外源基因的表达讲稿.ppt

外源基因的表达第一页，讲稿共七十七页哦遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质的传递到蛋白质的传递过程过程中心法中心法则（则（central dogma）。）。基因表达：基因表达：第二页，讲稿共七十七页哦 克隆基因的表达：克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。第三页，讲稿共七十七页哦 最佳的基因表达体系最佳的基因表达体系最佳的基因表达体系最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、目的基因的表达产量高、表达产物稳定、目的基因的表达产量高、表达产物稳定、目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。生物活性高和表达产物容易分离纯化。生物活性高和表达产物容易分离纯化。生物活性高和表达产物容易分离纯化。第四页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件3 外源基因表达系统外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和分离纯化基因表达产物的检测和分离纯化第六章第六章第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达第五页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性的延伸和稳定性1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默第六页，讲稿共七十七页哦1.1 外源基因的外源基因的起始转录起始转录 外源基因在宿主细胞中有效表达是基因工程的外源基因在宿主细胞中有效表达是基因工程的核心问题核心问题外源基因的起始转录是基因表达的外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤关键步骤。转录起始的速率是基因表达的转录起始的速率是基因表达的限速步骤限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。考虑的问题。第七页，讲稿共七十七页哦原核生物启原核生物启动子动子诱导型启动子：诱导型启动子：组成型启动子：组成型启动子：如如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子等的启动子如如T7噬菌体的启动噬菌体的启动子子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。第八页，讲稿共七十七页哦1.2 mRNA的延伸与稳定的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在的有效延伸、终止及稳定存在是是外源基因有效表达的关键外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。的稳定性。第九页，讲稿共七十七页哦 mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。的稳定性直接决定翻译产物的多少。n对对原核细胞原核细胞来说，最佳的方法是选择一个来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体菌。缺失的受体菌。n真核细胞真核细胞来说，则需要考虑增加来说，则需要考虑增加mRNA的正确加工，的正确加工，提高成熟提高成熟mRNA的稳定性。的稳定性。第十页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性的延伸和稳定性1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默第十一页，讲稿共七十七页哦1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译外源基因外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子。是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的序列中的4个碱基。个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。真核细胞真核细胞mRNA的的5非翻译区含有共同的序列非翻译区含有共同的序列5-CCA（G）CCATGG-3。第十二页，讲稿共七十七页哦不同基因组使用密码子具有选择性。不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（主密码子（major codon）稀有密码子（稀有密码子（rare codon）如果外源基因如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；就高；反之，若外源基因含有较多的稀有密码子，其反之，若外源基因含有较多的稀有密码子，其表达效率就低。表达效率就低。第十三页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性的延伸和稳定性1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默第十四页，讲稿共七十七页哦1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物能否在宿主细胞外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素。是基因有效表达的一个重要因素。（1）构建融合蛋白表达系统。）构建融合蛋白表达系统。（2）构建分泌蛋白表达系统。构建分泌蛋白表达系统。（3）构建包涵体表达系统。）构建包涵体表达系统。（4）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。第十五页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录1.2 mRNA的延伸和稳定性的延伸和稳定性1.3 外源基外源基mRNA的有效翻译的有效翻译1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默第十六页，讲稿共七十七页哦1.5 目的基因沉默目的基因沉默基因沉默的基因沉默的作用机制作用机制位置效应的基因沉默：位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：基因沉默（基因沉默（gene silencing）是导致外源基因不能正常是导致外源基因不能正常表达的重要因素。表达的重要因素。第十七页，讲稿共七十七页哦n共抑制（共抑制（cosuppression）是转录后水平的基因沉默是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源的内源DNA的表达也受到抑制。的表达也受到抑制。第十八页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件3 外源基因表达系统外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和分离纯化基因表达产物的检测和分离纯化第六章第六章第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达第十九页，讲稿共七十七页哦2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件2.1 启动子启动子2.2 增强子增强子2.3 终止子终止子2.4 衰减子衰减子2.5 绝缘子绝缘子2.6 反义子反义子第二十页，讲稿共七十七页哦2.1 启动子启动子启动子（启动子（promoter）：）：是一段提供是一段提供RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过与它的结聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。合而启动基因的转录。*启动子的特征启动子的特征序列特异性序列特异性方向性方向性位置特性位置特性种属特异性种属特异性第二十一页，讲稿共七十七页哦TTGACATATAAT转录起始点转录起始点53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45原核生物的Promoter第二十二页，讲稿共七十七页哦RNA pol IITFIIDTAFs TBP Pol III 启启 动动 子子 TFIIIB TFIIIC TBP RNA pol III Pol I 启启 动动 子子 RNA pol I SL1 UBF1 TBP Pol II 启启 动动 子子 转录起始点转录起始点 TATA 第二十三页，讲稿共七十七页哦2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件2.1 启动子启动子2.2 增强子增强子2.3 终止子终止子2.4 衰减子衰减子2.5 绝缘子绝缘子2.6 反义子反义子第二十四页，讲稿共七十七页哦 2.2 增强子增强子增强子（增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式顺式作用序列，又称作用序列，又称强化子强化子。v增强子的特性：增强子的特性：双向性。双向性。重复序列。重复序列。增强子行使功能与所处的位置无关。增强子行使功能与所处的位置无关。特异性。特异性。增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。连时也有功能。第二十五页，讲稿共七十七页哦2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件2.1 启动子启动子2.2 增强子增强子2.3 终止子终止子2.4 衰减子衰减子2.5 绝缘子绝缘子2.6 反义子反义子第二十六页，讲稿共七十七页哦2.3 终止子终止子本征终止子：本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构结构区内实现终止作用。区内实现终止作用。依赖终止信号的终止子：依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。要依赖专一的蛋白质辅助因子。第二十七页，讲稿共七十七页哦2.4 衰减子衰减子 衰减子（衰减子（attenuator）是位于是位于mRNA分子前导序列中的一段分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称转录终止信号序列，又称弱化子弱化子。第二十八页，讲稿共七十七页哦弱化子弱化子第二十九页，讲稿共七十七页哦色氨酸浓度高时色氨酸浓度高时色氨酸浓度低时色氨酸浓度低时第三十页，讲稿共七十七页哦2.5 绝缘子绝缘子绝缘子（绝缘子（insulator）：）：既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；用；第三十一页，讲稿共七十七页哦 2.6 反义子反义子反义反义RNA（antisence RNA）：同某种天然：同某种天然mRNA反向互补的反向互补的RNA分子称分子称为反义为反义RNA。反义子反义子：编码反义：编码反义RNA的的DNA称为反义子。称为反义子。反义子在反义子在DNA的的复制、转录和翻译复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。第三十二页，讲稿共七十七页哦n反义反义RNA作为作为调节调节调节调节物质物质物质物质的作用机制：的作用机制：与与mRNA上核糖体结上核糖体结合位点结合，使得翻合位点结合，使得翻译不能起始；译不能起始；与与mRNA形成双螺旋形成双螺旋结构，作为内切酶底结构，作为内切酶底物；物；与转录产物结合，使与转录产物结合，使转录提前终止转录提前终止。第三十三页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件3 外源基因表达系统外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和分离纯化基因表达产物的检测和分离纯化第六章第六章第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达第三十四页，讲稿共七十七页哦 3 外源基因表达系统外源基因表达系统外源基因表达系统：外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统外源基因表达系统基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞基因表达系统基因表达系统原核生物基因表达系统：原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。细胞表达系统等。第三十五页，讲稿共七十七页哦 3.1 大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌大肠杆菌革兰氏阴性细菌；革兰氏阴性细菌；目前应目前应用最广泛的基因表达系统。用最广泛的基因表达系统。v大肠杆菌表达系统的优越性：大肠杆菌表达系统的优越性：掌握了大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，掌握了大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有深刻了解；特别是对其基因表达调控的分子机理有深刻了解；大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；寄主菌株和不同类型的载体系列；实验已经证明，许多克隆的真核基因，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效实验已经证明，许多克隆的真核基因，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。生产。第三十六页，讲稿共七十七页哦3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略外源基因的高效表达策略第三十七页，讲稿共七十七页哦3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体第三十八页，讲稿共七十七页哦大肠杆菌基因表达载体可分为大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：个系统：DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统第三十九页，讲稿共七十七页哦（1）DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统 复制子复制子常见的复常见的复制子制子pMB1、p15A、ColE1:松弛复制型松弛复制型，每细胞，每细胞质粒拷贝数质粒拷贝数1020个。个。pSC101:严谨复制型严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于，每细胞质粒拷贝数少于5个。个。第四十页，讲稿共七十七页哦选择标记选择标记绝大多数的质粒载体都是使用绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号抗菌素抗性记号，多为，多为氨苄青氨苄青霉素抗性霉素抗性、四环素抗性四环素抗性、链霉素抗性链霉素抗性、氯霉素抗性氯霉素抗性以及以及卡那霉素抗性卡那霉素抗性等。等。原因：原因：许多质粒本身带有抗菌素抗性基因的抗药性许多质粒本身带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；因子；抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。第四十一页，讲稿共七十七页哦大肠杆菌基因表达载体的大肠杆菌基因表达载体的3个系统：个系统：DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统第四十二页，讲稿共七十七页哦（2）外源目的基因的转录系统）外源目的基因的转录系统包括包括启动子启动子 和和转录终止子转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，在不同的宿主中表达启动子和终止子因宿主的不同而有差别，在不同的宿主中表达效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。间不能通用。启动子启动子外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的强强启动子启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。第四十三页，讲稿共七十七页哦P tac=3 P trp=11 P lac启动子启动子-35 区序列区序列-10 区序列区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P l lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 第四十四页，讲稿共七十七页哦转录终止子转录终止子一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主内录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高的长度，提高mRNA的稳定的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。性，避免质粒上其它基因的异常表达。第四十五页，讲稿共七十七页哦大肠杆菌基因表达载体可分为大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：个系统：DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统第四十六页，讲稿共七十七页哦（3）蛋白质的翻译系统）蛋白质的翻译系统在原核生物中影响翻译起始的因素有：在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体起始密码子、核糖体结合位点（结合位点（SD序列）、起始密码子于序列）、起始密码子于SD序列之间的距离和碱基组序列之间的距离和碱基组成、成、mRNA的二级结构、的二级结构、mRNA上游的上游的5端非翻译序列和蛋白编码端非翻译序列和蛋白编码区的区的5端序列等。端序列等。蛋白质的翻译系统蛋白质的翻译系统核糖体结合位点（核糖体结合位点（SD序列）序列）翻译起始密码子翻译起始密码子翻译终止密码子翻译终止密码子第四十七页，讲稿共七十七页哦核糖体结合位点核糖体结合位点（RBS）SD序列序列与核糖体与核糖体16S rRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻译起着决定性的作用。的翻译起着决定性的作用。大肠杆菌大肠杆菌SD序列的碱基组成、与起始密码子之间的距离和碱基组成序列的碱基组成、与起始密码子之间的距离和碱基组成对保证准确和高效翻译很重要。对保证准确和高效翻译很重要。SDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCA第四十八页，讲稿共七十七页哦翻译起始密码子翻译起始密码子AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）第四十九页，讲稿共七十七页哦翻译终止密码子翻译终止密码子翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。串连在一起。UAAU作为作为终止密码终止密码，可有效地终止多肽链的合成。，可有效地终止多肽链的合成。第五十页，讲稿共七十七页哦主要密码子和稀有密码子主要密码子和稀有密码子如果外源目的基因如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的稀有密码子，其表达水平就低。源基因含有较多的稀有密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。的调控序列进行适当的调整。第五十一页，讲稿共七十七页哦3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略外源基因的高效表达策略第五十二页，讲稿共七十七页哦3.1.2 宿主菌宿主菌 外源基因在大肠杆菌中的高表达会造成异源蛋白在细胞内大量外源基因在大肠杆菌中的高表达会造成异源蛋白在细胞内大量积累，而异源蛋白易被细胞内的酶所降解。积累，而异源蛋白易被细胞内的酶所降解。其主要原因是：其主要原因是：*大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加工大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加工系统；系统；*不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构及众多基因表达产物的稳定不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构及众多基因表达产物的稳定因子；因子；*高效表达的异源重组蛋白在细胞内形成高浓度微环境，增强蛋白高效表达的异源重组蛋白在细胞内形成高浓度微环境，增强蛋白分子相互作用。分子相互作用。第五十三页，讲稿共七十七页哦常见的大肠杆菌基因表达受体菌株常见的大肠杆菌基因表达受体菌株第五十四页，讲稿共七十七页哦3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略外源基因的高效表达策略第五十五页，讲稿共七十七页哦3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统Lac和和Tac表达系统表达系统：以：以lac操纵子调控机制为基础设计和构操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。建的表达系统。PL和和PR表达系统表达系统：以：以噬菌体早期转录启动子噬菌体早期转录启动子PL和和PR构建构建的。的。T7表达系统表达系统：利用大肠杆菌：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。表达系统，它具有很高的表达能力。第五十六页，讲稿共七十七页哦3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略外源基因的高效表达策略第五十七页，讲稿共七十七页哦3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式 （1）包涵体型异源蛋白）包涵体型异源蛋白 （2）融合蛋白）融合蛋白 （3）分泌蛋白分泌蛋白 （4）寡聚型外源蛋白）寡聚型外源蛋白 （5）整合型外源蛋白）整合型外源蛋白 第五十八页，讲稿共七十七页哦3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式A）包涵体型异源蛋白）包涵体型异源蛋白 包涵体：包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在细胞中累积，在一定条件下，外源基因的表达产物在细胞中累积，致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构。致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构。结构特点：结构特点：具有正确的氨基酸序列，但空间结构是错误的，无具有正确的氨基酸序列，但空间结构是错误的，无生物学活性。生物学活性。优点：优点：简化了外源基因表达产物的分离纯化程序。简化了外源基因表达产物的分离纯化程序。第五十九页，讲稿共七十七页哦B）融合型异源蛋白）融合型异源蛋白融合蛋白：外源蛋白基因和受体菌自身蛋白基因重组在一起，融合蛋白：外源蛋白基因和受体菌自身蛋白基因重组在一起，不改变两个基因阅读框。不改变两个基因阅读框。受体菌蛋白位于受体菌蛋白位于N端，外源蛋白在端，外源蛋白在C端。端。特点特点：受体菌蛋白与异源蛋白形成良好的杂合构象，使受体菌蛋白与异源蛋白形成良好的杂合构象，使得多肽链上的蛋白酶切位点隐藏在蛋白分子内部而不易被得多肽链上的蛋白酶切位点隐藏在蛋白分子内部而不易被切割，因而大大增加了产物的稳定性。切割，因而大大增加了产物的稳定性。第六十页，讲稿共七十七页哦C）寡聚型异源蛋白寡聚型异源蛋白 在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋寡聚型外源蛋白白。多表达单元重组：多表达单元重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。该方式适合表达和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。该方式适合表达相对分子质量较大相对分子质量较大的蛋白。的蛋白。多顺反子重组多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，但序列、翻译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达互独立的。该方式适合表达中等大小分子量中等大小分子量的外源蛋白。的外源蛋白。多编码序列重组多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达外源方式特别适合表达外源小分子小分子蛋白或多肽。蛋白或多肽。第六十一页，讲稿共七十七页哦D）整合型异源蛋白）整合型异源蛋白 将要表达的外源基因整合到染色体的将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白整合型外源蛋白。外源基因与宿主染色体整合是根据外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原同源交换的原理理 第六十二页，讲稿共七十七页哦E）分泌型蛋白）分泌型蛋白n将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因拼接，将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直接进入到使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直接进入到培养基中。培养基中。优点：优点：增大表达蛋白的稳定性，简化后续的分离增大表达蛋白的稳定性，简化后续的分离纯化步骤纯化步骤第六十三页，讲稿共七十七页哦3.1.1 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统常见的大肠杆菌表达系统3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5 外源基因的高效表达策略外源基因的高效表达策略第六十四页，讲稿共七十七页哦3.1.5 外源基因的高效表达策略外源基因的高效表达策略n优化表达载体：高效启动子优化表达载体：高效启动子n提高稀有密码子提高稀有密码子tRNA的表达的表达n提高提高mRNA稳定性稳定性n提高外源基因表达产物的稳定性提高外源基因表达产物的稳定性n优化发酵过程优化发酵过程第六十五页，讲稿共七十七页哦 3 外源基因表达系统外源基因表达系统基因表达系统基因表达系统原核生物基因表达系统：原核生物基因表达系统：大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统链霉菌表达系统 蓝藻表达系统等。蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：真核生物基因表达系统：酵母表达系统酵母表达系统 植物细胞表达系统植物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统等。哺乳动物细胞表达系统等。第六十六页，讲稿共七十七页哦1 基因表达的机制基因表达的机制2 基因表达的调控元件基因表达的调控元件3 外源基因表达系统外源基因表达系统4 基因表达产物的检测和分离纯化基因表达产物的检测和分离纯化4.1 基因表达产物的检测基因表达产物的检测4.2 基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化第六十七页，讲稿共七十七页哦4.1 基因表达产物的检测基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对特异性外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检或蛋白质的检测。测。检测特异性检测特异性mRNA的方法的方法Northern杂交法杂交法检测特异性蛋白质的方法检测特异性蛋白质的方法生化反应检测法生化反应检测法免疫学检测法免疫学检测法生物学活性检测法生物学活性检测法当转化的外源目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可把外源基因当转化的外源目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可把外源基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。第六十八页，讲稿共七十七页哦4.1.1 外源基因转录产物的检测外源基因转录产物的检测Northern杂交杂交4.1.2 报告基因的酶法检测：报告基因的酶法检测：-葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（gus基因）、氯霉素乙酰转移酶基因基因）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat基因）、冠瘿碱合成酶基因、抗卡那霉素基因（基因）、冠瘿碱合成酶基因、抗卡那霉素基因（npt-基因）基因）等。等。4.1.3 免疫学检测免疫学检测n免疫沉淀法免疫沉淀法n酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法nWestern印迹法印迹法n固相放射免疫法固相放射免疫法4.1.4 表达产物生物学活性检测表达产物生物学活性检测4.1 基因表达产物的检测基因表达产物的检测第六十九页，讲稿共七十七页哦4.2 基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化基因表达产物分离纯化的步骤：基因表达产物分离纯化的步骤：细胞破碎细胞破碎离心分离离心分离柱层析柱层析电泳电泳4.2.1 细胞的破碎细胞的破碎对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。常见的细胞破碎方式常见的细胞破碎方式变性剂裂解法变性剂裂解法超声波破碎法超声波破碎法机械破碎法机械破碎法酶裂解法酶裂解法第七十页，讲稿共七十七页哦4.2.2 离心离心离心力一般在数万离心力一般在数万g范围以内，主要用来去除未破范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等；碎的细胞和细胞壁碎片等；高速离心：高速离心：超速离心：超速离心：离心力一般离心力一般100,000g以上，可用来去除细胞膜碎片等高以上，可用来去除细胞膜碎片等高分子复合物。分子复合物。v附：离心力和转速的换算公式：附：离心力和转速的换算公式：RCF=11.18(N/1000)2rRCF：相对离心力相对离心力，单位为重力加速度，单位为重力加速度gN：转头旋转速度（转速）转头旋转速度（转速），用，用r/min表示表示r：转头半径转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为厘米，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为厘米（cm）第七十一页，讲稿共七十七页哦4.2.3 特异性表达蛋白的初步分离特异性表达蛋白的初步分离沉淀法：沉淀法：超滤浓缩法：超滤浓缩法：根据蛋白质分子大小的不同而进行初步分根据蛋白质分子大小的不同而进行初步分离的一种方法。离的一种方法。简便有效，能处理大量的样品、并除去大量的杂简便有效，能处理大量的样品、并除去大量的杂蛋白。蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂对离心后的样品进行分步常用硫酸氨或有机溶剂对离心后的样品进行分步沉淀。该法也常用于蛋白质的浓缩。沉淀。该法也常用于蛋白质的浓缩。第七十二页，讲稿共七十七页哦4.2.4 柱层析柱层析柱层析：柱层析：包括包括凝胶柱层析凝胶柱层析、离子交换层析离子交换层析、吸附层析吸附层析、金属螯合层析金属螯合层析、共价层析共价层析、疏水层析疏水层析和和亲和层析亲和层析等。等。层析的基本原理：层析的基本原理：所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相中，并以不同力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。的速度移动，最终彼此分开。柱层析纯化蛋白质的步骤：柱层析纯化蛋白质的步骤：装柱装柱柱平衡柱平衡上样上样洗脱洗脱分部收集分部收集检测检测第七十三页，讲稿共七十七页哦4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）分子生物学实验中很常用的一种技术，适用于分离低分子质分子生物学实验中很常用的一种技术，适用于分离低分子质量蛋白质、小于量蛋白质、小于1kb DNA片段及片段及DNA序列分析。序列分析。PAGENative-PAGE：主要用于不能变性的表达蛋白的分主要用于不能变性的表达蛋白的分 离离与纯化。与纯化。SDS-PAGE：用于可变性的蛋白的分离纯化用于可变性的蛋白的分离纯化第七十四页，讲稿共七十七页哦基因工程总结基因工程总结目的基因的获得目的基因的获得载体的提纯载体的提纯重组载体的构建重组载体的构建(酶切酶切/连接）连接）宿主细胞的转化宿主细胞的转化/转染转染宿主细胞的培养宿主细胞的培养目的基因的诱导表达目的基因的诱导表达转化转化/转染细胞的筛选转染细胞的筛选第七十五页，讲稿共七十七页哦 基因工程应用基因工程应用n生物学将成为生物学将成为2121世纪最主要的学科，基因工程及相关领域的世纪最主要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为产业将成为2121世纪的主导产业之一，基因工程产品的产值将世纪的主导产业之一，基因工程产品的产值将占占GDPGDP的的25%25%以上。以上。n基因工程研究和应用范围非常广泛，它涉及工业、农业、基因工程研究和应用范围非常广泛，它涉及工业、农业、环境、能源和医药卫生等许多领域。环境、能源和医药卫生等许多领域。n目前基因工程的应用主要