感受态细胞和质粒的转化.ppt

感受态细胞和质粒的转化现在学习的是第1页，共37页导入大肠杆菌导入大肠杆菌:氯化钙转化法氯化钙转化法electroporation 电击法又叫电穿孔法电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法体外包装感染法重组重组DNA导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞:DNA-磷酸钙共沉淀、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法脂质体介导法、脂质体介导法、原生质体融合法原生质体融合法 酵母菌转化法酵母菌转化法:完整细胞转化法完整细胞转化法 原生质体转化法原生质体转化法 电击法电击法 现在学习的是第2页，共37页大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)o大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)大约含大约含3000kb的环状染色体的环状染色体DNA的棒状细菌。的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37，PH7.07.6(一般一般7.4)，保存加甘油，保存加甘油，培养皿密封。培养皿密封。o 大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生生长滞后期长滞后期)、对数生长期、对数生长期(2030min)、稳定期稳定期(饱和期饱和期)，约，约1109 2108/mL和衰老期。和衰老期。现在学习的是第3页，共37页现在学习的是第4页，共37页 大大肠肠杆杆菌菌的的不不同同菌菌株株的的保保存存期期差差别别较较大大。有有些些菌菌株株在在液液体体培培养养基基中中，4可可保保存存几几个个月月，而而有有些些菌菌株株在在相相同同条条件件下下只只能能保保存存几几天天。如如在在相相同同条条件件下下，大大肠肠杆杆菌菌K12株株比比大大肠肠杆杆菌菌X1776株株保保存存期期长。长。所所以以菌菌株株首首先先应应划划平平板板分分离离单单个个菌菌落落，经经扩扩增增后后再再做做抗抗药药性性等等鉴鉴定定，然然后后应应用用或或保保存存。保保存存一一般般用用对对数数生生长长后后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。2.菌株的保存菌株的保存现在学习的是第5页，共37页 LB琼琼脂脂平平板板划划线线，37，倒倒置置平平板板培培养养(16-24hr)，形形成成单单一一菌菌落落后后，用用石石腊腊纸纸(parafilm)将将平平皿皿四四周周封封严严(使使平平皿皿隔隔绝绝空空气气)，倒倒置置放入放入4或或-20冰箱中，可保存数周。冰箱中，可保存数周。E.coli菌菌株株的的生生存存期期差差别别大大：有有些些菌菌株株在在液液体体培培养养基基中中，4能存活几个月。有些菌株只能活几天。能存活几个月。有些菌株只能活几天。穿刺琼脂穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。，室温，避光可保存数年。冰冰冻冻：单单一一菌菌落落，液液体体培培养养基基中中扩扩增增后后，稀稀释释后后倒倒入入10-50%甘甘油油培培养养基基中中，分分装装，置置-20-70。可可经经过过30次次冻冻融融，细细菌菌仍仍然然存存活。活。菌菌LB中中过过液液培培养养，加加入入等等体体积积2冰冰冻冻培培养养基基。液液氮氮速速冻冻后后置置-70，可经，可经15次冻融，保存次冻融，保存5年以上。年以上。具体保存方法：具体保存方法：现在学习的是第6页，共37页琼脂穿刺培养基琼脂穿刺培养基 2冰冻培养基冰冻培养基 琼脂（琼脂（Difco）6g K2HPO4 12.6g细菌胰蛋白胨细菌胰蛋白胨（Difco）10gN+-柠檬酸柠檬酸 0.19g NaCl 8gMgSO4H2O 0.18g HCl 20mg(NH4)2SO4 1.8g ddH2O 至至1LKH2PO4 3.6g 甘油甘油 88g dH2O 至至1L 菌株保存液的配制菌株保存液的配制现在学习的是第7页，共37页高压灭菌高压灭菌 Phagemid-20 Enzyme-20 Buffers-20 Primer-4 Thiodeyivatives-20 Ribonucleotides-20 Helper phage-4 置于置于20或或80，并一个月检查一次，并一个月检查一次 现在学习的是第8页，共37页抗生素抗生素工作浓度工作浓度 松驰型质粒松驰型质粒 严紧型质粒严紧型质粒 氨苄青霉素氨苄青霉素(Amp)50mg/mL（水）（水）60ug/mL20ug/mL 氯霉素氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）（乙醇）170ug/mL 25ug/mL 卡那霉素卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）（水）50ug/mL10ug/mL 链霉素链霉素(Sm)10mg/mL（水）（水）50ug/mL10ug/mL 四环素四环素(Tc)5mg/mL（乙醇）（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制抗生素的配制现在学习的是第9页，共37页大肠杆菌感受态细胞制备和贮存大肠杆菌感受态细胞制备和贮存 在基因工程研究过程中，常常需要将外源在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体与载体DNA连连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA复制，扩增复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌宿主菌中复制导入大肠杆菌宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大肠杆菌但都没有成转化大肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。1970年年M.Mandela 和和A.Higa提出，在转化提出，在转化DNA之前，预先用氯之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆转化入大肠杆菌的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。菌的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。现在学习的是第10页，共37页感受态细胞感受态细胞(Compenent cells)：将质粒将质粒DNA或重组质粒或重组质粒DNA转化到宿主菌转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。的状态。(主要介绍用氯主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)取出大肠杆菌取出大肠杆菌HB101菌种管划菌种管划LB琼脂平板，琼脂平板，-70保存，保存，37过夜过夜(一般一般16小小时时)。取一个菌落接种于取一个菌落接种于35mlLB培养管中，培养管中，37振振 培养，过夜培养，过夜(816小时小时)。取出取出1mL过液菌加入新鲜配制的过液菌加入新鲜配制的LB培养液培养液50mL中中(2%接种量接种量)。37振荡振荡培养，培养，24小时。测定光密度值小时。测定光密度值(约约5107个细胞个细胞/mL)，OD550达达0.30.5。注意：不同的大肠杆菌菌株，每注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。HB101，OD600=0.5（约（约107个细胞个细胞/mL）X1776，OD600=0.2（约（约107个细胞个细胞/mL）现在学习的是第11页，共37页 细菌培养管取出置水浴中，细菌培养管取出置水浴中，1015分钟。分钟。细菌移入预冷的离心管中，细菌移入预冷的离心管中，44000GSA转头，转离心转头，转离心5分钟；弃上清，留沉分钟；弃上清，留沉淀置于冰浴中。淀置于冰浴中。加加0.1mol/L CaCl2(预冷预冷)溶液溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中，将沉淀充分悬浮，置冰浴中2030分钟。分钟。延长延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在处理时间，可增加感受态，所以也可在0过夜。过夜。4，40002500rpm转离心转离心5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。用预冷的用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，小心轻轻悬浮沉淀，4过夜。可直接过夜。可直接使用。使用。次日加次日加20%(最终浓度最终浓度)灭菌预冷甘油。灭菌预冷甘油。分装成每分装成每Eppendorf管管200uL。新鲜感受态细胞用于质粒新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞转化最好。但新鲜感受态细胞0 4贮贮存不超过存不超过3天。长期保存，必须将细胞在天。长期保存，必须将细胞在-70干冰或液氮气体部分速冻干冰或液氮气体部分速冻5分分钟，再置于钟，再置于-80冰箱中保存，一般可保存冰箱中保存，一般可保存1年。年。现在学习的是第12页，共37页 CaCl2处理处理4，0.1M低渗低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞壁处理使细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称“打孔打孔”，使，使DNA分子能够进入细胞内。分子能够进入细胞内。CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，的酶位点，使使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来DNA分子。保持感分子。保持感受态的时间约受态的时间约12天，一般出现在生长对数期的后期。天，一般出现在生长对数期的后期。两种假设：两种假设：现在学习的是第13页，共37页5.DNA转化感受态细胞转化感受态细胞 抗生素抗生素 抽滤除菌并均置抽滤除菌并均置 -20保存。保存。抗生素不耐热，在加入到琼脂抗生素不耐热，在加入到琼脂板中时，应等琼脂冷至板中时，应等琼脂冷至4850时再加入抗生素时再加入抗生素 Mg+是四环素拮抗物，是四环素拮抗物，需加需加MgCl2时改加时改加NaCl(6g/L)四环素光敏感应避光保存四环素光敏感应避光保存（1）抗性琼脂板中抗生素的配制）抗性琼脂板中抗生素的配制现在学习的是第14页，共37页 感受态细胞新鲜配制的或从感受态细胞新鲜配制的或从-80冻存取出后置于冰水中融化。冻存取出后置于冰水中融化。取出分装到取出分装到Eppendorf管中，每管管中，每管100200uL。加入需转化的加入需转化的DNA溶液溶液25ul充分混匀充分混匀(15ug/mLDNA)。冰水中放置冰水中放置30分钟。分钟。37或或42水浴水浴2分钟。分钟。(热休克热休克)冰浴冰浴2min。每管再加入每管再加入1mL LB培养基，培养基，37振荡培养振荡培养1小时。小时。取出后稍加离心，去掉部分上清，留取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或或250mLLB则全部铺板。则全部铺板。（2）转化步骤转化步骤现在学习的是第15页，共37页 取取100200uL，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；静置静置510分钟。分钟。倒置倒置37培养培养1218小时小时(一般过夜一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增，提取；次日，挑选单菌落，扩增，提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。酶切，电泳检测，筛选重组子。并设下列对照：并设下列对照：A不加需转化的不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。培养基代替）。B用普通用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。DNA超螺旋转化最好超螺旋转化最好 DNA环状环状 次之次之 DNA线状线状 有干扰作用有干扰作用 1ug pBR322DNA转化入转化入HB101可得：可得：5106/2107转化子。转化子。DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高限为，最高限为15kb。一般。一般1ug DNA可得可得51071108个转化菌。个转化菌。现在学习的是第16页，共37页（3）注意事项）注意事项 宿主菌取出时应注意菌株名及编号。宿主菌取出时应注意菌株名及编号。检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。整个操作过程应保持无菌状态。整个操作过程应保持无菌状态。LB培养液中不能有抗生素。培养液中不能有抗生素。不同受体菌，培养要求不同。如不同受体菌，培养要求不同。如 K802株，株，OD550=0.5 最好，而最好，而X1776株，株，OD550=0.20.3最好。最好。质粒的质粒的DNA比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，转化率成为限制因素。时，转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。同时质粒大，复制的拷贝数低。现在学习的是第17页，共37页（4）质粒的三种构型）质粒的三种构型 超螺旋闭合环状超螺旋闭合环状DNA，cccDNA。开环开环DNA，至少一股，至少一股DNA上有缺口，一处或多处使上有缺口，一处或多处使DNA鲜旋。鲜旋。线状线状DNA 琼脂糖琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的电泳可将这三种构型的DNA分开，分开，Agrose电泳中电泳中 cccDNA位置最前。位置最前。现在学习的是第18页，共37页二、阅读微生物的基因型符号二、阅读微生物的基因型符号 在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。1由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和和metA，是表，是表示它的示它的trp、his和和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因具体描述微生物的某个基因(如如trp)时，可以用时，可以用trp+，或者只是简单地用，或者只是简单地用“+”表示它表示它的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就。有些突变型是缺失突变，就用用表示，如表示，如lon表示表示lon基因的缺失突变。基因的缺失突变。现在学习的是第19页，共37页 2有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因子有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因子F。细菌中有细菌中有F因子的描述为因子的描述为F+；没有的为；没有的为F-。有些。有些F因子上面带有细菌的某些基因，因子上面带有细菌的某些基因，这样的这样的F因子写作因子写作F，它所带基因的描述方法同上。例如，它所带基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表表示示F因子上面带有细菌的因子上面带有细菌的lac和和proA，B基因。又如，基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示表示F因子上面带有因子上面带有lac和和proA，B基因，但是，其中的基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。基因是突变的基因。3校正基因校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现型则应该，表现型则应该写为写为Sup-。可是，带有。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写为基因的突变型品系的基因型必需写为sup-或者或者sup，它的，它的表现型是表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好倒了一个个。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞错。此外，在谈到特殊的校儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示，如正基因时，它的表现型常用数字来表示，如Sul；但是，它的基因型却用字；但是，它的基因型却用字母来表示母来表示supD。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野生型。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野生型(Su-)的品系干脆的品系干脆不用任何符号，只标出突变型品系不用任何符号，只标出突变型品系(Su+)的特殊基因座位符号，如的特殊基因座位符号，如supD和和supE等。等。现在学习的是第20页，共37页 JM83，F-，ara，(lac-proAB)，rpsL，80d，lacZ M15是这样一个品是这样一个品系：不带系：不带F因子，因子，ara基因座突变基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖因此不能代谢阿拉伯糖)，lac操纵子缺失操纵子缺失(因此不能利用乳糖因此不能利用乳糖)，30S核糖体的核糖体的S12亚基突变亚基突变(因此有链霉素抗生因此有链霉素抗生)，-D-半半乳糖苷酶基因部分缺失乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含因此在含X-gal的平板中有的平板中有-互补作用。如果将克隆的互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组质粒的重组DNA转化入这个细菌，就可以通过蓝转化入这个细菌，就可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子白菌斑来筛选出转化子)。野生的大肠杆菌具有大约野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的的DNA分子，上面有约分子，上面有约2800个基因。当这些个基因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可能给大肠杆菌带来可以观察基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可能给大肠杆菌带来可以观察到的变化。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型到的变化。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，而把基因的，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。试举一例来说明上述概念：试举一例来说明上述概念：现在学习的是第21页，共37页 通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表现型通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表现型发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在野生的基因型上加发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在野生的基因型上加“+”，在变，在变异的基因型上加异的基因型上加“-”以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的名称的以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示三个斜体字素表示(如如 DNA Aednine methylase-dam)。如果不同的基因变导。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个大写字母致相同的作用结果，则加上一个大写字母(如如Recombination-recA、recB、recC)。某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“”表示，如表示，如“从从lac到到proAB基因缺失时表示为基因缺失时表示为(lac-proAB)。野生的大肠杆菌本来还有具有野生的大肠杆菌本来还有具有F因子等的质粒因子等的质粒DNA，并且感染噬菌体。，并且感染噬菌体。把被野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体把被野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体(Prophage)，例如，例如 e14。一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“()”或或“/”等加以区别表示。等加以区别表示。现在学习的是第22页，共37页表现型是用罗马字母体表示表现型是用罗马字母体表示(第一个字母大写第一个字母大写)。一般通过变异而获。一般通过变异而获得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用“+”表示表示(Steptomycin抗性：抗性：Str+)；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，用；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，用“-”表示表示(Ampicillin敏感性：敏感性：Amp-)。基因型表现容易混淆，使用时注意。基因型表现容易混淆，使用时注意。*基因工程中经常使用的大肠杆菌几乎都来自于基因工程中经常使用的大肠杆菌几乎都来自于K-12菌株，最近也常使菌株，最近也常使用由用由B株及株及C株来源的大肠杆菌。株来源的大肠杆菌。*大肠杆菌大肠杆菌B株原来就为株原来就为lon-，另外，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因株不具有琥柏抑制基因(Amber suppressor free)，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。型中加以表示，要注意。现在学习的是第23页，共37页p supE(suppressor)抑制基因抑制基因 supE变异时，即使存在终止密码变异时，即使存在终止密码UAG，此处也会插入谷氨酰胺，此处也会插入谷氨酰胺(Glutamine)，从而可使蛋白质继续合成。，从而可使蛋白质继续合成。p supF(suppressor)抑制基因抑制基因 supF变异时，即使存在终止密码子变异时，即使存在终止密码子UAG，此处也会插入酪氨酸，此处也会插入酪氨酸(Tyrosine)，从而可使蛋白质继续合成。，从而可使蛋白质继续合成。停止密码回复停止密码回复现在学习的是第24页，共37页p recA(recombination)重组重组 相同的相同的DNA重组活性缺失重组活性缺失 由于导入由于导入DNA与宿主与宿主DNA的重组受到阻害，可以保持插入的重组受到阻害，可以保持插入DNA的稳定性。与的稳定性。与recA13宿主菌相比，宿主菌相比，recA1宿主菌能够使宿主菌能够使插入插入DNA稳定存在。稳定存在。p recB，C(recombination)重组重组 内切核酸酶内切核酸酶V变异。变异。抑制重组并能影响放射线损伤的修复。抑制重组并能影响放射线损伤的修复。p traD(transmissibility)遗传稳定性遗传稳定性 在质粒在质粒F因子内部，与大肠杆菌的结合有关。因子内部，与大肠杆菌的结合有关。TraD变异后，变异后，F因子自身的传递能力显著下降。因子自身的传递能力显著下降。重组机能缺失重组机能缺失现在学习的是第25页，共37页p dam(DNA adenine methylase)DNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶 宿主菌来源的腺嘌呤甲化酶宿主菌来源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失缺失p dcm(DNA cytsine methylase)DNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶 宿主菌来源的胞嘧啶甲基化酶（宿主菌来源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失）缺失p hsdR(host specificity defective)宿主特异性缺陷宿主特异性缺陷 宿主菌来源的宿主菌来源的I型限制酶型限制酶Ecok(或或EcoB)的切断部位蛋白变异的切断部位蛋白变异 转化的外源转化的外源DNA不被限制酶不被限制酶EcoK切断，可以进行克隆切断，可以进行克隆p hsdM(host specificity defective)宿主菌来源的宿主菌来源的I型限制酶型限制酶EcoK(或或EcoB)的甲基化酶部位蛋白变异的甲基化酶部位蛋白变异p hsdS（host specificity defective）宿主菌来源的宿主菌来源的I型限制酶型限制酶EcoK(或或EcoB)的识别部位蛋白变变异的识别部位蛋白变变异 转化的外源转化的外源DNA不被限制酶不被限制酶EocK切断，可以进行克隆切断，可以进行克隆对插入对插入DNA具有直接作用因子的缺失具有直接作用因子的缺失现在学习的是第26页，共37页p endA(endonuclease)内切核酸酶内切核酸酶 宿主菌来源的非特异性内切核酸酶宿主菌来源的非特异性内切核酸酶I活性缺失，可以活性缺失，可以 提高纯化的质粒提高纯化的质粒DNA的质量。的质量。p NcrA(methylcytsine restriction)mCG序列的甲基化活性缺失。序列的甲基化活性缺失。p mcrB，C(methylcytsine restriction)GmC序列的甲基化活性缺失。序列的甲基化活性缺失。p mrr(methylation requiring restricion)mA以及以及mC序列的甲基化活性缺失。序列的甲基化活性缺失。现在学习的是第27页，共37页p rpsL(ribosomal protein small subunit)由由30S核糖体蛋白变异而获得链霉素核糖体蛋白变异而获得链霉素(Steptomycine)抗性抗性(Strr)。p gyrA(gyrase)由由DNA回旋酶亚基回旋酶亚基A的变异而获得的萘啶酮酸的变异而获得的萘啶酮酸(Nalidxic acid)抗性抗性(Nalr)。p Tn5(transposon)转座子变异，获得卡那霉素转座子变异，获得卡那霉素(Kanamycine)抗性抗性(Kmr)。p Tn10(transposon)转座子变异，获得四环素（转座子变异，获得四环素（Tetracycline）抗性（）抗性（Tetr）。）。抗药性的变异抗药性的变异现在学习的是第28页，共37页p lon(long form)分解异型蛋白质的分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺失。依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌大肠杆菌B株原来就为株原来就为lon-。可抑制其表达的融合蛋白质。可抑制其表达的融合蛋白质的分解。的分解。p omp(outer membrane protein)外膜蛋白外膜蛋白 膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达的融合蛋白质的分膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达的融合蛋白质的分解解。宿主蛋白酶缺失宿主蛋白酶缺失现在学习的是第29页，共37页p lac Iq(lactose)乳糖操纵子中控制乳糖操纵子中控制-半乳糖苷酶表达的调节蛋白基因。由于半乳糖苷酶表达的调节蛋白基因。由于lacIq变变异，表达调节蛋白过量形成，因此从乳糖启动子开始的转录过程完全受到抑制。异，表达调节蛋白过量形成，因此从乳糖启动子开始的转录过程完全受到抑制。p lacZ(lactose)-半乳糖苷酶活性缺失半乳糖苷酶活性缺失p lacZ M15 -半乳糖苷酶蛋白的半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表达。当与多数载体质粒中所具有的得到表达。当与多数载体质粒中所具有的-fragment共同存在时，可使共同存在时，可使-半乳糖苷酶的活性回复半乳糖苷酶的活性回复(-互补性互补性)。在含。在含有有X-gal的平板培养基上，可以通过蓝白菌的差别选择重组体。的平板培养基上，可以通过蓝白菌的差别选择重组体。p deoR deoR变异，可以选择性地改善大分子变异，可以选择性地改善大分子DNA的转化。的转化。有利于选择转化体的基因有利于选择转化体的基因现在学习的是第30页，共37页p dut(dUTPase)dUTP酶酶 dUTP分解酶活性缺失，当分解酶活性缺失，当dUTP分解酶存在时，分解酶存在时，dUTP不能掺入到不能掺入到DNA链中。链中。p ung(Urasil-N-glycosylase)尿嘧淀尿嘧淀-N-糖苷酶糖苷酶 尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。糖苷酶活性缺失。当具有这种基因时，可以特异性地分解当具有这种基因时，可以特异性地分解DNA含含U的那条链。的那条链。p mutS(mutator)突变子突变子 未被甲基化的新合成未被甲基化的新合成DNA链的错配序列修复受到阻碍。链的错配序列修复受到阻碍。有利于点突变的基因有利于点突变的基因现在学习的是第31页，共37页p leuB(leucine)亮氨酸亮氨酸 在最小培养基中必须添加亮氨酸在最小培养基中必须添加亮氨酸(Leu)p proAB(proline)脯氨酸脯氨酸 脯氨酸代谢基因变异。在最小培养基中只有添加脯氨酸才能生脯氨酸代谢基因变异。在最小培养基中只有添加脯氨酸才能生长。用于确认长。用于确认JM109等大肠杆菌菌株的等大肠杆菌菌株的F因子是否脱落。因子是否脱落。p Thi-1(thiamine)硫胺素硫胺素 硫胺素代谢基因变异，在最小培养基中必须添加硫胺素。硫胺素代谢基因变异，在最小培养基中必须添加硫胺素。菌株筛选用基因菌株筛选用基因现在学习的是第32页，共37页LacZ、lac5、trpE、bio、bio256从大肠杆菌从大肠杆菌lac、trp和和bio区置换而来区置换而来imm80、QSR80从从80噬体置换而来噬体置换而来imm434从从434噬菌体置换而来噬菌体置换而来imm21从从21噬菌体置而来噬菌体置而来int29从从29噬菌体置换而来噬菌体置换而来b2、b1007、b527、b189B域的缺失突变，使域的缺失突变，使att位点受破坏并因而阻止溶源化位点受破坏并因而阻止溶源化KH5280噬菌体噬菌体DNA的缺失突变的缺失突变KH53类似于类似于噬菌体噬菌体cI区域的区域的80噬菌体区域的缺失突变，可有效地防止溶源化噬菌体区域的缺失突变，可有效地防止溶源化KH54RexcI区域的缺失突变，可有效地防止溶源化区域的缺失突变，可有效地防止溶源化nin5转录终止位点转录终止位点tR2的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于N基因产物，并且基因产物，并且也删除了也删除了ral基因附近的基因附近的BamH I位点位点ninL44转录终止位点转录终止位点tR2的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于N基因产物，并且基因产物，并且也删除了也删除了ral基因附近的基因附近的BamH I位点。位点。WL113从从33 240位的位的SalI到到34 500位的位的BamH I之间的之间的1，3kb缺失突变，不损伤缺失突变，不损伤gam基因，但基因，但kil，c、ssb和和ral基因被删除。基因被删除。sslI1-2从第一到第二个从第一到第二个SalI之间的之间的0.5kb缺失突变，缺失突变，gam基因和部分基因和部分bet基因被删除。基因被删除。现在学习的是第33页，共37页续续 上上 表表 shnd 2-3噬菌体第二与第三个噬菌体第二与第三个Hind 之间的之间的2.3kb缺失突变，部分缺失突变，部分b区被删除区被删除 sxI1oXbaI酶切后经外切核酸酶消化而造成的酶切后经外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突变缺失突变 鼠填充片段鼠填充片段 大肠杆菌填充片段大肠杆菌填充片段 lac操纵基因操纵基因+腺病毒腺病毒DNA在重组体中将被置换的载体在重组体中将被置换的载体DNA片段片段 Bluescript M13-重组入重组入ZAP载体的噬菌粒，当用载体的噬菌粒，当用M13辅助噬菌体感染后，噬菌粒部分可在体内被切下。辅助噬菌体感染后，噬菌粒部分可在体内被切下。lacY、lacZ、lacPO 、lacIq、ampr插入插入OPF8的的lac和氨苄青霉素抗生基因和氨苄青霉素抗生基因 Aam、Bam、Eam、Wam、gamam可被可被supE和（或）和（或）supF抑制的琥珀突变。抑制的琥珀突变。int amInt基因内的基因内的BamH I位点被消除后形成的琥珀突变。位点被消除后形成的琥珀突变。Sam7、Sam100参与溶解细菌细胞膜的一个基因内的琥珀突变。该突变可被参与溶解细菌细胞膜的一个基因内的琥珀突变。该突变可被supF抑制，但不被抑制，但不被supE抑制，失却野生抑制，失却野生型型S基因产物后，引起感染性噬菌体颗粒在细胞内发生积累。基因产物后，引起感染性噬菌体颗粒在细胞内发生积累。cIts857使使cI基因产物对热不稳定的温度敏感突变基因产物对热不稳定的温度敏感突变 chi促进促进噬菌体定向重组的特定八核苷酸序列噬菌体定向重组的特定八核苷酸序列 gamGam基因编码大肠杆菌基因编码大肠杆菌recBC外切核酸酶的抑制物，因此可使外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型型DNA复制有效地转向滚环复制。复制有效地转向滚环复制。Gam基因产物对于基因产物对于噬菌体有噬菌体有recA-菌株（菌株（Fec表型）和表型）和P2噬菌体溶源的噬菌体溶源的recA+菌株（菌株（Spi表型）内的生表型）内的生长非常重要。长非常重要。exo bet(red)Exo和和bet是位于是位于噬菌体噬菌体red区域的两个基因（区域的两个基因（red表示两个基因或任一个基因）。这两处基因产物参表示两个基因或任一个基因）。这两处基因产物参与当从与当从Q型型DNA复制向滚环复制转变时的重组过程。这两个基因产物对于复制向滚环复制转变时的重组过程。这两个基因产物对于噬菌体在噬菌体在recA-菌株（菌株（Fec表型）和表型）和P2噬菌体溶源的噬菌体溶源的recA+菌株（菌株（Spi表型）内的生长非常重要。表型）内的生长非常重要。现在学习的是第34页，共37页常用细菌菌株常用细菌菌株 C600F-thi-1 thr leuB6 lacY1 ton21 supE44-常用于制备裂解物及增殖常用于制备裂解物及增殖gt10的抑制型菌的抑制型菌株株 该菌株也叫该菌株也叫CR34 C600:HflA150 (Y1073)F-thi-1 thr leuB6 lacY1 tonA21 supE44-hflA150(chr:Tn10)host for repressing background plaques of gt10 when establishing cDNA libraries DH5F-endA1 recA1 hsdR17(rk-mk+)deoR thi-1 supE44-gyrA96 relA1host for pBR322 or other non-Puc vectorsuseful for cDNA cloning DH5F-80dlacZM15(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-mk+)deoR thi-1 supE44-gyrA96relA1host for pUC and other-complementation vectors;pBR322useful for cDNA cloning DH5FF-80dlacZ(lacZYA-argF)U169 endA1 hsdR17(rk-mk+)deoR thi-1 supE44-gryA96relA1Host for growth of M13,phagemids,or other male-specific bacteriophageprovides-complementation for M13mp vectors现在学习的是第35页，共37页续续 上上 表表 DH5F IQFproAB+lacIqZM15zzf:Tn5Kmr/80dlacZM15(lacZYA-ARGf)U169 andA1 recA1hsdR17(rk-mk+)deoR thi-1 supE44-gyrA96 relA1host ofr expression from the lac promotherhost for growth of M13,phagemids,or other male-specific bacteriophageprovides-complementation for M13mp vectors DH5-MCRF-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15(lacZYA-argF)U169 endA1 recA