离子交换层析精选PPT.ppt

关于离子交换层析第1页，讲稿共66张，创作于星期二 18481848年，年，ThompsonThompson 等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪子交换现象。本世纪4040年代，出现了具有稳定交换特性的年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯聚苯乙烯乙烯离子交换树脂。离子交换树脂。5050年代，离子交换层析进入生物化学领域，年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。第2页，讲稿共66张，创作于星期二第一节第一节 基本原理基本原理 在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。合离子或离子化合物的理化性质。离子交换剂离子交换剂特性特性第3页，讲稿共66张，创作于星期二离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应是可要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应是可逆的。假定以逆的。假定以RARA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子阳离子A A+与溶液中的阳离子与溶液中的阳离子B B+可发生可逆的交换反应，反应可发生可逆的交换反应，反应式为：式为：RA+BRA+B+RB+ARB+A+该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。用定律。离子交换反应离子交换反应第4页，讲稿共66张，创作于星期二示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）可交换离子（钠离子）交换离子交换离子不交换离子不交换离子第5页，讲稿共66张，创作于星期二 离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，结合力的大离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。小取决于离子交换剂的选择性。离子交换剂的选择性离子交换剂的选择性可用其反应的可用其反应的平衡常数平衡常数K K表示：表示：K KRBARBA+/RAB/RAB+如果反应溶液中如果反应溶液中AA+等于等于BB+，则，则K KRB/RARB/RA。若若K1K1，即，即RBRARBRA，表示离子交换剂对，表示离子交换剂对B B+的结合力大于的结合力大于A A+；若若K=1K=1，即，即RBRBRARA，表示离子交换剂对，表示离子交换剂对A A+和和B B+的结合力的结合力相同；相同；若若K1K1，即，即RBRARBRA，表示离子交换剂对，表示离子交换剂对B B+的结合力小于的结合力小于A A+。K K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数，故值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数，故称称K K值为离子交换剂对值为离子交换剂对A A+和和B B+的选择系数。的选择系数。第6页，讲稿共66张，创作于星期二影响离子交换选择性的因素影响离子交换选择性的因素v水合离子半径：半径越小，亲和力越大；水合离子半径：半径越小，亲和力越大；v离子化合价：高价离子易于被吸附；离子化合价：高价离子易于被吸附；v溶液溶液pHpH：影响交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对交换选择性：影响交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对交换选择性影响亦大。影响亦大。v离子强度：越低越好；离子强度：越低越好；v有机溶剂：不利于吸附；有机溶剂：不利于吸附；v交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；吸附量减少；v树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；如如Na+Ca2+Al3Si4。如原子。如原子价数相同，交换量则价数相同，交换量则随交换离子随交换离子的原子序数的增加而增大的原子序数的增加而增大，如，如Li NaKPb。在稀溶液中适在稀溶液中适用。用。在稀溶液中，强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序在稀溶液中，强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序是：是：CH3COOFOHHCOOClBrCrO42NO2IC2O42 SO42柠檬酸根。柠檬酸根。弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：为：FC1Br=ICH3COOMoO42PO43AsO43NO3酒石酸根酒石酸根柠檬酸根柠檬酸根CrO42SO42OH。1、竞争；、竞争；2、增加蛋白质的、增加蛋白质的水合作用，降低吸附和交水合作用，降低吸附和交换速度。换速度。第7页，讲稿共66张，创作于星期二两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。当状态。当pHpIpHpIpHpI时，能时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同被阴离子交换剂吸附。若在相同pIpI条件下，且条件下，且pIpHpIpH时，时，pIpI越高，越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。第8页，讲稿共66张，创作于星期二离子交换机理离子交换机理vA A+自溶液中扩散到树脂表面自溶液中扩散到树脂表面vA A+从树脂表面进入树脂内部的活性中从树脂表面进入树脂内部的活性中心心vA A+与与RBRB在活性中心上发生复分解在活性中心上发生复分解反应反应v解吸附离子解吸附离子B B+自树脂内部扩散至自树脂内部扩散至树脂表面树脂表面vB B+离子从树脂表面扩散到溶液中离子从树脂表面扩散到溶液中v交换速度交换速度的控制步骤是扩散速度，的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制外部扩散控制第9页，讲稿共66张，创作于星期二影响交换速度的因素影响交换速度的因素v颗粒大小：愈小越快颗粒大小：愈小越快v交联度：交联度小，交换速度快交联度：交联度小，交换速度快v温度：越高越快温度：越高越快,与扩散系数增加有关与扩散系数增加有关v离子化合价：化合价越高，扩散速度小离子化合价：化合价越高，扩散速度小v离子大小：越小越快离子大小：越小越快v搅拌速度：在一定程度上，越大越快搅拌速度：在一定程度上，越大越快v溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快越快第10页，讲稿共66张，创作于星期二离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H H+发生交换而发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与与OH-OH-发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。+第11页，讲稿共66张，创作于星期二1.1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂与离子交换剂与反离子结合反离子结合2.2.吸附阶段：吸附阶段：样品与反样品与反离子进行交换离子进行交换3 3、4.4.解吸附阶段：解吸附阶段：梯度缓冲溶液先洗下弱梯度缓冲溶液先洗下弱吸附物质，后洗下强吸吸附物质，后洗下强吸附物质附物质5.5.再生阶段：再生阶段：用原始平用原始平衡液进行充分洗涤，衡液进行充分洗涤，既可重复使用既可重复使用第12页，讲稿共66张，创作于星期二第二节第二节 离子交换剂的分类及性质离子交换剂的分类及性质一、离子交换剂的类型一、离子交换剂的类型 根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两大类：根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两大类：疏疏水性离子交换剂水性离子交换剂和和亲水性离子交换剂。亲水性离子交换剂。(1)(1)疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是由是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是由苯苯乙烯与交联剂二乙烯苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构中再以共反应生成的聚合物，在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同，又价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同，又可分为可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及及螯合离子交换树脂。螯合离子交换树脂。第13页，讲稿共66张，创作于星期二 阳离子交换剂：阳离子交换剂：阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，可与溶阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱，可分为依据电荷基团的强弱，可分为强酸型强酸型(带磺酸的基团，带磺酸的基团，R RSOSO3 3H)H)、中强酸型中强酸型（含磷酸基团或亚磷酸基团，（含磷酸基团或亚磷酸基团，R RPOPO3 3H H2 2）及）及弱酸型弱酸型（带羧基和（带羧基和酚基的树脂，酚基的树脂，R RCOOHCOOH或或R R苯环苯环OHOH）三种。）三种。这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代，如下这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代，如下式所示：式所示：R RCOOHCOOHNaNa+R RCOONaCOONaH H+第14页，讲稿共66张，创作于星期二 阴离子交换剂阴离子交换剂 此类交换剂是在基质骨架上引入季胺此类交换剂是在基质骨架上引入季胺-N-N (CH(CH3 3)3 3、叔胺、叔胺-N(CHN(CH3 3)2 2、仲胺、仲胺-NHCH-NHCH3 3 和伯胺和伯胺-NH-NH2 2 基团后构成的。基团后构成的。依据胺基碱性的强弱，又可分为强碱性依据胺基碱性的强弱，又可分为强碱性(含季胺基含季胺基)、弱碱性、弱碱性(含叔胺、仲胺基含叔胺、仲胺基)及中强碱性及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团既含强碱性基团又含弱碱性基团)三三种阴离子交换剂。种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：第15页，讲稿共66张，创作于星期二螯合离子交换剂：螯合离子交换剂：这类离子交换树脂具有吸附这类离子交换树脂具有吸附(或络合或络合)一些金属离子而排斥另一些一些金属离子而排斥另一些离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性，离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性，只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。疏水性离子交换剂含有大量的活性基团，交换容量大、流速快、机械疏水性离子交换剂含有大量的活性基团，交换容量大、流速快、机械强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷酸及氨基酸等小分子物质，强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷酸及氨基酸等小分子物质，也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如如SDS)SDS)、去污剂、去污剂(如如TritonX100)、尿素、两性电解质等。、尿素、两性电解质等。第16页，讲稿共66张，创作于星期二(2)(2)亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 与水亲和性较大，有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等。与水亲和性较大，有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等。纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂 又称离子交换纤维素，是以又称离子交换纤维素，是以微晶纤维素微晶纤维素为基质，引入电荷基团为基质，引入电荷基团构成的。分为构成的。分为强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素离子交换剂。纤维素离子交换剂中，最广泛使用的是离子交换剂中，最广泛使用的是二乙胺基乙基二乙胺基乙基(DEAE(DEAE一一)纤维素和纤维素和羧甲羧甲基基(CM(CM一一)纤维素纤维素。近年来近年来PharmaciaPharmacia公司用微晶纤维素经交联作用，制成了类似公司用微晶纤维素经交联作用，制成了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAESephacel)(DEAESephacel)，结构与，结构与DEAEDEAE一纤维一纤维素相同，对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。素相同，对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。第17页，讲稿共66张，创作于星期二微晶纤维微晶纤维-又称纤维素胶或结又称纤维素胶或结晶纤维素晶纤维素 性状：性状：白色或几乎白色的细白色或几乎白色的细小粉末，无臭，无味，可压成自小粉末，无臭，无味，可压成自身粘合的小片，并可在水中迅速身粘合的小片，并可在水中迅速分散，不溶于水、稀酸、稀碱溶分散，不溶于水、稀酸、稀碱溶液和大多数有机溶剂。液和大多数有机溶剂。制法：制法：将纤维性植物材料将纤维性植物材料与无机酸捣成浆状，经处理使与无机酸捣成浆状，经处理使之降解后漂洗、研磨、脱水、之降解后漂洗、研磨、脱水、烘干、粉碎制成。烘干、粉碎制成。第18页，讲稿共66张，创作于星期二目前常用的纤维素交换剂目前常用的纤维素交换剂第19页，讲稿共66张，创作于星期二离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。特点：特点：结构疏松，结构疏松，对生物高分子物质对生物高分子物质(如蛋白质和核酸分子如蛋白质和核酸分子)有较大的穿透性；有较大的穿透性；表面积大，表面积大，因而有较大的吸附容量；因而有较大的吸附容量；基质是亲水性的，基质是亲水性的，避免了疏水性反应对蛋白质分离避免了疏水性反应对蛋白质分离的干扰；的干扰；电荷密度较低电荷密度较低，与蛋白质分子结合不牢固，在温和洗脱，与蛋白质分子结合不牢固，在温和洗脱条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白质的变性。条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白质的变性。但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结合在其分但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结合在其分子上的解离基团数量不多，故子上的解离基团数量不多，故交换容量小交换容量小，仅为交换树脂的，仅为交换树脂的1/101/10左右。左右。第20页，讲稿共66张，创作于星期二交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂是以交联葡聚糖交联葡聚糖离子交换剂是以交联葡聚糖G25G25和和G50G50为基为基质，通过化学方法引入电荷基团而制成的。质，通过化学方法引入电荷基团而制成的。交换剂交换剂G50G50型型适用于相对分子质量为适用于相对分子质量为3103104 43103106 6的物质的物质的分离，交换剂的分离，交换剂G25G25型型能交换相对分子质量较小能交换相对分子质量较小(110(1103 35105103 3)的蛋白质。的蛋白质。交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶相似，在交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶相似，在强强酸和强碱中不稳定，在酸和强碱中不稳定，在pHpH7 7时可耐时可耐120120的高热。的高热。它既有它既有离子离子交换作用，又有分子筛性质交换作用，又有分子筛性质，可根据分子大小对生物高分子物质进，可根据分子大小对生物高分子物质进行分级分离，但行分级分离，但不适用不适用于分级分离相对分子质量于分级分离相对分子质量大于大于2102105 5的蛋的蛋白质。白质。第21页，讲稿共66张，创作于星期二 琼脂糖离子交换剂琼脂糖离子交换剂主要以交联琼脂糖主要以交联琼脂糖CL6BCL6B为基质，引入电荷基团而构成。为基质，引入电荷基团而构成。这种离子交换凝胶对这种离子交换凝胶对pHpH及温度的变化均较稳定，可在及温度的变化均较稳定，可在pH3pH31010和和0 07070范围内使用，改变离子强度或范围内使用，改变离子强度或pHpH时，床体时，床体积变化不大。积变化不大。如如DEAESepharose CL6BDEAESepharose CL6B为阴离子交换剂；为阴离子交换剂；CMCMSepharose CL6BSepharose CL6B为阳离子交换剂为阳离子交换剂,它们的外形呈珠状，网孔它们的外形呈珠状，网孔大，特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的大，特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。分离，即使加快流速，也不影响分辨率。第22页，讲稿共66张，创作于星期二v按骨架结构不同，离子交换树脂可分为：按骨架结构不同，离子交换树脂可分为：v 凝胶型凝胶型和和大孔型大孔型。苯乙烯或丙烯酸与交联剂苯乙烯或丙烯酸与交联剂二乙烯苯聚合而成，二乙烯苯聚合而成，透明透明，没有毛细孔，吸水后形成没有毛细孔，吸水后形成微细的孔隙，适合交换无微细的孔隙，适合交换无离子等小分子。离子等小分子。苯乙烯或丙烯酸与交联剂苯乙烯或丙烯酸与交联剂二乙烯苯的二乙烯苯的异构体异构体聚合，聚合，经过特殊的物理处理，行经过特殊的物理处理，行成大网孔，再导入交换基成大网孔，再导入交换基团制成，团制成，不透明，不透明，既有微既有微孔又有大粗孔，吸附大分孔又有大粗孔，吸附大分子，耐污染。子，耐污染。第23页，讲稿共66张，创作于星期二疏水性离子交换剂（树脂）疏水性离子交换剂（树脂）的命名的命名（D D）（D D）大孔型大孔型 无无凝胶型凝胶型分类代号分类代号00强酸强酸 11弱酸弱酸 33弱碱弱碱 44螯合螯合 55两性两性 66氧化还原活性基团氧化还原活性基团骨架名称骨架名称00苯乙烯系苯乙烯系 11丙烯酸系丙烯酸系 22酚醛系酚醛系 33环氧系环氧系 44乙烯吡啶系乙烯吡啶系 55脲醛系脲醛系 66氯乙烯系氯乙烯系顺序代号顺序代号用以区别交换基团或交联剂的差异。用以区别交换基团或交联剂的差异。交联度（交联度（%）第24页，讲稿共66张，创作于星期二例：例：00170017 凝胶型苯乙烯系强酸阳离子交换树脂交联度为凝胶型苯乙烯系强酸阳离子交换树脂交联度为7%7%D001D001 大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 第25页，讲稿共66张，创作于星期二亲水性离子交换剂的命名亲水性离子交换剂的命名v交换基团写在前面，然后写骨架，最后写原骨架的编号。在编号交换基团写在前面，然后写骨架，最后写原骨架的编号。在编号前加前加C C、A A以区分阳离子和阴离子。以区分阳离子和阴离子。v 如：如：DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25v CM-Sephadex C-25 CM-Sephadex C-25 第26页，讲稿共66张，创作于星期二二、性质二、性质 1 1、颜色与形状、颜色与形状树脂类离子交换剂：褐色、黄色、乳白色等树脂类离子交换剂：褐色、黄色、乳白色等 亲水性离子交换剂：白色亲水性离子交换剂：白色 珠状珠状 2 2、交联度、交联度 交联度：交联度：交联剂在离子交换剂中的比例，用重量百分率表示。交联剂在离子交换剂中的比例，用重量百分率表示。第27页，讲稿共66张，创作于星期二 3 3、膨胀度（吸水量）、膨胀度（吸水量）膨胀度：膨胀度：每每g g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时 间与温间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。影响膨胀度的因素有：影响膨胀度的因素有：（1 1）、基质）、基质 （2 2）、电荷基团）、电荷基团 （3 3）、离子强度和）、离子强度和pHpH值值亲水性离子交换剂大，疏亲水性离子交换剂大，疏水性离子交换剂小。与交水性离子交换剂小。与交联度的关系。联度的关系。强碱和强酸大于弱碱和弱酸；强碱和强酸大于弱碱和弱酸；电荷数和性质相同，相差不电荷数和性质相同，相差不大。大。交联度大的离子交换剂对离子强度和交联度大的离子交换剂对离子强度和pHpH值不敏感。交联度小或者弱的离值不敏感。交联度小或者弱的离子交换剂相反。子交换剂相反。第28页，讲稿共66张，创作于星期二4.4.交换容量交换容量交换容量交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常以每毫克或每毫升交交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq/mgmeq/mg或或meq/mlmeq/ml）表示。）表示。总交换容量：总交换容量：理论交换容量，它只和离子交换剂本身的性理论交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。质有关。有效交换容量：有效交换容量：实际交换容量，与实验条件有很大的关系，实际交换容量，与实验条件有很大的关系，后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。第29页，讲稿共66张，创作于星期二影响交换容量的因素：影响交换容量的因素：1 1、筛孔、筛孔要根据被分离的对象来选择。样品组分与离子交换剂作用要根据被分离的对象来选择。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大，交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量的表面积越大，交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。的离子交换剂。第30页，讲稿共66张，创作于星期二 2 2、离子强度、离子强度 一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。换剂上的样品组分洗脱下来。3 3、pHpH值值 首先首先pHpH值影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。值影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。其次影响离子交换剂的解离程度。其次影响离子交换剂的解离程度。pHpH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，弱对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，弱酸型离子交换剂在酸型离子交换剂在pHpH较高时，电荷基团充分较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的解离，交换容量大，而在较低的pHpH时，电时，电荷基团不易解离，交换容量小。荷基团不易解离，交换容量小。第31页，讲稿共66张，创作于星期二交换容量的测定法交换容量的测定法（1 1）强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法）强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1mol1molL L的的NaOHNaOH处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，1mol1molL L的的HClHCl处理，处理，去离子水洗至中性。然后用去离子水洗至中性。然后用1mol1molL L的的NaClNaCl洗脱，收集洗脱液，洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的再通过已标定的NaOHNaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。第32页，讲稿共66张，创作于星期二v（2 2）强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法）强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用1mol1molL L的的HClHCl处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，1mol1molL L的的NaOHNaOH处理，去处理，去离子水洗至中性。然后用离子水洗至中性。然后用1mol1molL L的的NaClNaCl洗脱，收集洗脱液，再通洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的过已标定的HClHCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。第33页，讲稿共66张，创作于星期二v（3 3）凝胶或纤维类弱碱性或弱酸性离子交换介质）凝胶或纤维类弱碱性或弱酸性离子交换介质换容量的测定方法换容量的测定方法 v 取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1mol1molL L的的NaClNaCl处理，处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaClNaCl或其他的或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按计算公式计算交换容量。按计算公式计算交换容量。第34页，讲稿共66张，创作于星期二5 5其它其它v稳定性稳定性，离子交换剂稳定性都较好，特别是树脂类离子，离子交换剂稳定性都较好，特别是树脂类离子交换剂，在浓度较高的酸或碱溶液中进行短期处理后，交换剂，在浓度较高的酸或碱溶液中进行短期处理后，其性质仍无改变。而亲水性离子交换剂的理化稳定性其性质仍无改变。而亲水性离子交换剂的理化稳定性一般与其基质的稳定性相近。与树脂类相比，稳定性一般与其基质的稳定性相近。与树脂类相比，稳定性差，易被污染。差，易被污染。v比重比重，离子交换剂经过溶胀处理后的比重是恒定的。不同的溶，离子交换剂经过溶胀处理后的比重是恒定的。不同的溶液中溶胀处理后的比重是有差异。液中溶胀处理后的比重是有差异。v流速流速，一般是由离子交换剂的性质、操作压、层析柱体积和分，一般是由离子交换剂的性质、操作压、层析柱体积和分离样品的要求等因子控制的。在操作压和其它层析条件相同的离样品的要求等因子控制的。在操作压和其它层析条件相同的情况下，离子交换剂的颗粒大，洗脱液的黏度小，流速就快，情况下，离子交换剂的颗粒大，洗脱液的黏度小，流速就快，反之流速则慢。反之流速则慢。第35页，讲稿共66张，创作于星期二第三节第三节 离子交换剂与缓冲液的选择离子交换剂与缓冲液的选择 一、离子交换剂的选择一、离子交换剂的选择 应用离子交换层析技术分离物质时，选择理想的离子交换剂应用离子交换层析技术分离物质时，选择理想的离子交换剂是提高是提高获得率和分辨率获得率和分辨率的重要环节。任何一种离子交换剂都不可的重要环节。任何一种离子交换剂都不可能适用于所有的样品物质的分离，因此必须根据各类离子交换剂的能适用于所有的样品物质的分离，因此必须根据各类离子交换剂的性质以及待分离物质的理化性质，选择一种最理想的离子交换剂进性质以及待分离物质的理化性质，选择一种最理想的离子交换剂进行层析分离。行层析分离。第36页，讲稿共66张，创作于星期二 选择离子交换剂的一般原则如下：选择离子交换剂的一般原则如下：(1)(1)阴、阳离子交换剂选择阴、阳离子交换剂选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定根据其在稳定pHpH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。(2)(2)强、弱离子交换剂选择强、弱离子交换剂选择 强型离子交换剂适用的强型离子交换剂适用的pHpH范围很广，常用来制备去离子水范围很广，常用来制备去离子水和分离一些在极端和分离一些在极端pHpH溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用换剂适用pHpH范围狭窄，在范围狭窄，在pHpH为中性的溶液中交换容量高，用它分为中性的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。离生命大分子物质时，其活性不易丧失。第37页，讲稿共66张，创作于星期二 (3)(3)不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择 离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择碱型离子交换剂应分别选择H H型和型和OHOH型；弱酸型和弱碱型交换剂应型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择分别选择NaNa型和型和ClCl型。型。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H H或或OHOH离子，因为其它离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H H或或OHOH型离子交换剂，因为分离过程中型离子交换剂，因为分离过程中H H或或OHOH离子被置换出来都会离子被置换出来都会改变层析柱内改变层析柱内pHpH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。第38页，讲稿共66张，创作于星期二(4)(4)不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择 交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质的稳定性和交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。较温和，活性不易破坏。第39页，讲稿共66张，创作于星期二二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择 离子交换剂不仅要与被分离的物质交换离子交换剂不仅要与被分离的物质交换,还要求与缓冲液进行交换。还要求与缓冲液进行交换。选用的选用的起始缓冲液，起始缓冲液，其其pHpH值和离子强度等要么能使样品中有效成分与离子交换剂结值和离子强度等要么能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合，合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合，pHpH值一般比有效成分的值一般比有效成分的pIpI值高一个单位值高一个单位或低一个单位，就能把有效成分和杂质分开。或者选择缓冲液的离子强度和或低一个单位，就能把有效成分和杂质分开。或者选择缓冲液的离子强度和pHpH值，使杂值，使杂质和离子交换剂结合牢固，有效成分和离子交换剂结合不牢。质和离子交换剂结合牢固，有效成分和离子交换剂结合不牢。洗脱液洗脱液的选择主要是使和离子交换结合的成分解离下来。离子强度比的选择主要是使和离子交换结合的成分解离下来。离子强度比起始缓冲起始缓冲液高。液高。缓冲液的选择关键在于有效成分的等电点。对于一种提取分离的未知有缓冲液的选择关键在于有效成分的等电点。对于一种提取分离的未知有效成分而言，其等电点须通过试验才能确定。效成分而言，其等电点须通过试验才能确定。选择选择缓冲液的方法缓冲液的方法(见见P89)P89)MoNoQ:MoNoQ:阴离子交换层析阴离子交换层析,颗粒直径颗粒直径10um,10um,载量载量65mg BSA/ml65mg BSA/ml MoNoS:MoNoS:阳离子交换层析阳离子交换层析第40页，讲稿共66张，创作于星期二第41页，讲稿共66张，创作于星期二第42页，讲稿共66张，创作于星期二三、加样量的确定三、加样量的确定 层析时加样量的多少除与离子交换剂的层析时加样量的多少除与离子交换剂的总交换容总交换容量量大小关系密切外，还与样品中有效成分的吸附性能大小关系密切外，还与样品中有效成分的吸附性能以及有效成分与杂质之间的比例等因子有关。以及有效成分与杂质之间的比例等因子有关。第43页，讲稿共66张，创作于星期二第四节第四节 操作操作一、交换剂的预处理、再生和转型一、交换剂的预处理、再生和转型商品离子交换树脂为干树脂，因含有一些水不溶性杂质，所商品离子交换树脂为干树脂，因含有一些水不溶性杂质，所以要处理，一般程序如下：干树脂加过量的水以要处理，一般程序如下：干树脂加过量的水除去细颗粒除去细颗粒，再再用水浸泡用水浸泡2 2小时后减压小时后减压抽去气泡抽去气泡，倾去水，再用大量去离子水洗，倾去水，再用大量去离子水洗至至澄清澄清，去水后加，去水后加4 4倍量的倍量的2mol/L HCl2mol/L HCl溶液，搅拌溶液，搅拌4 4小时，除去酸小时，除去酸液，用水洗至中性，再加液，用水洗至中性，再加4 4倍量的倍量的2mol/L NaOH2mol/L NaOH溶液，搅拌溶液，搅拌4 4小时，小时，除去碱液，用水洗至中性备用。除去碱液，用水洗至中性备用。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。处理，阴离子交换剂最后用酸处理。如果是如果是亲水型离子交换剂亲水型离子交换剂，只能用，只能用0.5mol/L NaOH0.5mol/L NaOH和和0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl混合溶液或混合溶液或0.5mol/L HCl0.5mol/L HCl溶液处理溶液处理(室温下处理室温下处理3030分钟分钟)。第44页，讲稿共66张，创作于星期二 离子交换剂的离子交换剂的再生再生是指对使用过的离子交换剂进行是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡的处处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的离子交换剂的转型转型是指离子交换剂由一种平衡离子转是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用HClHCl处理处理可将其转为可将其转为ClCl型，用型，用NaOHNaOH处理可转为处理可转为OHOH型，用甲酸钠处理型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换