实验动物胚胎工程技术 (2)课件.ppt

关于实验动物胚胎工程技术(2)现在学习的是第1页，共76页2022/9/292第一节第一节 概述概述工程工程:通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达到预想通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达到预想的目的。的目的。生物工程：生物工程：按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生产、研究、按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生产、研究、检定和创造新物种的综合性科学技术。检定和创造新物种的综合性科学技术。遗传（基因）工程遗传（基因）工程蛋白质工程蛋白质工程酶工程酶工程细胞工程细胞工程微生物工程微生物工程 胚胎工程胚胎工程 组织工程组织工程分子水平分子水平细胞水平细胞水平组织水平组织水平现在学习的是第2页，共76页2022/9/293 胚胎工程（胚胎工程（Embryonicengineering）又称胚胎技术又称胚胎技术,是指用工程学的原理对动是指用工程学的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生物物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称。技术的总称。一、胚胎操作基本技术 1.超数排卵和卵母细胞、精子、受精卵的采集 2.体外受精 3.胚胎性别控制 4.胚胎分割 5.胚胎培养 6.胚胎移植 7.胚胎冷冻保存二、体细胞克隆技术 三、干细胞技术四、外源基因导入技术现在学习的是第3页，共76页2022/9/294胚胎工程的应用胚胎工程的应用1.1.畜畜牧牧业业：通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术，加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。现在学习的是第4页，共76页2022/9/2952.2.生物制药：生物制药：通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上，使其在乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性蛋白，用于预防和治疗某些人类的疾病。已在乳腺表达的生物活性蛋白并进入临床2期或3期试验：抗凝血酶一抗胰蛋白酶蛋白C乳铁蛋白乳糖酶现在学习的是第5页，共76页2022/9/2963.3.医医学学：通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症的治疗；通通过过对对胚胚胎胎培培养养和和检检测测，剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生优育的目的。剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生优育的目的。4.4.生生命命科科学学研研究究：阐明哺乳动物早期胚胎发生、发育机制等基础理论。5.5.拯拯救救濒濒危危野野生生动动物物：通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物的种群。现在学习的是第6页，共76页2022/9/297第二节第二节 胚胎操作基本技术胚胎操作基本技术现在学习的是第7页，共76页2022/9/298胚胎操作的整个过程局限在胚胎的早期发育现在学习的是第8页，共76页2022/9/299一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数排卵一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数排卵1.精子的采集 啮齿类小动物精子的采集大都从体成熟雄性动物的附睾获取。将动物处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠的液滴，置培养液中培养。大动物的精子采集可采用假阴道或电刺激法促进雄性射精，收集精液。解剖取附睾尾部解剖取附睾尾部精子的获取和培养精子的获取和培养现在学习的是第9页，共76页2022/9/29102.卵母细胞和受精卵的采集 从体内成熟并排到输卵管中去，需通过处死动物或外科手术获取卵母细胞；如果在交配后，则可获取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或刚死亡的雌性动物的卵巢，从卵巢中分离卵母细胞经培养而得。小鼠解剖取输卵管小鼠解剖取输卵管从输卵管壶腹部取卵母细胞从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法受精卵的方法现在学习的是第10页，共76页2022/9/29113.超数排卵（Superovolation）技术：通过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动物卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三种常用。现在学习的是第11页，共76页2022/9/2912检查阴栓：妊娠0.5天中午12时中午12时上午8时24小时24小时20小时注射PMSG注射HCG小鼠超数排卵程序放到种公鼠笼内受精卵注射PMSG注射HCG晚上5-6时晚上5-6时24小时24小时卵母细胞采 集15小时现在学习的是第12页，共76页2022/9/2913二、体外受精二、体外受精q体外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子与卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。这一过程包括卵母细胞的收集或未成熟卵母细胞的培养成熟、精子的获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养等。q 体外受精（IVF）联合胚胎移植技术又称试管婴儿技术。现在学习的是第13页，共76页2022/9/2914三、胚胎性别控制三、胚胎性别控制性别控制的研究，是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这项技术的应用，可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们的意愿只生产同一性别动物。在医学上，性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定，则可避免男性患儿的出生。现在学习的是第14页，共76页2022/9/2915性别控制技术1.通过对X精子与Y精子分离以控制性别。2.在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控制性别。3.通过控制饲料特性、受精环境如改变精液或阴道的PH值等来控制性别。现在学习的是第15页，共76页2022/9/2916（一）分离X精子与Y精子以控制性别 分离X精子与Y精子的依据：X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。将X和Y精子分离再通过人工授精可以有效地达到性别控制的目的。目前将X和Y精子分离的方法有沉降法、电泳法、免疫法和流式细胞仪法等。流式细胞仪法是当前分离X、Y精子较准确的方法，具有重复性、科学性和有效性的特点。现在学习的是第16页，共76页2022/9/2917 应用流式细胞仪分离X和Y精子的原理：X精子的DNA含量比Y精子的高。对于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8，由于染料着色量与精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，发出的荧光就比Y精子强。正常人染色体正常人染色体现在学习的是第17页，共76页2022/9/2918具体的做法：先用DNA特异性染料对精子进行活体染色，然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束。探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电。即X精子带上正电荷，Y精子带上负电荷。当经过高压电场时会向不同方向偏转，达到分离的目的。现在学习的是第18页，共76页2022/9/2919（二）对胚胎进行鉴定以控制性别 在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近年来得到迅速的发展。Y染色体短臂上有决定雄性的DNA片段-SRY基因(sex-determining region of Y-chromosome,全称:Y染色体性别决定区)，为胚胎性别鉴定提供了可靠的途径。现在学习的是第19页，共76页2022/9/2920现在学习的是第20页，共76页2022/9/2921四、胚胎培养四、胚胎培养 胚胎培养是指将获得的早期胚胎在体外人工环境中进行培养，胚胎培养是指将获得的早期胚胎在体外人工环境中进行培养，以观察其发育或人工干预某一发育过程的可能性。以观察其发育或人工干预某一发育过程的可能性。受精卵受精卵2 2细胞胚细胞胚4 4细胞胚细胞胚8 8细胞胚细胞胚桑椹胚桑椹胚囊囊 胚胚现在学习的是第21页，共76页2022/9/2922胚胎培养一般应用于以下几个方面：1.未成熟卵母细胞通过体外培养，成熟后进行体外受精。2.受精卵通过体外培养发育成各阶段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷冻保存。3.冷冻保存胚胎解冻后，通过体外培养，筛选成活胚胎用于胚胎移植。4.通过研究胚胎发育的环境和条件，不断完善胚胎培养条件，揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。目前胚胎培养技术已经可以将未成熟卵在体外成熟，并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。即使如此，在体外胚胎培养也只能发育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到动物的子宫内。现在学习的是第22页，共76页2022/9/2923五、胚胎移植五、胚胎移植-胚胎工程的最后一道工序 将受精卵或发育到一定时期的早期胚胎,移植到受体动物生殖管道的一定部位,能在子宫内着床、生长、发育、分娩、出生仔代动物的技术称为胚胎移植。几乎所有的胚胎工程技术在体外完成对胚胎的操作后，都需经过胚胎移植这一步骤，得到我们所要的动物。现在学习的是第23页，共76页2022/9/2924体外培养的胚胎必须移植到同步发情的雌性动物生殖管道内。1.利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到。2.通过注射某些激素(如孕激素、雌激素等)诱发同期发情。不同发育阶段的胚胎移植的部位不同。受精卵和2细胞胚胎应移植到输卵管内，而桑椹胚和囊胚期胚胎应移植到子宫内，以跟正常妊娠生殖生理变化同步。现在学习的是第24页，共76页2022/9/2925同一种属内的不同品种品系可互相进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封闭群ICR的生殖管道内；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西兰兔的生殖管道内。这一特点在畜牧业特别有用，如为了加快良种奶牛的繁殖，可将良种奶牛的胚胎移植到普通黄牛的生殖管道内，借腹怀胎。现在学习的是第25页，共76页2022/9/2926六、胚胎冷冻保存六、胚胎冷冻保存 胚胎冷冻保存（embryo cryopreservation）技术是指在低温（-196液氮内）条件下利用低温保护剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。现在学习的是第26页，共76页2022/9/2927（一）胚胎冷冻保存的机制 低温降低了胚胎内的生化反应速度。并且温度越低，保存时间就越长。低温损伤：如果冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤；如果冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。在复温（解冻）过程中，如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰（重结冰）而损伤。现在学习的是第27页，共76页2022/9/2928q采用低温保护剂防止低温损伤：二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等可以避免或减少结冰的程度与速度，降低细胞周围未冻结溶液中的电解质浓度，从而避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。现在学习的是第28页，共76页2022/9/2929（二）胚胎冷冻保存技术的应用 1.应用于实验动物的育种和保种。应用于实验动物胚胎的长途运输。应用于实验动物的生物净化。应用于珍稀或濒危动物种质保存。现在学习的是第29页，共76页2022/9/2930第三节第三节 动物体细胞克隆技术动物体细胞克隆技术现在学习的是第30页，共76页2022/9/2931q克隆（clone）的概念 克隆是指无性繁殖或拷贝。无性生殖在植物中很常见，在动物中过去认为是不可能的。动物克隆是指动物通过体细胞核移植后生产出基因型几乎与供体完全相同的后代。现在学习的是第31页，共76页2022/9/2932q 核移植（Nuclear transfer）是指将动物细胞的细胞核移植到另一个体的去核卵母细胞胞质中，通过电激活，使供体核重编程序，形成的重构卵在体外培养成胚胎，最后通过胚胎移植，使之发育成个体。q 如果受体去核卵和供体移入的核来自同种动物，则称种内核移植，来自不同的种则称为种间核移植。q核移植由于没有经过精子和卵子的受精过程，核移植动物的全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核的动物，因而把它俗称为“克隆”。现在学习的是第32页，共76页2022/9/2933 根据供体核的来源不同，核移植包括以下几种：1.胚胎细胞核移植：未着床前的囊胚（未分化）2.胚胎干细胞核移植（未分化）3.胎儿成纤维细胞：出生前的胎儿（未分化或低分化）4.成年体细胞（已分化）现在学习的是第33页，共76页2022/9/2934动物克隆的实验过程动物克隆的实验过程现在学习的是第34页，共76页2022/9/2935动物克隆技术的意义与应用动物克隆技术的意义与应用加快良种家畜的繁殖速度与体细胞转基因技术结合，能制备大家畜转基因动物拯救濒危野生动物治疗性克隆，用于再生医学现在学习的是第35页，共76页2022/9/2936再生医学技术路线简介再生医学技术路线简介现在学习的是第36页，共76页2022/9/2937第四节第四节 干细胞技术干细胞技术现在学习的是第37页，共76页2022/9/2938一、概述干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。根据发育阶段，可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cells，AS细胞)。ES细胞存在于囊胚期胚胎的内细胞团中，是全能性、无限增殖的干细胞，在胚胎的生长发育过程中具有分化形成胎儿所有类型细胞、组织和器官的潜能。AS细胞是ES细胞定植于胎儿和成人的各种组织和器官中的“种子”，具有自我更新和分化为组织特异细胞的能力，即分化为相应组织和器官中细胞的“专能”细胞，包括神经干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、精原干细胞、皮肤干细胞和肝脏干细胞等。现在学习的是第38页，共76页2022/9/2939现在学习的是第39页，共76页2022/9/2940诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS 细胞)2006年,Takahashi等首次发现导入特定的转录因子基因能够使已分化的细胞重编程回归到胚胎细胞状态。他们通过慢病毒载体介导将Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 种转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞,获得了具有强大的自我更新能力和分化潜能的多能性干细胞,命名为iPS 细胞。这一研究克服了ES细胞和AS细胞应用存在的诸多问题，展现了广阔的应用前景，受到了整个生命科学领域的广泛关注。目前研究中较为理想的供体细胞主要有淋巴细胞(如T细胞和B细胞等)、脂肪细胞和皮肤成纤维细胞。现在学习的是第40页，共76页2022/9/2941二、胚胎干细胞（ES细胞)来源：ES细胞是从胚胎发育早期囊胚（人胚胎受精后约5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的内细胞群分离出来的未分化细胞。内细胞群:具有未分化特性，可进一步分裂,分化形成内、中、外三个胚层。外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等 中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织 内胚层将分化为肝、肺和肠等由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群分离出来后在体外培养时，我们称之为ES细胞。现在学习的是第41页，共76页2022/9/2942 目前除了从目前除了从小鼠、大鼠小鼠、大鼠和和人人分离分离得到并建立得到并建立ESES细胞系外，还未从其细胞系外，还未从其它动物的囊胚中分离到它动物的囊胚中分离到ESES细胞系。细胞系。现在学习的是第42页，共76页2022/9/2943（二）ES细胞的培养 ES细胞的培养条件极其苛刻，对培养液、试剂、胎牛血清、水等均需采用胚胎级，对培养器皿等必须清洗干净。一旦条件不适合，ES细胞容易发生分化，从而失去ES细胞的特性。未分化ES细胞的培养一般需要与用丝裂霉素处理过的成纤维细胞饲养层（Feeder cell）共培养，饲养层细胞为ES细胞提供细胞因子来维持其未分化状态。在培养液中加用白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）能更有效地维持未分化的ES细胞。现在学习的是第43页，共76页2022/9/2944（三）ES细胞的鉴定 ES细胞是一种正常的胚胎性干细胞，具有正常的染色体核型和体内外分化的潜能。在建系之初需要对其核型、分化能力和细胞标志物进行鉴定 1核型 2体外分化试验 将ES细胞在无饲养层、低胎牛血清的培养液中悬浮培养，数天后形成胚样小体（embryoid bodies）的内皮样大型细胞团；向成纤维细胞、心肌细胞以及造血细胞的分化。3体内分化试验 将ES细胞悬液注射到同性别小鼠的腹股沟皮下，2周后注射部位出现肿块，病理检查为畸胎瘤。畸胎瘤内部有多种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、成纤维细胞以及干细胞集落等，也可看到各胚层组织的分化，如软骨、肌肉组织、上皮组织及腺体等。4ES细胞的标志物 Oct-4:Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）属POU转录因子一员，它在全能胚胎干细胞(ES)和生殖细胞表达。该表达对于维持干细胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化导致Oct-4的下调。SSEAs:人ES细胞表达SSEA-3和SSEA-4，但不表达SSEA-1。小鼠ES细胞表达SSEA-1，但不表达SSEA-3或SSEA-4。现在学习的是第44页，共76页2022/9/2945（四）胚胎干细胞的应用1.用于研究哺乳动物个体的发生发育规律由于ES细胞可分化为胚胎内胚层、中胚层和外胚层中任何一种类型细胞，因此可用遗传标记的ES细胞(如标记半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通过组织化学染色追踪ES细胞的分化特点，探索胚胎发育过程中细胞分化、组织和器官形成的规律。小鼠的ES细胞已成为研究哺乳动物早期发育规律的重要工具之一。现在学习的是第45页，共76页2022/9/2946 2.在体外研究细胞的分化规律 ES细胞仅在饲养层细胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白细胞介素-6(IL-6)的培养液中维持不分化状态。当培养液中添加分化诱导剂，如牛黄酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、丁酰环腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可诱导ES细胞发生不同类型的分化，通过研究ES的分化特点可揭示细胞分化和凋亡机理。现在学习的是第46页，共76页2022/9/2947 3.用于研究基因的功能和制备基因敲除动物 由于用ES细胞可进行基因打靶，容易获得基因敲除或定向插入外源基因的ES细胞，因此是基因敲除和基因插入的首选细胞。通过筛选获得阳性细胞，然后用嵌合体或细胞核移植技术获得转基因动物。用于研究未知基因的生物学功能。现在学习的是第47页，共76页2022/9/2948 4.治疗人类的某些难治性疾病 人类由于细胞坏死、退化或功能异常引起的疾病，如帕金森综合症、少年糖尿病和老年痴呆症等，已成为医学上尚未攻克的顽症。利用ES细胞可以诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。现在学习的是第48页，共76页2022/9/2949 5.培育出人造组织器官，用于器官移植 随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。现在学习的是第49页，共76页2022/9/2950三、成体干细胞1.成体干细胞（AS细胞）的来源 AS细胞位于出生后体内分化成熟的组织之中，具有自我更新和分化潜能，它在分裂时可产生两个子代细胞，一个与原来干细胞完全一致，另一个向前分化，形成相应组织的多功能干细胞，通过分化增殖和更新衰老细胞来构筑相应的器官，维持正常生理功能。现在可从骨髓和血液、胎盘、脐带、肌肉、大脑、皮肤、脂肪、滑膜等多种组织中获取各种多能干细胞。现在学习的是第50页，共76页2022/9/29512.AS细胞的培养和诱导定向分化取所要分离AS细胞的组织，用酶消化法分散细胞进行体外培养。再用各种技术从体外培养细胞中分离AS细胞，如用免疫磁珠分离系统分离乳腺AS细胞。同ES细胞一样，AS细胞的诱导定向分化需要细胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。通常情况下，供体干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。然而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律，如神经外胚层来源的NSC能分化为中胚层来源的细胞如肌细胞，肌肉干细胞会分化为各种血细胞系等。所有干细胞中，来源于骨髓的干细胞在多向性分化方面具有较大的潜能，分为造血干细胞(HSC)和骨髓间质干细胞(MSC)。现在学习的是第51页，共76页2022/9/29523.AS细胞的鉴定 各种AS细胞都有自己的标记物，可利用标记物进行鉴定。4.AS细胞的应用 疾病的替代治疗和移植治疗 如用造血干细胞治疗白血病，将造血干细胞在体外诱导分化成心肌细胞来修复受损伤的心肌，治疗心力衰竭。骨髓来源干细胞及其他来源干细胞都可以分化得到成骨细胞，通过将细胞与支架材料结合后移植于骨骼受损部位，用于修复骨骼缺损。现在学习的是第52页，共76页2022/9/2953四、诱导性多潜能干细胞1.iPS细胞的来源iPS 细胞建立的过程主要包括:分离和培养宿主细胞；通过病毒介导或基因转染的方式将若干个多能性相关的基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4）导入宿主细胞；将基因导入的细胞种植于饲养层细胞上,用ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养液中根据需要加入相应的小分子化合物，以促进重编程。2.iPS细胞的培养和诱导定向分化 其培养条件和诱导定向分化的条件基本与ES细胞相同。3.iPS细胞的鉴定 iPS 细胞的鉴定与ES细胞相同。现在学习的是第53页，共76页2022/9/2954 以病毒为载体，向老鼠的成纤维细胞中注入4个基因，将其改造为细胞，然后在此基础上培育出一个老鼠胚胎，再把它植入代孕实验鼠的体内。20天后，一只黑色的小老鼠出生。再生医学中如何获得病人ES细胞传统技术 1.用病人的皮肤细胞核移植到人去核卵母细胞 人卵母细胞来源问题2.用病人的皮肤细胞核移植到动物去核卵母细胞 伦理问题新技术1.用ES细胞特异转录基因导入人皮肤细胞，直接转化成诱导多能干细胞（iPS）(2007年）安全问题2.miRNAs直接将皮肤细胞转化为iPS(2010年）3.4种小分子化合物组合直接转化体细胞为CiPS（2013年）现在学习的是第54页，共76页2022/9/29554.iPS细胞的应用iPS 细胞与ES细胞相比,具有很多优势。iPS细胞的来源更方便、更丰富，可以通过有限的几个转录因子基因转染，或相关RNA导入，或用小分子化合物直接诱导各种不同动物的体细胞来获取多能性干细胞，而不需要通过ES细胞途径，克服了许多动物至今未分离出ES细胞的问题。iPS细胞的产生不需要早期胚胎或者其他配子的参与，克服了使用人胚胎进行实验的伦理问题，可见iPS细胞必然成为未来相当长一段时间内的研究热点。目前,科学家们已经成功地从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞中诱导并获得iPS 细胞。现在学习的是第55页，共76页2022/9/2956近期利用干细胞进行再生医学动物实验和临床试验的研究报导2013.1.28日本科学家利用日本科学家利用iPS细胞成功再生毛囊细胞成功再生毛囊日本庆应义塾大学的一个研究小组利用人类诱导多功能干细胞（iPS细胞），在实验鼠身体上成功再生了部分毛囊，为治疗脱发症开辟了新道路。2013.5.15日本科学家利用日本科学家利用iPS细胞制成造血干细胞细胞制成造血干细胞有望取代骨髓移植有望取代骨髓移植日本东京大学的研究人员利用能发育成各种细胞的诱导多功能干细胞（iPS细胞）制作出造血干细胞，并能生成淋巴细胞和红细胞等正常的血液细胞。这一成果有助开发替代骨髓移植的血液病治疗新方法。2013.7.18中国科学家用小分子化合物诱导体细胞重编程为中国科学家用小分子化合物诱导体细胞重编程为iPSScience 北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。该成果开辟了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。2013.10.14美国科学家成功利用诱导多能干细胞制造血管美国科学家成功利用诱导多能干细胞制造血管分子治疗分子治疗美国麻省总医院的科学家发明一种新方法，成功将人诱导多能干细胞（hiPS）转化为血管，并在实验动物中长时间存活工作。该方法被认为是利用再生医学技术解决血管疾病问题的一项里程碑式成果。2013.12.3美国科学家首次将美国科学家首次将iPS细胞转化为功能性肺细胞细胞转化为功能性肺细胞自然自然生物技术生物技术美国哥伦比亚大学医学研究中心的科学家首次成功地将人体干细胞转化成了功能性的肺细胞和呼吸道细胞。这一最新成果可以帮助科学家们研究肺部发育、构建肺部疾病建模、筛查药物并最终制造出可供移植的肺部器官。2013.12.28澳大利亚昆士兰大学采用干细胞成功地培育出了肾脏澳大利亚昆士兰大学采用干细胞成功地培育出了肾脏自然自然细胞生物学细胞生物学研究人员设计出一种促进人胚胎干细胞在盘碟中形成自我组装成微型肾脏（mini-kidney）所需的所有细胞类型。现在学习的是第56页，共76页2022/9/29572014.7.1日本科学家用诱导多功能干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症日本科学家用诱导多功能干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症日本京都大学教授井上治久率领的研究小组，利用iPS细胞制作出可变化为神经胶质细胞的前驱细胞，然后向24只患有渐冻症的实验鼠脊髓各移植了约8万个这种细胞。结果发现，移植了前驱细胞的24只渐冻症实验鼠的平均生存期为162天，而没有移植的24只实验鼠仅为150天。2014.9.12日本诱导多能干细胞首次获批进行人体实验日本诱导多能干细胞首次获批进行人体实验自然自然治疗使用的iPS细胞由日本神户理化研究所（RIKEN）发育生物学中心的眼科专家高桥雅代培育而成，将用于治疗与年龄相关的视网膜退化疾病。高桥雅代从罹患这一疾病的患者那儿提取到了皮肤细胞，并将其转化为iPS细胞，接着，诱导iPS细胞变成视网膜色素上皮细胞，最后将其培育成能被植入受损视网膜内的纤薄层。2014.11.26美国斯坦福大学和哥伦比亚大学和奥地利科学院的科学家用美国斯坦福大学和哥伦比亚大学和奥地利科学院的科学家用iPS细胞治疗大疱性表皮松解症细胞治疗大疱性表皮松解症科学科学转化医学转化医学取患者的皮肤细胞进行培养，用病毒将矫正性的基因送入细胞诱导成iPS细胞，然后将这些细胞移植回患者腿部。这些细胞移植到小鼠身上之后，长成了人类皮肤，也生产了正确的胶原蛋白。2014.11.27日本科学家首次用成体干细胞培养出肾脏组织日本科学家首次用成体干细胞培养出肾脏组织干细胞干细胞日本冈山大学和杏林大学的研究人员从成年实验鼠肾脏内采集了成体干细胞，在培养皿内制作出细胞团块，然后将细胞团块放入凝胶状物质中，再加入促其生长的特殊蛋白质。3至4周后，他们培养出了50至100个类似肾单位的立体管状组织。这些组织中含有肾小管和肾小球等结构，并具有部分肾脏的功能。2014.11.29日本科学家利用日本科学家利用iPS细胞修复肌肉萎缩症基因细胞修复肌肉萎缩症基因干细胞报告日本京都大学研究人员利用诱导多功能干细胞（iPS细胞），成功修复了引发肌肉萎缩症的致病基因。这一成果将有望促进开发出改善肌肉萎缩症症状的方法。现在学习的是第57页，共76页2022/9/29582015.8.6中国科学家使用小分子化合物直接诱导小鼠成纤维细胞重编程获得功能神经元中国科学家使用小分子化合物直接诱导小鼠成纤维细胞重编程获得功能神经元CellStemCell 北京大学生命中心邓宏魁研究组取得的一项重要研究成果：使用小分子化合物组合直接将小鼠成纤维细胞重编程成为了功能神经元。整个诱导过程不经历多潜能干细胞阶段和细胞增殖过程。该方法相比较传统的先诱导体细胞重编程获得多潜能干细胞，再分化获得功能细胞方法，直接重编程方法更加简单和直接，并有可能应用于体内直接重编程，成为一种新的治疗疾病的解决方案。2015.10.8澳大利亚与荷兰科学家用澳大利亚与荷兰科学家用iPS培育出肾脏组织培育出肾脏组织自然自然澳大利亚与荷兰研究人员从诱导多能性干细胞(iPS)中，培育出“类似肾脏的组织”。诱导多能性干细胞是重新设定为中性状态的成体细胞，接着它们再受诱发分化成其他类型的细胞。2015.11.11中国科学家用中国科学家用ES细胞治疗阿尔茨海默病（细胞治疗阿尔茨海默病（AD）动物模型）动物模型干细胞报告干细胞报告 中科院上海生科院生化与细胞所景乃禾研究组成功地把小鼠和人胚胎干细胞诱导分化为成熟的功能性基底前脑胆碱能神经元（BFCN），将这些干细胞来源的BFCN移植到阿尔茨海默病（AD）动物模型脑内，可以有效改善模型小鼠的认知功能。2015.11.20 2015.11.20 日本科学家用日本科学家用iPSiPS细胞育成心脏组织薄膜细胞育成心脏组织薄膜ScientificScientificReportsReports 日本京都大学iPS细胞研究所山下润教授所带领的研究小组近日宣布，他们成功开发出能够延长“心脏组织薄膜”作用时间的新方法。心脏组织薄膜是该团队在2014年利用人类诱导多功能干细胞(iPS细胞)制作的多层叠加细胞层，通过将其移植到心脏外可改善心脏功能。现在学习的是第58页，共76页2022/9/2959第五节第五节 外源基因导入胚胎技术外源基因导入胚胎技术现在学习的是第59页，共76页2022/9/2960 将外源基因导入到胚胎内主要有以下几种方法：将外源基因导入到胚胎内主要有以下几种方法：一、直接导入受精卵或早期胚胎内一、直接导入受精卵或早期胚胎内 显微注射法：显微注射法：在在显显微微镜镜下下利利用用玻玻璃璃显显微微注注射射针针将将外外源源DNADNA片片段段直直接接注注入入到到受受体体的的受精卵雄性原核内。受精卵雄性原核内。逆转录病毒载体法：逆转录病毒载体法：将将外外源源基基因因克克隆隆到到逆逆转转录录病病毒毒载载体体，感感染染受受体体细细胞胞时时，外外源基因可整合到宿主细胞染色体内。用于转基因和基因治疗。源基因可整合到宿主细胞染色体内。用于转基因和基因治疗。精子载体法：精子载体法：将将外外源源DNADNA片片段段与与动动物物精精子子一一起起孵孵育育，在在体体外外受受精精过过程程中中由由精子将外源精子将外源DNADNA带入卵内。带入卵内。现在学习的是第60页，共76页2022/9/2961二二、将将外外源源基基因因转转染染胚胚胎胎干干细细胞胞或或体体细细胞胞，再再将将转转染染的的细细胞胞作作为为供供体核移植到去核卵母细胞，发育成胚胎。体核移植到去核卵母细胞，发育成胚胎。1.1.将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞：将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞：电电穿穿孔孔法法：细细胞胞暴暴露露于于高高电电压压时时，细细胞胞膜膜为为高高电电压压瞬瞬时时击击穿穿，从从而而使使外外源源DNADNA片段被摄入细胞中。片段被摄入细胞中。脂脂质质体体法法：脂脂质质体体是是一一种种人人造造膜膜，将将外外源源DNADNA装装入入脂脂质质体体，与与培培养养细细胞胞一一起温育，即可将外源起温育，即可将外源DNADNA导入受体细胞。导入受体细胞。基因枪法：基因枪法：DEAE-DEAE-葡聚糖介导法：葡聚糖介导法：磷酸钙介导法：磷酸钙介导法：现在学习的是第61页，共76页2022/9/29622.2.带有外源基因的带有外源基因的ESES细胞细胞通过崁合体技术进入囊胚通过崁合体技术进入囊胚胚胎嵌合是指将遗传上不同的两类胚胎或胚细胞组合起胚胎嵌合是指将遗传上不同的两类胚胎或胚细胞组合起来，来，形成一个胚胎，形成一个胚胎，由此而发育形成的动物称为嵌合由此而发育形成的动物称为嵌合体动物。体动物。由于嵌合体动物是两类遗传背景不同的胚胎发育形由于嵌合体动物是两类遗传背景不同的胚胎发育形成的，不同细胞群体互相嵌合构成了器官和组织，成的，不同细胞群体互相嵌合构成了器官和组织，但嵌合体动物携带的两种遗传特性不能同时遗传给但嵌合体动物携带的两种遗传特性不能同时遗传给下一代的同一个体。究竟哪一个亲本的遗传特性能下一代的同一个体。究竟哪一个亲本的遗传特性能遗传取决于该亲本的细胞是否在嵌合体动物体内分遗传取决于该亲本的细胞是否在嵌合体动物体内分化成生殖细胞（精子或卵子）。分化成生殖细胞的化成生殖细胞（精子或卵子）。分化成生殖细胞的亲本的遗传特性能传给后代。亲本的遗传特性能传给后代。现在学习的是第62页，共76页2022/9/2963嵌合体动物的制备：1.聚合法 用聚合法制作嵌合体动物，是将遗传上不同（例如毛色不同）的两个816细胞胚胎用物理方法聚合起来。2.注射法 注射法是将胚胎干细胞或其他胚细胞注入桑椹胚或囊胚腔中来制作嵌合体动物。现在学习的是第63页，共76页2022/9/29643.3.带有外源基因的体细胞通过克隆技术进入胚带有外源基因的体细胞通过克隆技术进入胚胎胎将带有外源基因的体细胞作为供体，通过核移植将带有外源基因的体细胞作为供体，通过核移植技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，再移植到假孕再移植到假孕动物动物的子宫中。出生后的子宫中。出生后动物动物的基因的基因型与供体的基因型完全一致。型与供体的基因型完全一致。现在学习的是第64页，共76页2022/9/2965显微注射法显微注射法逆转录病毒感染逆转录病毒感染精子介导转基因精子介导转基因电穿孔电穿孔电电 穿穿 孔孔脂质体转染脂质体转染磷酸钙转染磷酸钙转染生殖细胞或生殖细胞或早期胚胎早期胚胎ESES细胞细胞体细胞体细胞外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA片段片段囊胚囊胚去核卵母细胞去核卵母细胞外源基因进入胚胎的途径和方法现在学习的是第65页，共76页2022/9/2966q 外源基因进入细胞后的命运外源基因进入细胞后的命运 外源外源DNADNA进入细胞后有三种命运：进入细胞后有三种命运：1 1被胞内核酸酶降解。被胞内核酸酶降解。2 2以以游游离离状状态态存存在在。游游离离的的未未整整合合外外源源DNADNA只只要要有有真真核核细细胞胞能能识识别别的的启启动动子子、编编码码基基因因以以及及poly(A)poly(A)信信号号等等，一一般般都都能能得得到到表表达达，但但随随着着细细胞胞衰衰老老，表表达达力力下下降降。这这种表达不能传代，称为种表达不能传代，称为暂时表达暂时表达。3 3整整合合到到受受体体细细胞胞染染色色体体（只只有有少少数数）。整整合合到到受受体体细细胞胞基基因因组组的的外外源源基基因因，能能随随细细胞胞分分裂裂遗遗传传到到子子细细胞胞，称为称为稳定表达稳定表达。现在学习的是第66页，共76页2022/9/2967 外源基因整合到受体细胞染色体可分为以下两种情况：外源基因整合到受体细胞染色体可分为以下两种情况：随随机机插插入入（Random Random insertioninsertion）：外外源源基基因因进进入入细细胞胞后后，随随机机插插入入到到任任意意的的染染色色体体内内。如如果果插插入入到到一一个个基基因因内内，可可能能导导致致该该基基因因的的失失活活。另另外外，插插入入外外源源基基因因受受邻邻近近调调控控序序列列的的影影响响，其其表表达达可能高，也可能低。可能高，也可能低。定定点点整整合合（Targeted Targeted integrationintegration）：实实现现定定点点整整合合的的前前提提是是外外源源基基因因的的一一端端或或两两端端带带有有定定点点整整合合部部位位的的同同源源DNADNA序序列列，即即所所谓谓的的同同源源臂臂（Homologous Homologo