基因工程重组体转入受体细胞讲稿.ppt

基因工程重组体转入受基因工程重组体转入受体细胞体细胞1第一页，讲稿共四十一页哦第二页，讲稿共四十一页哦第五章第五章 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞第一节第一节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞第二节第二节 重组重组DNA导入真核细胞导入真核细胞第三页，讲稿共四十一页哦第一节第一节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌第四页，讲稿共四十一页哦1.目的目的增加受体菌增加受体菌细胞膜的通细胞膜的通透性。透性。一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备第一节第一节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞第五页，讲稿共四十一页哦使用丧失了使用丧失了限制体系限制体系的大肠杆菌。如的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。系列的大肠杆菌。2.菌种菌种第六页，讲稿共四十一页哦第七页，讲稿共四十一页哦用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理制备原理第八页，讲稿共四十一页哦4.制备过程制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心离心收集菌收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻冻存存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬第九页，讲稿共四十一页哦二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（1）转化（）转化（transformation)（3）转染（）转染（transfection)1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（2）转导（）转导（transduction)第十页，讲稿共四十一页哦转化：转化：通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转化(transformation)第十一页，讲稿共四十一页哦转导转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及转移及基因重组即为转导作用基因重组即为转导作用转导(transduction)第十二页，讲稿共四十一页哦转染染(transfection)(transfection)l l转转染是染是染是染是转转化的一种特殊形式。化的一种特殊形式。化的一种特殊形式。化的一种特殊形式。由由由由transformationtransformation（转转化）化）化）化）和和和和 infectioninfection（感染）两（感染）两（感染）两（感染）两词词构成。构成。构成。构成。l l原指将噬菌体、病毒或以其原指将噬菌体、病毒或以其原指将噬菌体、病毒或以其原指将噬菌体、病毒或以其为载为载体构建的重体构建的重体构建的重体构建的重组组子子子子导导入入入入受体受体受体受体细细胞的胞的胞的胞的过过程。程。程。程。l l通通通通过过感染方式感染方式感染方式感染方式将外来将外来将外来将外来DNADNA引入宿主引入宿主引入宿主引入宿主细细胞，并胞，并胞，并胞，并导导致宿主致宿主致宿主致宿主细细胞胞胞胞遗传遗传性状改性状改性状改性状改变变的的的的过过程称程称程称程称为为转转染染染染。l l将任何将任何将任何将任何类类型型型型DNADNA转转移至移至移至移至动动物物物物细细胞内的胞内的胞内的胞内的过过程均可叫程均可叫程均可叫程均可叫转转染。染。染。染。第十三页，讲稿共四十一页哦例：溶菌时，裂解的例：溶菌时，裂解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。转化（转化（transformation)第十四页，讲稿共四十一页哦噬菌体的生活史噬菌体的生活史例例转导（转导（transduction)第十五页，讲稿共四十一页哦每每 gDNA转化成功的细菌克隆数。转化成功的细菌克隆数。3.转化方法转化方法 2.转化率转化率简单简单，但转化效率不高（，但转化效率不高（106-108/gDNA）。）。（1）热休克法（）热休克法（heat shock）转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）。）。（2）电转化法）电转化法第十六页，讲稿共四十一页哦10ng载体载体DNA100 L感受感受态菌态菌On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素液涂含抗菌素的平板的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法）热休克法第十七页，讲稿共四十一页哦LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离心离心集菌集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体2C离心收离心收集菌体集菌体少量冰冷的少量冰冷的水重悬水重悬分装成分装成50-300 L电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNAOn ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速震中速震荡荡60分钟分钟10-100 L转化液涂含转化液涂含抗菌素的平板抗菌素的平板转化转化（2）电转化法）电转化法第十八页，讲稿共四十一页哦4.平板培养平板培养基培养细菌基培养细菌10-100 L转化转化液液涂于含抗菌涂于含抗菌素的平板素的平板37过夜过夜第十九页，讲稿共四十一页哦环形重组质粒环形重组质粒质粒自我连接质粒自我连接线性载体或线性载体或DNADNA片断进入细菌会被降解。片断进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒）重组质粒 5.影响转化率的因素影响转化率的因素第二十页，讲稿共四十一页哦目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第二十一页，讲稿共四十一页哦生长状态生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜增加通透性。要充分，使细菌细胞膜增加通透性。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)第二十二页，讲稿共四十一页哦把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包包装成具有感染能力的装成具有感染能力的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）第二十三页，讲稿共四十一页哦cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，染细菌后，在在32下培养细菌时能够保持溶源下培养细菌时能够保持溶源性。性。但当温度升高到但当温度升高到4445时，就会导致时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳复制、外壳蛋白合成。蛋白合成。（2）cI857基因突变的基因突变的 噬菌体噬菌体 第二十四页，讲稿共四十一页哦 噬菌体噬菌体1外壳蛋白基因外壳蛋白基因E发生了无义突变，发生了无义突变，不能合不能合成头部蛋白成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。（尾部蛋白）。在在cI857基因突变的基因突变的 噬菌体的基础上，选择噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型两种外壳蛋白的突变型 噬菌体。噬菌体。（3）互补型噬菌体互补型噬菌体 外壳蛋白基因外壳蛋白基因D发生了无义突变，发生了无义突变，不能不能合成头部的包装识别蛋白合成头部的包装识别蛋白，但能合成其，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体噬菌体2第二十五页，讲稿共四十一页哦E基因突变只合成尾部蛋白和包装识别蛋白D基因突变合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装DNA提取尾部蛋白提取头部和尾部蛋白重组的载体DNA体外包装成活性噬菌体第二十六页，讲稿共四十一页哦(4)体体外外包包装装过过程程 第二十七页，讲稿共四十一页哦体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每 g DNA能形成能形成106噬菌斑）。噬菌斑）。（5）转导转导 第二十八页，讲稿共四十一页哦第二十九页，讲稿共四十一页哦第二节第二节 外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞二、导入植物细胞二、导入植物细胞三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞第三十页，讲稿共四十一页哦转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第二节第二节 外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第三十一页，讲稿共四十一页哦（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化第三十二页，讲稿共四十一页哦 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态 40%PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化第三十三页，讲稿共四十一页哦叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、导入植物细胞二、导入植物细胞1.叶盘法（叶盘法（leaf disk)第三十四页，讲稿共四十一页哦植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶和纤维素酶和果胶酶果胶酶DNA混合入电混合入电击缓冲液击缓冲液1-2kV,3-25 F电电击击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化2.电击法（电击法（electroporation)第三十五页，讲稿共四十一页哦又称又称高速微型子弹射击法（高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入3.基因枪法（基因枪法（gene gun）第三十六页，讲稿共四十一页哦基因枪基因枪第三十七页，讲稿共四十一页哦（1）原理：）原理：三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲盐水与）缓冲盐水与含有氯化钙和含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和含磷酸钙和DNA的沉淀。的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。第三十八页，讲稿共四十一页哦不需要载体。不需要载体。（2）特点：）特点：第三十九页，讲稿共四十一页哦脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。2.脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。第四十页，讲稿共四十一页哦直接把外源直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。整合到染色体上。3.显微注射法显微注射法(microinjection)第四十一页，讲稿共四十一页哦