五页，讲稿共一百零八页哦第一节第一节 质粒克隆载体质粒克隆载体 定义：定义：以质粒以质粒DNADNA为基础构建而成的载体，适于原核和为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNAcDNA基因基因文库。文库。第六页，讲稿共一百零八页哦一、质粒适于载体构建的性质一、质粒适于载体构建的性质、组成与构型、组成与构型是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）真菌、蓝藻、绿藻）第七页，讲稿共一百零八页哦构型：构型：构型：构型：l-DNAl-DNAl-DNAl-DNAoc-DNAoc-DNAoc-DNAoc-DNAccc-DNAccc-DNAccc-DNAccc-DNAccc第八页，讲稿共一百零八页哦、分子大小：、分子大小：100102kb第九页，讲稿共一百零八页哦、复制、复制 特点特点:在宿主细胞内；在宿主细胞内；单向；单向；质粒质粒和和宿主宿主细胞双重遗传系统控制细胞双重遗传系统控制拷贝数（宿主细胞内拷贝数（宿主细胞内质粒质粒与与染色体染色体数量之数量之比值比值）第十页，讲稿共一百零八页哦（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：严紧控制型：1-1-数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒松驰控制型：松驰控制型：1010个以上拷贝；小质粒。个以上拷贝；小质粒。经经氯霉素氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1ColE1拷贝数达拷贝数达30003000个）。个）。第十一页，讲稿共一百零八页哦（）质粒复制的控制因素（）质粒复制的控制因素 copcop基因：基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。第十二页，讲稿共一百零八页哦PcopPcopcopcopP/OrepP/OreprepreporioriCopCopRepRep第十三页，讲稿共一百零八页哦、质粒的不亲和性、质粒的不亲和性 (阅读教程阅读教程p88,p88,新版新版p105:p105:两种解释两种解释)亲和性质粒：亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不亲和性（不相容性不相容性）质粒：）质粒：不能在同一细胞中复制的不能在同一细胞中复制的质粒质粒任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中在于一个细胞中意义：意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含是亲和性质粒，最好不含内源性质粒内源性质粒第十四页，讲稿共一百零八页哦、质粒迁移、质粒迁移（质粒的可转移性）质粒的可转移性）（1 1）含）含tratra基因基因合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）质粒质粒DNADNA入受体细胞入受体细胞 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），含移到另一个细胞（接合作用），含tratratratra基因的质粒，如基因的质粒，如F F、TiTi质粒等质粒等 非接合型质粒非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作不能在天然条件下独立地发生接合作不能在天然条件下独立地发生接合作不能在天然条件下独立地发生接合作用，不含用，不含用，不含用，不含tratra基因的质粒，如基因的质粒，如基因的质粒，如基因的质粒，如ColColColCol、R R的其它成员的其它成员的其它成员的其它成员第十五页，讲稿共一百零八页哦（）迁移作用（）迁移作用某些非接合型质粒（某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由bom 和和mob 基因基因决定。决定。不含不含tra基因而含基因而含bom（ori）位点的质粒，当宿主细）位点的质粒，当宿主细胞存在胞存在辅助质粒辅助质粒mob基因基因产物时，即可打开产物时，即可打开ori位点，位点，非结合质粒借助非结合质粒借助接合质粒接合质粒tra基因基因的产物而迁移入受体细的产物而迁移入受体细胞。这种现象称胞。这种现象称第十六页，讲稿共一百零八页哦、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒显性（表达型）质粒显性（表达型）质粒宿主因含某种质粒而宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，这种质粒称为显性质粒；呈现出新的性状，这种质粒称为显性质粒；隐蔽质粒隐蔽质粒即使宿主内含有某种质粒，但无异即使宿主内含有某种质粒，但无异样性状表露，这种质粒称为隐蔽质粒样性状表露，这种质粒称为隐蔽质粒第十七页，讲稿共一百零八页哦显性质粒显性质粒 质粒质粒：含有氨苄青霉素：含有氨苄青霉素ApAp、氯霉素、氯霉素CmCm、卡那霉素、卡那霉素KmKm、四环素、四环素TcTc、链霉素、链霉素SmSm等药物的抗性基因，可作等药物的抗性基因，可作为为选择标记选择标记。ColCol质粒质粒 质粒质粒降解质粒降解质粒 i i质粒质粒 隐蔽质粒隐蔽质粒 蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒第十八页，讲稿共一百零八页哦二、二、质粒克隆载体构建的基本策略质粒克隆载体构建的基本策略 、能进行有效复制、能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）、克隆位点、克隆位点组装组装MCSMCS连杆连杆 、选择标记基因、选择标记基因抗性基因，抗性基因，Lac ZLac Z基因基因 、分子尽可能小（转化率高）、分子尽可能小（转化率高）15kb15kb，转化率，转化率 、组装各种、组装各种“元件元件”，如启动子、终止子等如启动子、终止子等第十九页，讲稿共一百零八页哦三、质粒克隆载体构建三、质粒克隆载体构建 过程：过程：严密的实验设计严密的实验设计构建（切割、修饰和连构建（切割、修饰和连接重组）接重组）构建原则构建原则 1 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如选用合适的出发质粒：含必备的元件，如oriori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件正确获得构建质粒克隆载体的元件 3 3、组装合适的选择标记基因组装合适的选择标记基因 4 4、选用合适的启动子选用合适的启动子 5 5、构建过程力求简单构建过程力求简单 第二十页，讲稿共一百零八页哦代表性实例代表性实例（一）（一）pBR322pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建及其衍生质粒克隆载体的构建 、pBR322pBR322构建构建 质粒载体命名法则质粒载体命名法则 “pBR322”pBR322”p p：质粒（质粒（plasmid)plasmid)BRBR：两位主要构建者两位主要构建者BolivarBolivar和和RogigerusRogigerus姓姓氏的字首氏的字首 322322：实验编号实验编号 第二十一页，讲稿共一百零八页哦第二十二页，讲稿共一百零八页哦pBR322pBR322构建过程构建过程(出发质粒：出发质粒：pMB1pMB1)第二十三页，讲稿共一百零八页哦pBR322的三个亲本：的三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101识别位点：识别位点：Apr基因区（基因区（3个个）：）：Pst、Sca、PvuTcr基因区（基因区（7个个）：）：BamH、Scal、EcoR、Sph、Nhe、Nru、XmaTcr启动子区（启动子区（2个个）：）：Cla、HindpBR322分子大小：分子大小：4363bp第二十四页，讲稿共一百零八页哦第二十五页，讲稿共一百零八页哦第二十六页，讲稿共一百零八页哦优点优点:（1 1）较小的分子量）较小的分子量 10kb10kb以内以内DNADNA分子纯化过程中可避免断裂，分子纯化过程中可避免断裂，pBR322pBR322易于易于自身纯化，且可克隆自身纯化，且可克隆6kb6kb左右的外源左右的外源DNADNA（2 2）带有一个复制起始位点）带有一个复制起始位点保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。（3 3）较高的拷贝数）较高的拷贝数经氯霉素扩培后达经氯霉素扩培后达100010003000 copys/cell3000 copys/cell，该特该特性为重组体性为重组体DNADNA的制备提供了极大的方便的制备提供了极大的方便 （4 4）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记选择标记。插入失活（图解）插入失活（图解）第二十七页，讲稿共一百零八页哦第二十八页，讲稿共一百零八页哦、pUC18/19pUC18/19质粒载体质粒载体 命名命名pUCpUCUniversity of CaliforniaUniversity of California的科学家的科学家首先构建。首先构建。与与pBR322pBR322区别：区别：乳糖操纵子的一个乳糖操纵子的一个DNADNA片段（片段（lac Zlac Z基因基因）替换）替换TcTcr r基因；基因；组装了一个多克隆位点（组装了一个多克隆位点（MCSMCS）连杆）连杆 第二十九页，讲稿共一百零八页哦pUCpUC包括四个组成部分：包括四个组成部分：（1 1）pBR322pBR322的复制起点的复制起点(oriori)（2 2）ApApr r基因基因，但，但DNADNA序列发生变化，不序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点再含原来限制性核酸内切识别位点 （3 3）lacZlacZ基因基因 （4 4）在）在lacZlacZ基因内部靠近基因内部靠近55端有一段端有一段MCSMCS连杆连杆第三十页，讲稿共一百零八页哦第三十一页，讲稿共一百零八页哦pBR322pBR322衍生的质粒衍生的质粒 缺失缺失bombom位点位点 pBR325pBR325、pBR327pBR327，pAT153pAT153，不具被动迁移作用，更安全不具被动迁移作用，更安全第三十二页，讲稿共一百零八页哦Lac ZLac Z筛选机制：筛选机制：含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端端146146残基残基(-(-肽肽)合成有活性的合成有活性的 基因基因（lac Zlac Z）的质粒载体）的质粒载体+可编可编 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 码码C C端部分残基的宿主端部分残基的宿主(与与Lac ZLac Z互补互补 的大肠杆菌的大肠杆菌)在含在含IPTGIPTG（异丙基（异丙基-D-D-硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和 X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖）半乳糖）蓝色菌落蓝色菌落 的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养 在在N N端端-肽的编码区插入肽的编码区插入MCS MCS 不影响不影响lac Zlac Z基因功能基因功能 插入外源插入外源DNA DNA 灭活灭活lac Zlac Z基因基因 白色菌落白色菌落第三十三页，讲稿共一百零八页哦编码编码编码编码b b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 IPTGX-gal(酶的底物酶的底物)lac promoter蓝色菌落IPTG可诱导lacZ形成肽链,该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的C-末端发生基因内互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因DNA片段插入多克隆位点后,使其编码的肽链失去活性,使其不能形成-互补,因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。第三十四页，讲稿共一百零八页哦重重组组子子的的显显色色互互补补筛筛选选法法第三十五页，讲稿共一百零八页哦-互补的原理互补的原理 所所谓谓基基因因内内互互补补作作用用，在在LacZLacZ体体系系中中,是是指指二二个个彼彼此此互互补补的的突突变变基基因因（突突变变体体1 1只只含含LacILacI和和LacZLacZ的的N N端端145145个个氨氨基基酸酸的的肽肽；突突变变体体2 2缺缺乏乏LacZLacZ的的N N端端肽肽），它它们们编编码码产产生生的的无无活活性性的的多多肽肽产产物物，但但由由于于二二个个突突变变体体之之间间通通过过肽肽互互补补作作用用可可呈呈现现有有功功能能的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶活活性性,进进而而可可分分解解底底物物X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲吲哚哚-D-D-半半乳乳糖糖苷苷）而而产产生生半半乳乳糖糖和和深深蓝蓝色色的的底底物物5-5-溴溴-4-4-氯氯-青青定定蓝蓝,使使菌菌落落呈呈现现出出蓝蓝色色反反应应。然然而而，当当外外源源基基因因DNADNA片片段段插插入入载载体体中中LacZ LacZ 肽肽区区段段的的多多克克隆隆位位点点后后,就就会会阻阻断断序序列列的的读读码码结结构构,使使其其编编码码的的肽肽失失去去活活性性,使使重重组组子子所所在在的的细细菌菌不不能能完完成成-互互补补,因因此此带带有有外外源源基基因因重重组组子子的的细细菌菌形形成成白白色色菌菌落落。根根据据这这种种-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的显显色色反反应应，可可以以检检测测和和筛筛选选出出携携有有外外源源基基因因重重组组子子克克隆隆。此此法法又称蓝白筛选法。如图又称蓝白筛选法。如图第三十六页，讲稿共一百零八页哦非重组质粒非重组质粒:不含有插入的 DNA蓝色菌落 重组质粒重组质粒:含有插入的 DNA:白色菌落非重组质粒非重组质粒重组质粒重组质粒第三十七页，讲稿共一百零八页哦第三十八页，讲稿共一百零八页哦pUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点 （1 1）分子量更小、拷贝数更高）分子量更小、拷贝数更高 （2 2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时 （3 3）MCSMCS区方便转移外源区方便转移外源DNADNA在不同载体系列中在不同载体系列中 “穿梭穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源，使具有两种不同粘末端的外源DNA DNA 能直接克隆入能直接克隆入pUCpUC载体载体第三十九页，讲稿共一百零八页哦（二）蓝藻质粒克隆载体（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2pPKE2的构建的构建大肠杆菌质粒不能转化蓝藻大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒蓝藻内的质粒属隐蔽质粒 即：即：大肠杆菌源质粒复制起始点大肠杆菌源质粒复制起始点 +蓝藻源质粒复制起始点蓝藻源质粒复制起始点 pPbs（1511bp）pPbs Cla 重组重组 pPRS-1 多次亚克隆多次亚克隆 pPKE2pBR322 组装组装CaMV35sCaMV35s启动子、启动子、MCSMCS、rbcSrbcS终止子、终止子、KmKmr r基因基因 构建穿梭质粒构建穿梭质粒第四十页，讲稿共一百零八页哦第四十一页，讲稿共一百零八页哦（三）农杆菌（三）农杆菌TiTi质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建 Ti质粒：质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称瘿瘤）的质粒，故称Tumorinducingplasmid（Ti质粒）。质粒）。双链环状双链环状DNA分子分子，200250kb。第四十二页，讲稿共一百零八页哦1、4个功能区：个功能区：T-DNA区、区、Vir区、区、Con区、区、Ori区区 （1）T-DNA区区 TiTi质粒进入植物细胞的只有约质粒进入植物细胞的只有约25kb25kb部分，即部分，即T-DNAT-DNA（transfer DNA)transfer DNA)。左右边界各有一个。左右边界各有一个25bp25bp正向重复序正向重复序列（列（LTSLTS和和RTSRTS）称为）称为边界序列边界序列，为，为T-DNAT-DNA的转移和整合的转移和整合所必需。只要保留所必需。只要保留T-DNAT-DNA的边界序列，中间序列被外源的边界序列，中间序列被外源DNADNA片段替换，仍可片段替换，仍可转移整合转移整合到植物基因组中。到植物基因组中。这是这是TiTi质粒用于遗传转化的质粒用于遗传转化的理论依据理论依据。第四十三页，讲稿共一百零八页哦（2 2）VirVir区区 位于位于T-DNAT-DNA区上游，其表达产物可激活区上游，其表达产物可激活T-DNAT-DNA的转移，显示致瘤的转移，显示致瘤性。性。（3 3）ConCon区区含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)tra)，可受宿主产生，可受宿主产生的的冠瘿碱冠瘿碱活化，使活化，使TiTi质粒在细菌间转移，也即接合转移基质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。因编码区。（4 4）OriOri区区复制起始区，调控复制起始区，调控TiTi质粒自我复制。质粒自我复制。TiTi质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。用。第四十四页，讲稿共一百零八页哦Ti质粒作为载体的问题质粒作为载体的问题i)太大，无适合克隆位点太大，无适合克隆位点ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为的存在不能使转化细胞再生为完整植株完整植株故不能达到直接选育转基因植物的目故不能达到直接选育转基因植物的目的的第四十五页，讲稿共一百零八页哦2 2、构建途径、构建途径 （1 1）取代型载体）取代型载体用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代TiTi质粒的全部或部分质粒的全部或部分T-DNAT-DNA序列序列而构建。外源基因以而构建。外源基因以同源交换同源交换而重组。而重组。OncOnc-TiTi：T-DNAT-DNA上的上的onconc基因被取代而构建。基因被取代而构建。OncOnc+TiTi：pBR322pBR322取代取代 T-T-DNADNA的部分序列但保留的部分序列但保留onconc基基因而构建。进入植物细胞诱发因而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。冠瘿瘤。第四十六页，讲稿共一百零八页哦（2 2）中间质粒克隆载体）中间质粒克隆载体 将将T-DNAT-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。共整合克隆载体系统共整合克隆载体系统（T-DNAT-DNA同源序列、同源序列、bom bom 位点）位点）双元克隆载体系统双元克隆载体系统微型微型TiTi质粒质粒 第四十七页，讲稿共一百零八页哦（四）乳酸杆菌质粒克隆载体四）乳酸杆菌质粒克隆载体 乳酸杆菌：乳酸杆菌：G G+，非致病，益生菌，用于食品和饮料。，非致病，益生菌，用于食品和饮料。乳酸杆菌质粒：乳酸杆菌质粒：小质粒，宿主范围广泛，可用于其它小质粒，宿主范围广泛，可用于其它G G+菌及菌及大肠杆菌。大肠杆菌。乳酸杆菌质粒克隆载体的构建：乳酸杆菌质粒克隆载体的构建：用于其它用于其它G G+菌及大肠杆菌菌及大肠杆菌;乳酸杆菌本身对乳酸杆菌本身对kmkm、ApAp抗性较强。抗性较强。标记基因：标记基因：选用选用lacZlacZ，如有，如有pLJ1pLJ1复制启始位点的复制启始位点的pBG10 pBG10 选用选用eryery，如有，如有p353-2p353-2复制启始位点的复制启始位点的pP3537pP3537第四十八页，讲稿共一百零八页哦（五）酵母（五）酵母2m2m质粒克隆载体质粒克隆载体 几乎所有几乎所有酿酒酵母酿酒酵母中都存在中都存在（1 1 1 1）2m2m2m2m质粒结构质粒结构 a a、环状分子内有反向环状分子内有反向重复序列重复序列IR1IR1和和和和IR2IR2，可，可发生重组，形成发生重组，形成A A A A、B B B B型型质粒；有质粒；有oriori复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点能自主复制。能自主复制。能自主复制。能自主复制。图图3-103-10A A型酵母型酵母2m2m质粒质粒b b b b、202080808080个个个个/细胞。有细胞。有丝分裂时数目稳定，减丝分裂时数目稳定，减数分裂时形成数分裂时形成circir+/cir/cir/cir/cir0 0第四十九页，讲稿共一百零八页哦 （2 2）YEpYEp克隆载体（酵母游离型质粒）克隆载体（酵母游离型质粒）2m2m质粒的质粒的orioriEcoREcoR酶切酶切 pBR322pBR322质粒质粒酵母染色体酵母染色体URA3URA3基因基因HindHind酶切酶切 YEp24 YEp24 第五十页，讲稿共一百零八页哦特征特征 （1 1）保留了）保留了pBR322pBR322的的和和筛选大肠杆菌克筛选大肠杆菌克隆子隆子 （2 2）含）含URA3URA3标记标记筛选酵母菌克隆子筛选酵母菌克隆子 （3 3）URA3URA3基因基因补偿酵母菌补偿酵母菌ura3ura3突变突变 优点优点 （1 1）是一种）是一种穿梭质粒穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2 2）转化率高转化率高，1gDNA1gDNA可获得约可获得约10104 410105 5个克隆子个克隆子 （3 3）稳定高拷贝复制稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因故可用酵母菌高水平表达外源目的基因第五十一页，讲稿共一百零八页哦（六）（六）TATA克隆载体克隆载体针对针对PCRPCR产物的克隆产物的克隆 故可研制一种线性载体，其故可研制一种线性载体，其55端各带一不配对端各带一不配对T T，可直接，可直接与与PCRPCR产物以产物以TATA连接进行克隆，即连接进行克隆，即TATA克隆克隆。原理原理 PCRPCR产物在产物在TaqTaq酶的非酶的非模板依赖活性作用下，于模板依赖活性作用下，于33端加一非配对的端加一非配对的A A。第五十二页，讲稿共一百零八页哦第五十三页，讲稿共一百零八页哦T TA A克克隆隆第五十四页，讲稿共一百零八页哦TATA载体的再生方法载体的再生方法 （1 1）克隆载体线性化）克隆载体线性化 （2 2）克隆载体末端补平反应）克隆载体末端补平反应 （3 3）克隆载体末端加）克隆载体末端加T T反应反应 注：再生后的注：再生后的TATA载体，原线性化的酶切位载体，原线性化的酶切位点消失点消失第五十五页，讲稿共一百零八页哦5-GGCTGGCTGG NNNCAGGTATATTGNNNNGTAAAC AAATTGACGC-3LB5-TATCAGTGGT GACAGGATATATTGGCGCGTAAAC AAATTGACGC-3RB图图 T-DNAT-DNA的的LTSLTS核苷酸序列（核苷酸序列（LBLB）和）和RTSRTS核苷酸序列（核苷酸序列（RBRB）第五十六页，讲稿共一百零八页哦MCS连杆连杆第五十七页，讲稿共一百零八页哦第二节 病毒（噬菌体）克隆载体病毒病毒基本结构：基本结构：DNADNA（或（或RNARNA）+外壳蛋白外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为感染细菌的病毒，称为噬菌体噬菌体 分类（根据病毒与宿主的关系）分类（根据病毒与宿主的关系）温和性病毒：温和性病毒：溶原性增殖溶原性增殖构建病毒载体构建病毒载体 烈性病毒：烈性病毒：溶菌性增殖溶菌性增殖改造后改造后 第五十八页，讲稿共一百零八页哦一、一、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（一）（一）噬菌体性质噬菌体性质 DNA+DNA+外壳蛋白外壳蛋白 1 1、DNA(48.5kb)DNA(48.5kb)噬菌体中：线性噬菌体中：线性 宿主细胞：环状宿主细胞：环状(cos(cos位点位点)第五十九页，讲稿共一百零八页哦2 2、噬菌体噬菌体基因组有基因组有基因基因5050个以个以上上J J与与N N、P P与与Q Q之间为之间为非必非必需序列需序列第六十页，讲稿共一百零八页哦3 3、限制性核酸内切酶位点限制性核酸内切酶位点:56 56种（种（p477p477）4 4、噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径 溶菌溶菌生长途径生长途径 溶原溶原生长途径生长途径宿主合成宿主合成int基因产物基因产物-DNA整整合到染色体合到染色体DNA上上某种胁迫条件下某种胁迫条件下合成合成six基基因产物因产物-DNA脱离细菌染色体脱离细菌染色体溶菌溶菌第六十一页，讲稿共一百零八页哦（二）构建依据（二）构建依据 1 1、噬菌体是一种温和噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体 2 2、能承载较大的外源、能承载较大的外源DNADNA片段片段 野生型野生型DNADNA头部可包装约头部可包装约36.436.451kb(51kb(自身的自身的75%75%105%)105%)，且约有，且约有20kb DNA20kb DNA可缺失（生可缺失（生长非必需）长非必需）3 3、在、在DNADNA上有多种限制性内切酶位点上有多种限制性内切酶位点 第六十二页，讲稿共一百零八页哦（三）构建的基本策略与技术路线（三）构建的基本策略与技术路线 策略策略:切去部分非必需区切去部分非必需区删掉多余的限制性内切酶位点删掉多余的限制性内切酶位点插入选择性标记基因插入选择性标记基因建立体外包装系统建立体外包装系统第六十三页，讲稿共一百零八页哦技术路线技术路线 1 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以选定一种酶，以gtWES gtWES 为例，为例，EcoRIEcoRI（48.5kb48.5kb）DNA DNA E co R I E co R I 6 6个片段个片段 第六十四页，讲稿共一百零八页哦uB B片段是片段是噬菌体生长非必需的；噬菌体生长非必需的；uC C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；uE E片段去掉片段去掉min5min5序列（序列（2.6kb2.6kb）。）。两端两端EcoR IEcoR I别点经点突变或甲基化别点经点突变或甲基化处理，即得处理，即得gtWESgtWES：（：（48.5-5.5-2.6=40.4kb48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力：克隆能力：替换替换B B：最大：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（实际应用时克隆能力略有出入（p109,p109,表表3-53-5）4.9kb21.6kb5.5kb7.5kb5.9kb3.3kb第六十五页，讲稿共一百零八页哦 2 2、在、在DNADNA的非必需区内插入选择标记基因的非必需区内插入选择标记基因（1 1）自然筛选）自然筛选（51kb51kb或或36.4kb36.4kb不能包装）不能包装）（2 2）插入选择标记基因）插入选择标记基因 取代取代redred和和gamgam基因基因野生型野生型噬菌体噬菌体(Spi+(Spi+表型表型)在在P2P2噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中不能不能生长生长（redred、gamgam基因基因）外源外源DNADNA取代取代 获获Spi-Spi-表型表型 在在P2P2噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中能能生长生长 redred、gamgam基因基因 局限性：局限性：只能以只能以P2P2噬菌体溶原细胞作为受体噬菌体溶原细胞作为受体 最常用的筛选标记：最常用的筛选标记：Lac ZLac Z基因基因第六十六页，讲稿共一百零八页哦3 3、建立重组、建立重组DNADNA分子体外包装系统分子体外包装系统体外重组体外重组DNADNA分子必须经分子必须经体外包装体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。受体细胞。野生型野生型噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。(见教材解释：见教材解释：新版新版p115)p115)D D-（D D基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）受体细胞受体细胞积累除积累除D D蛋白以外所有蛋白质蛋白以外所有蛋白质E E-（E E基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）受体细胞受体细胞积累除积累除E E蛋白以外所有蛋白质蛋白以外所有蛋白质混合混合 D D、E E互补互补 包装包装DNADNA分子分子 噬菌体噬菌体 如如:菌株菌株BHB2688(EBHB2688(E-)+BHB2690(D)+BHB2690(D-)第六十七页，讲稿共一百零八页哦（四）（四）噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用 1 1、建立、建立c DNAc DNA基因文库基因文库 转导转导(transduction)(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。的遗传信息转移过程。效率高效率高。转染转染(transfection)(transfection)指真核细胞主动或者被指真核细胞主动或者被动导入外源动导入外源DNA DNA 片段而获得新表型的过程。片段而获得新表型的过程。2 2、克隆外源目的基因、克隆外源目的基因第六十八页，讲稿共一百零八页哦（五）重组DNA分子的体外包装（自学）1 1、溶原菌、溶原菌BHB2688(EBHB2688(E-)和和BHB2690(DBHB2690(D-)的检的检验验2 2、制备包装物、制备包装物3 3、体外包装、体外包装第六十九页，讲稿共一百零八页哦（一）构建策略（一）构建策略 由由质粒质粒和和含含coscos位点的位点的DNADNA片段片段组装成的载体，即组装成的载体，即cosmidcosmid克隆载体克隆载体,又叫粘粒又叫粘粒;或：或：cosmidcosmid克隆载体是一类带克隆载体是一类带有噬菌体有噬菌体DNADNA粘性末端顺序的粘性末端顺序的质粒质粒DNADNA分子。是分子。是噬菌体质噬菌体质粒粒混合物。混合物。二、二、cosmidcosmid克隆载体（柯斯质粒载体）克隆载体（柯斯质粒载体）第七十页，讲稿共一百零八页哦（二）（二）cosmidcosmid的特征的特征 (教材新版教材新版p118)p118)1 1、环形双链、环形双链DNADNA分子分子,36.4kb,36.4kb,一般一般10kb10kb 2 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制制 3 3、含有一个、含有一个coscos位点位点 A A蛋白蛋白 coscos末端末端体外包装成为噬菌体，体外包装成为噬菌体，但不含但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNADNA复制系复制系统，不会产生子代噬菌体统，不会产生子代噬菌体第七十一页，讲稿共一百零八页哦4 4、cosmidcosmid较小，可承载更大的外源较小，可承载更大的外源DNA DNA 若若cosmidcosmid为为6.5kb6.5kb，则可承载，则可承载44.5(51-6.5)kb44.5(51-6.5)kb外源外源DNADNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。因此，因此，cosmidcosmid克隆广泛用于构建基因组文库。克隆广泛用于构建基因组文库。第七十二页，讲稿共一百零八页哦（三）柯斯克隆(Cosmid cloning)(1)(1)定义定义 应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组主细胞中克隆大片段的真核基因组DNADNA的技的技术，叫做柯斯克隆。术，叫做柯斯克隆。这个定义的三个要点是：这个定义的三个要点是：a.a.柯斯质粒作载体；柯斯质粒作载体；b.b.大肠杆菌为寄主大肠杆菌为寄主;c.c.克隆大片段的真核基因组克隆大片段的真核基因组DNADNA。第七十三页，讲稿共一百零八页哦（2）理论依据a.a.在在 phagephage线性线性DNADNA分子的每一端都具有彼此互补的单分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的链突出序列，即所谓的粘性末端粘性末端(cos(cos位点位点)b.b.phagephage的的多连体分子多连体分子是由是由coscos连接而成的。连接而成的。cos cos cos cos cos coscos cos cos cos cos cosc.c.末端酶末端酶(treminase)(treminase)或叫或叫TerTer体系体系即即 phagephage具有一具有一种位点特异的切割体系种位点特异的切割体系(site-specific cutting(site-specific cutting systemsystem).A).A蛋白蛋白*此系统能识别两个相距适宜的此系统能识别两个相距适宜的(36.436.451kb51kb)cos)cos位点，位点，并切割之。并切割之。*根据上述分析可知根据上述分析可知 phage DNAphage DNA包装的两个必要条件是：包装的两个必要条件是：coscos位点、位点、TerTer体系（体系（A A蛋白）蛋白）第七十四页，讲稿共一百零八页哦（3）柯斯质粒包装条件 由于只有在被作用的由于只有在被作用的 DNADNA分子具有两个分子具有两个coscos位点，位点，而且它们之间距离保持在而且它们之间距离保持在36.436.451kb51kb的条件下，的条件下，TerTer体体系才能对它发生作用。系才能对它发生作用。据此推断：据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个个coscos位点。位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNADNA片段重组成片段重组成具有具有两个两个coscos位点位点而且相距达而且相距达36.436.451kb51kb之间时，才能之间时，才能被包装。被包装。(见应用新版见应用新版p119)p119)第七十五页，讲稿共一百零八页哦 利用利用Cos质粒进行克隆质粒进行克隆 第七十六页，讲稿共一百零八页哦（四）使用（四）使用cosmidcosmid载体的基本程序载体的基本程序 利用利用cosmidcosmid的的质粒质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用利用cosmidcosmid的的噬菌体噬菌体性质性质转导受体细胞（下图）转导受体细胞（下图）第七十七页，讲稿共一百零八页哦三、三、M13M13噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体（单链丝状噬菌体载体 ）第七十八页，讲稿共一百零八页哦含复制起始位点含复制起始位点及可插入外源及可插入外源DNAD