酶分子修饰 (2)课件.ppt
关于酶分子修饰(2)现在学习的是第1页，共48页什么是酶分子修饰？什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰酶分子修饰。现在学习的是第2页，共48页酶分子修饰的意义酶分子修饰的意义稳定酶的天然构象稳定酶的天然构象保护活性部位保护活性部位维持酶功能结构的完整性维持酶功能结构的完整性降低酶的抗原性降低酶的抗原性改变酶学性质改变酶学性质回本章目录现在学习的是第3页，共48页 第一节第一节 酶的化学修饰酶的化学修饰化学修饰化学修饰：在体外将酶分子通过人工的：在体外将酶分子通过人工的方法与一些方法与一些化学基团化学基团（物质），进行（物质），进行共共价连接价连接，从而改变酶的结构和性质，从而改变酶的结构和性质。即即利用修饰剂所具有的各种化学基团特利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，直接或经过一定的活化过程，与酶性，直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造子结构进行改造。现在学习的是第4页，共48页一、化学一、化学修饰分类修饰分类（一）酶分子主链修饰（一）酶分子主链修饰（二）酶分子侧链基团修饰（二）酶分子侧链基团修饰（三）大分子结合修饰（三）大分子结合修饰（四）氨基酸置换修饰（四）氨基酸置换修饰（五）金属离子置换修饰（五）金属离子置换修饰（六）亲和修饰（六）亲和修饰现在学习的是第5页，共48页（一）（一）酶分子主链修饰酶分子主链修饰利用酶分子主链的切断和连接，使利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。功能的方法。主链切断修饰主链切断修饰主链连接修饰主链连接修饰现在学习的是第6页，共48页1、主链切断修饰主链切断修饰主链切断的主链切断的三种情况三种情况：活性中心破坏活性中心破坏失活失活活性中心完整活性中心完整保持活性，保持活性，改变抗原改变抗原性性有利于活性中心的形成有利于活性中心的形成显示活性或显示活性或活力提高活力提高现在学习的是第7页，共48页胃蛋白酶原的激活胃蛋白酶原的激活 现在学习的是第8页，共48页胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活现在学习的是第9页，共48页胰凝乳蛋白酶原的激活胰凝乳蛋白酶原的激活 现在学习的是第10页，共48页2 2、主链连接修饰、主链连接修饰将两种或两种以上的酶通过主链连接在将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有一起，形成一个酶分子具有两种或多种两种或多种催化活性催化活性。现在学习的是第11页，共48页（二）酶分子侧链基团修饰（二）酶分子侧链基团修饰酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。基酸残基上的功能团。包括：氨基（包括：氨基（-NH2）、羧基（）、羧基（-COOH）、）、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。甲硫基等。现在学习的是第12页，共48页分子内交联修饰含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法现在学习的是第13页，共48页（三）（三）酶的大分子修饰酶的大分子修饰采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团(共价)结合使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法现在学习的是第14页，共48页非共价修饰非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，它们既能通过些添加物，它们既能通过氢键氢键固定在酶分子表面，也能固定在酶分子表面，也能通过通过氢键氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。如如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多元醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白质蛋白质。现在学习的是第15页，共48页用可溶性大分子，如用可溶性大分子，如聚乙二醇聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通、右旋糖苷、肝素等，通过过共价键共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。共价修饰共价修饰现在学习的是第16页，共48页大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程修饰剂的选择修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂根据酶分子的结构和修饰剂的特性的特性选择适宜的水溶性大分子。选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化活化，然后才可以与酶分，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。子的某侧链基团进行反应。修饰修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混混合合，在一定的温度、，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离分离：需要通过：需要通过凝胶层析凝胶层析等方法进行分离，将具有等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子不同修饰度的酶分子分开，从中分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。获得具有较好修饰效果的修饰酶。现在学习的是第17页，共48页应用最广的修饰剂聚乙二醇聚乙二醇是线性分子，溶解度高，具有良好的是线性分子，溶解度高，具有良好的生物相容性，在体内无毒性、无残留、无抗原生物相容性，在体内无毒性、无残留、无抗原性，分子末端有可活化的性，分子末端有可活化的羟基羟基，活化后可以与，活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。可用多种不同试剂可用多种不同试剂活化活化，修饰不同基团，修饰不同基团聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺现在学习的是第18页，共48页将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法称为修饰方法称为氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰(四四)氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰现在学习的是第19页，共48页氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方化学修饰方法法例如，例如，BenderBender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。化硝基苯酯等底物水解的活性。化学修饰法化学修饰法难度大，成本高，专一性差难度大，成本高，专一性差，而且，而且要对要对酶分子逐个进行修饰酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生，操作复杂，难以工业化生产。产。1.1.化学修饰方法氨基酸置换化学修饰方法氨基酸置换现在学习的是第20页，共48页2.定点突变法氨基酸置换定点突变法氨基酸置换现在常用的氨基酸置换修饰的方法是现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术定点突变技术。定。定点突变（点突变（site directed mutagenesissite directed mutagenesis）是）是2020世纪世纪8080年代年代发展起来的一种基因操作技术。是指在发展起来的一种基因操作技术。是指在DNADNA序列中的某一序列中的某一特特定位点定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（术。是蛋白质工程（Protein EngineeringProtein Engineering）和酶分子）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效先进、可靠、行之有效的手段。的手段。现在学习的是第21页，共48页定点突变过程定点突变过程1 1、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其存在的问题）存在的问题）2 2、突变基因序列的确定（考虑物种差异）、突变基因序列的确定（考虑物种差异）3 3、突变基因的获得（、突变基因的获得（DNADNA合成仪合成仪PCRPCR）4 4、新酶的获得（重组、转入宿主、表达）、新酶的获得（重组、转入宿主、表达）现在学习的是第22页，共48页（五）金属离子置换修饰（五）金属离子置换修饰1、概念、概念2、作用范围、作用范围3、常用金属离子、常用金属离子4、方法步骤、方法步骤现在学习的是第23页，共48页1、概念、概念通过改变酶分子中所含金属离子，使酶通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。的特性和功能发生改变的方法。现在学习的是第24页，共48页2、作用范围、作用范围含有金属离子的酶含有金属离子的酶金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。的组成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。会失活，重新加入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。置换）则可使酶呈现不同特性。现在学习的是第25页，共48页3、常用金属离子、常用金属离子（往往是二价离子）（往往是二价离子）:Ca 2+，Mg 2+，Mn 2+，Zn 2+，Co 2+，Cu 2+，Fe 2+等。等。现在学习的是第26页，共48页4、金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程 p a.a.酶的分离纯化酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。度的酶液。p b.b.除去原有的金属离子除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（四乙酸（EDTAEDTA）等，使酶分子中的金属离子与）等，使酶分子中的金属离子与EDTAEDTA等形成等形成螯合螯合物。通过透析、超滤、物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将分子筛层析等方法，将EDTA-EDTA-金属螯合物从酶液中金属螯合物从酶液中除去除去。此时，酶往往成为无活性。此时，酶往往成为无活性状态。状态。p c.c.加入置换离子加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。后的酶。p 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。p 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。现在学习的是第27页，共48页（六）亲和修饰（六）亲和修饰亲和标记是一种特殊的化学修饰方法，它利用酶与底物的亲和能力，使用与底物或配体结构类似的修饰剂，对酶活性中心上的氨基酸残基进行共价修饰修饰。亲和标记光化学标记现在学习的是第28页，共48页二、酶修饰后的性质变化二、酶修饰后的性质变化热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的：一般来说，热稳定性有较大的提高提高。抗原性抗原性：比较公认的是：比较公认的是PEGPEG和人血清白蛋白在和人血清白蛋白在消除消除酶的抗原性上效果比较明显。酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提提高高其稳定性。其稳定性。半衰期半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长延长了在体内的半衰期。了在体内的半衰期。最适最适pHpH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pHpH发生了变化，这种变化在应用研发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适究上有时具有重要意义。修饰酶最适pHpH更接近于更接近于生理生理环境，在临床应用上有较大环境，在临床应用上有较大意义。意义。KmKm的变化的变化：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，VmVm没有明显变化，但有些酶经修饰后，没有明显变化，但有些酶经修饰后，KmKm值值变大变大。回本章目录现在学习的是第29页，共48页三、化学修饰方法的几个问题三、化学修饰方法的几个问题 决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。其中：其中：对酶性质的了解：对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等；链基团性质等；选择修饰剂考虑：选择修饰剂考虑：1 1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2 2）修饰剂上反应基团的数目及位置；）修饰剂上反应基团的数目及位置；3 3）修饰剂上反应基团的）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；选择酶反应条件要注意：选择酶反应条件要注意：1 1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PHPH、温度、时间；温度、时间；2 2）酶与修饰剂的比例。）酶与修饰剂的比例。参考：酶工程参考：酶工程 P.86 P.86现在学习的是第30页，共48页四、酶化学修饰的应用四、酶化学修饰的应用 在医药方面：在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的化学修饰可以提高医用酶的稳定性稳定性，延长，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和和抗原性抗原性。在生物技术领域：在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pHpH等酶学等酶学性质。性质。在酶结构功能研究中：在酶结构功能研究中：1.1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.2.确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的功能；3.3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。测定酶分子中某种氨基酸的数量。现在学习的是第31页，共48页五、酶蛋白化学修饰的局限性五、酶蛋白化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性专一性是是相对的相对的，很少有，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。将妨碍对修饰结果的解释。3.酶的化学修饰酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。能关系中的作用。4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所性所“必需必需”的，为什么是必需的，还得用的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。缺乏准确性和系统性。现在学习的是第32页，共48页第二节第二节 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 通过物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从通过物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法而改变酶的某些特性和功能的方法通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端极端条件下（高温、高压、高盐、极端pHpH值等）由于值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共共价键不发生改变价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。某些变化和重排。现在学习的是第33页，共48页变性、诱导与构象重建变性、诱导与构象重建 （对酶高级结构调整）（对酶高级结构调整）酶肽链酶肽链变性变性松散后，使其在有底物类似物或抑制松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下剂存在的非天然条件下复性复性，酶将折叠成所需要的特，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理。理。现在学习的是第34页，共48页 实验证据：在实验证据：在8mol/L尿尿素存在下，用巯基乙醇处素存在下，用巯基乙醇处理天然理天然Rnase（核糖核酸（核糖核酸酶）酶）,其二硫键全部断裂，其二硫键全部断裂，肽链松散，活性全部丧失，肽链松散，活性全部丧失，但当用透析法除去尿素、但当用透析法除去尿素、巯基乙醇后，巯基乙醇后，RNase活力活力全部恢复，而且复原后产全部恢复，而且复原后产物其物化性质与天然物其物化性质与天然RNase完全相同。完全相同。现在学习的是第35页，共48页第三节第三节 蛋白质工程和酶的定向进化蛋白质工程和酶的定向进化 （基因水平上进行蛋白质改造）（基因水平上进行蛋白质改造）（基因水平上进行蛋白质改造）（基因水平上进行蛋白质改造）现在学习的是第36页，共48页蛋白质工程蛋白质工程以重组以重组DNADNA技术为基础，结技术为基础，结合合X X-衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技术体系，也是在术体系，也是在基因水平基因水平进行蛋白质改造的进行蛋白质改造的技术科学。技术科学。一、酶蛋白质工程现在学习的是第37页，共48页1、蛋白质工程的主要目标(1)功能的改变(2)结构特性的改变(3)新体系的创造现在学习的是第38页，共48页2、酶蛋白质工程所需基本信息 酶的基因克隆;该基因的序列;活性部位的作用机理,更理想的是涉及活性部位的氨基酸;酶的晶体结构,或者至少是同源性很高的蛋白质空间结构。现在学习的是第39页，共48页3、酶蛋白质工程的流程相关的序列及 3D 结构数据库现在学习的是第40页，共48页4、酶蛋白质工程的前景酶的蛋白质工程是典型的多学科综合研究,所涉及的学科不仅有酶学、蛋白质化学和分 子生物学,而且还涉及蛋白质结构解析和生物信息学分析。在对于天然的蛋白分子的研究还未总结出可以基本涵盖绝大多数情况的结构与功能的规律之前,酶的蛋白质工程不可能成为主要的创造新酶源的手段。酶的蛋白质工程将创造出大量具有新的、功能更好的酶产品，蛋白质工程对于分子性能的改善程度和功能创新的多样性,将会超过现在最具想像力的预测。现在学习的是第41页，共48页二、酶的定向进化1 1、定向进化的原理、定向进化的原理2 2、定向进化示意图、定向进化示意图3 3、定向进化不是定点突变、定向进化不是定点突变4 4、酶体外定向进化的意义、酶体外定向进化的意义现在学习的是第42页，共48页1 1、定向进化的原理、定向进化的原理在待进化酶基因的在待进化酶基因的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA聚合酶不聚合酶不具有具有3-53-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中比率向目的基因中随机引入突变随机引入突变，构建突变库，凭借，构建突变库，凭借定定向的选择向的选择方法，选出所需性质的优化酶方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质或蛋白质)，从，从而排除其他突变体。而排除其他突变体。定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。定向进化定向进化定向进化定向进化=随机突变随机突变随机突变随机突变+定向选择定向选择定向选择定向选择。前者是人为引发的，。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，起着选择某一方向的进化而排后者虽相当于环境，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。为控制下进行的。现在学习的是第43页，共48页2 2、定向进化示意图、定向进化示意图随机突变随机突变+定向选择目标突变体定向选择目标突变体细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提高了！最适生长温度提高了！现在学习的是第44页，共48页3 3、随机突变的策略、随机突变的策略易错易错PCR技术技术(error-prone PCR)DNA改组改组(DNA shuflling)随机引发重组随机引发重组交错延伸交错延伸技术技术现在学习的是第45页，共48页4 4、定向进化、定向进化不是不是定点突变定点突变定向进化：突变定向进化：突变 筛选筛选 突变突变位点位点是是随机随机的，不确定的；的，不确定的；突变位点的突变位点的数目数目也是也是不确定不确定的；的；突变的突变的效应效应更是更是不可预知不可预知的；的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：定点突变：突变突变位点位点是是确定确定的，突变的个数也是预知的；的，突变的个数也是预知的；突变的突变的效应效应可能是可能是已知已知的，也可能是的，也可能是未知未知的；的；定点突变的定点突变的方法方法一般是以一般是以PCRPCR技术为基础的。技术为基础的。现在学习的是第46页，共48页5 5、酶体外定向进化的意义、酶体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力进化潜力，很，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。决条件。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所合理设计所不能解决的问题不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。渐显示其生命力。现在学习的是第47页，共48页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第48页，共48页
