利用酵母菌发酵生产细胞色素C工艺设计_课程设计说明书10038.docx

中北大学课程设计说明书发酵工程程课程设设计说明明书利用酵母母菌发酵酵生产细细胞色素素C的工工艺设计计学生姓名名：曹志志钦学号号：1110400641103化工与环境学院学 院：生物工程专 业：贾万利指导教师师：20133年 112月目录1 绪绪论11.1 引言言11.1.1 细胞色色素C的作用用11.1.2 酵母母菌的特特性11.2 课课程设计计的目的的11.3 课课程设计的任务及要要求22 酵酵母菌生生产工艺艺设计332.1 酵母母菌的选选取32.1.1 含微生生物材料料采集332.1.2 标本材材料的预预处理332.1.3 所需菌菌种的分分离42.1.4 酵母母菌菌株株纯种的的鉴定442.1.5 菌株的的诱变处处理42.1.6 菌种初初筛52.1.7 菌种的的复筛552.2 菌种种的保藏藏52.2.1 菌种保保藏的意意义63 培培养基的的配制773.1 培养养基的营营养要求求73.1.1 碳碳源73.1.2 氮源源73.1.3 无机机盐及微微量元素素73.1.4 水73.1.5 生长长因子、前前体、产产物促进进剂和抑抑制剂883.2 培养养基的种种类83.2.1 孢子子培养基基83.2.2 种子子培养基基83.2.3 发酵酵培养基基84 灭灭菌1004.1 灭菌菌的方法法104.2 培培养基的的连续灭灭菌1004.3 空气气灭菌1115 种种子扩大大培养1135.1 种子子制备工工艺1335.1.1 孢子子制备1135.1.2 实验室室种子阶阶段1335.1.3 生产车车间种子子制备阶阶段1335.2 种子子质量的的控制措措施1446 发发酵工艺艺控制1156.1 发酵酵的分类类156.2 发酵酵条件的的影响及及控制1156.2.1 基质浓浓度1556.2.2 灭菌情情况1556.2.3 种子的的质量1156.2.4 温度对对发酵过过程的影影响1666.2.5 pHH对发酵酵过程的的影响1166.2.6 溶氧对对发酵过过程的影影响1776.2.7 COO2对发酵酵的影响响176.2.8 发酵酵过程泡泡沫的控控制1777 发发酵计算算187.1 发酵酵罐的结结构1887.2 细胞胞色素CC发酵通通常采用用机械搅搅拌通风风发酵罐罐187.2.1 常用的的机械搅搅拌通风风发酵罐罐几何比比例1887.2.2 工艺艺计算1187.2.3 物料衡衡算1997.2.4 种子罐罐的设计计198 放放罐及染菌菌防治2218.1 发酵酵终点的的判断2218.2 发发酵染菌菌的防治治与处理理219 下下游加工工229.1 发发酵液的的过滤和和预处理理229.2 细细胞破碎碎229.3 细胞胞色素CC的提纯纯239.4 成品品加工与与包装22310 总结244参考文献献251 绪绪论1.1 引言言细胞色素素C是一一种以铁铁卟啉为为辅基的呼呼吸酶，是是细胞呼呼吸激活活剂，属属于络合合蛋白质质。由多多肽与血血色素络络合而成成。血色色素是铁铁的衍生生物，具具氧化还还原的可可逆性，从从而导致致细胞色色素能在生生理氧化化反应过过程中表表现出电电子传导导，即FFe2+Fee3+的的效能，以以促进细细胞的氧氧化反应应，达到到兴奋呼呼吸目的的。它在在生物氧氧化过程程中，是是一个非非常重要要的电子子传递体体。亲缘缘关系越越近的生生物，其其细胞色色素C越越相似或或相同，比比如人和和黑猩猩猩。而如如果在进进化史上上相去甚甚远，则则其细胞胞色素CC也相差差越远，比比如人和和酵母菌菌。 鉴鉴于细胞胞色素CC分子在在呼吸电电子传递递链中不不可或缺缺的地位位，其分分子结构构是相对对保守的的。但随随着生物物的进化化，其分分子组成成结构也也必将出出现变异异，只是是相对于于其他蛋蛋白来说说，细胞胞色素CC分子的的很多变变异可能能导致生生物体的的电子传传递出现现问题而而导致死死亡，因因此，其其分子进进化要缓缓慢而保保守。通通常外源源性细胞胞色素CC不能进进入健康康细胞，但但在缺氧氧时，细细胞膜的的通透性性增加，细细胞色素素C便有有可能进进入细胞胞及线粒粒体内，增增强细胞胞氧化，能能提高氧氧的利用用。有关关细胞凋凋亡的研研究表明明，细胞胞色素CC与细胞胞凋亡有有关，从从线粒体体中泄露露出的细细胞色素素C有诱诱导细胞胞凋亡的的作用。本次设计内容为利用酵母菌生产细胞色素C。主要通过采用富集培养、结合平板划线、涂布等手段成功的从活性污泥中分离筛选到高产细胞色素C的酵母菌，之后发酵生产细胞色素C，后期采用二氧化碳超声波萃取等方法提取细胞色素C，达到最佳的生产效果，降低成本。1.1.1 细胞色素素C的作作用【用途一一】来自自三羧酸酸循环产产生的琥琥珀酸辅辅酶A，其其肽链仅仅有1004个氨氨基酸，体体内大量量存在，无无需外源源补充。细细胞色素素C是生生物氧化化的非常常重要的的电子传传递体，在在线粒体体崤上与与其它氧氧化酶排排列成呼呼吸链，参参与细胞胞呼吸过过程。肝肝细胞炎炎症时细细胞膜通通透性较较高，细细胞色素素C可进进人细胞胞内。可可治疗肝肝衰竭，增增加细胞胞氧化，提提高氧利利用。是是含铁的的结合蛋蛋白，有有抗原。【用途二二】细胞胞呼吸激激活药。对对组织中中细胞的的氧化、还还原过程程具有迅迅速的酶酶促作用用。用于于急救或或辅助治治疗中因因各种原原因引起起的组织织缺氧。对对抗癌药药物引起起的白血血球降低低，四肢肢循环障障碍，肝肝疾患，肾肾炎亦有有一定的的治疗作作用。1.1.2 酵母菌的的特性酵母菌是是人类直直接食用用量最大大的一种种微生物物。酵母母菌体含含有丰富富的蛋白白质、脂脂肪、细细胞色素素C、糖糖分、BB族维生生素、酶酶、辅酶酶、核糖糖核酸、甾甾醇和一一些新陈陈代谢的的中间产产物。在在医药工工业中，酵酵母菌及及其制品品用于治治疗某些些消化不不良症，并并能提高高和调整整人体的的新陈代代谢机能能。因此此，药用用酵母菌菌的生产产在酵母母工业中中占有重重要的地地位。此此外，因因为酵母母菌体内内富含细细胞色素素C，核核酸，谷谷胱甘肽肽等生理理活性物物质，可可以从酵酵母菌体体内提取取细胞色色素C。利利用发酵酵生产的的细胞色色素C大大大降低低了其成成本并且且能为医医疗方面面做出重重大贡献献。1.2 课程设计计的目的的通过本课课程设计计，进一一步掌握握发酵酵工程课课程的基基本知识识，掌握握发酵工工艺设计计要点及及其相关关工程设设计要点点，具备备初步的的发酵工工程工艺艺及设备备的独立立设计能能力；培培养生物物工程专专业学生生综合运运用所学学的理论论知识独独立分析析和解决决发酵工工程实际际问题的的实践能能力。1.3 课程设计计的任务务及要求求设计任务务：完成成年产55吨细胞胞色素CC发酵的的生产工工艺，其其中包括括菌种选选育、培培养基的的设计及及灭菌、空空气除菌菌（如为为需氧发发酵）、种种子的扩扩大培养养、设备备的选用用、发酵酵过程中中的控制制参数和和下游加加工等。设计要求求： 按照照年产量量要求进进行工艺艺设计，不不得造成成设备浪浪费，节节约人力力、物力力和能源源。 进行行简单的的物料衡衡算。 绘制制设计图图，要求求一张工工艺流程程图和一一张主设设备结构构图，AA4纸打打印。2 酵酵母菌生生产工艺艺设计酵母菌主主要的生生长环境境是潮湿湿或者液液态的环环境，有有些酵母母菌也会会在生物物体内，所所以需要要根据实实际需要要选取所所需的合合适菌种种，如何何从多样样的酵母母菌中选选择一种种可以用用于工业业生产的的，性质质稳定的的菌株是是非常重重要的，也也是决定定工业发发酵成败败的关键键之一。根据酵母母菌发酵酵生产的的总体特特点，设设计菌株株的选择择性分离离的步骤骤；含微微生物材材料采集集标本材材料的预预处理菌种的的分离富集培培养菌株诱诱变菌种初初选菌种复复选性能鉴鉴定菌种保保藏。2.1 酵母母菌的选选取2.1.1 含微生生物材料料采集土壤由于于具备了了微生物物所需的的营养、空空气和水水分等条条件，所所以是微微生物最最集中的的地方。从从土壤中中几乎可可以分离离到任何何所需的的菌株，空空气、水水中的微微生物也也都来源源于土壤壤，所以以土壤样样品往往往是首选选的采集集目标。一一般情况况下，土土壤中含含细菌数数量最多多，且每每克土壤壤的含菌菌量大体体有如下下的递减减规律：细菌（1108）>放放线菌（1107）>霉霉菌（1106）>酵酵母菌（1105）>藻藻类（1104）>原原生动物物（1003），其其中放线线菌和霉霉菌指其其孢子数数。但各各种微生生物由于于其生理理特性不不同，在在土壤中中的分布布也随着着地理条条件、养养分、水水分、土土质、季季节而有有很大的的变化。据据有关资资料的显显示，性性能研究究，性能能优异，为为了可以以选择好好的菌种种，潮湿湿或液态态环境土土壤是很很好的选选择。酵母菌在在自然界界中分布布很广，尤尤其喜欢欢在偏酸酸性且含含糖较多多的环境境中生长长。例如如，在水水果、蔬蔬菜、花花蜜的表表面和在在果园土土壤中最最为常见见。取样时先先除去表表层5ccm表土土，取55155cm深深的土壤壤，5处处采集，每每份样品品重约5500gg，给塑塑料袋编编号并记记录地点点、土壤壤质地、植植被名称称、时间间及其他他环境条条件。得得到来自自果树下下腐叶土土的011号009号土土样。2.1.2 标本材材料的预预处理因为我们们所选择择的菌株株是在潮潮湿或液液态环境境下有利利生存，因因此在对对材料的的预处理理中，我我们应该该同样置置材料于于潮湿或或液态环环境下，加加入一些些物质促促进酵母母菌的生生长，抑抑制其它它细菌的的生长。保保证所需需菌种的的生长条条件，阻阻止其它它的菌种种的优势势生长。对样品进进行处理理，调节节pH为为5.00，在330条件下下，加热热20分分钟，即即可除去去部分细细菌，利利于分离离得到所所需要的的菌株。2.1.3 所需菌菌种的分分离大多数酵酵母菌为为腐生，其其生活最最适pHH为4.5一55，常见见于含糖糖分较高高的环境境中，例例如果园园土、菜菜地土及及果皮等等植物表表面。酵酵母菌生生长迅速速，易于于分离培培养，在在液体培培养基中中，酵母母菌比霉霉菌生长长得快。根据酵母母菌喜欢欢酸性环环境的特特点，利利用上述述酸性液液体培养养基（这这样做的的好处是是酸性培培养条件件则可抑抑制细菌菌的生长长），在在30下培养养4小时时，产生生一些菌菌落，用用变色圈圈法分离离，从培培养基中中挑取一一些较大大较厚，呈呈乳白色色或红色色，表面面湿润、粘粘稠的菌菌株。即即得到所所需初级级菌种。2.1.4 酵母母菌菌株株纯种的的鉴定把分离纯纯化到的的酵母菌菌接到液液体培养养基平板板中,在在30下各培培养244488h.若若液体管管内不出出现浑浊浊,平板板上不长长出杂菌菌菌落，同同时菌株株在平板板培养基基上又可可形成均均一具特特征性的的单菌落落,再结结合镜检检无异样样细胞发发现,即即可证明明获得的的菌株为为纯培养养物。2.1.5 菌株的的诱变处处理诱变处理理的理论论基础是是基因突突变。所所谓突变变是指由由于染色色体和基基因本身身的遗传传性状的的变异。从自然界获得的菌种，通过进一步的菌种选育，可以为发酵提供各种类型的突变株，提高发酵单位，还可以改进产品质量，去除多余的代谢产物和合成新品种，有利于经济效益的提高。本次菌株的诱变处理采用物理诱变处理法：紫外线诱变 l 菌悬液的的制备：选择培培养好的的斜面，加加入 110mll无菌水水，用吸吸管将孢孢子轻轻轻刮下后后吸出，用用研磨器器将菌悬悬液研磨磨，得到到单细胞胞菌悬液液。用血血球计数数板计算算孢子数数在 220-330 亿亿个mll-1。 l 菌悬液的的预培养养：取 10mml 研研磨后的的菌悬液液接入装装量为 25mml 的的液态斜斜面培养养基中预预培养 2h。 l 紫外诱变变：将预预培养的的单细胞胞菌悬液液加入平平皿中，每每皿 11ml，用用磁力搅搅拌器缓缓慢搅拌拌菌悬液液，在红红外光下下操作，用用 300W 紫紫外灯管管，距离离 255cm，照照射300secc5miin。在在照射受受试菌前前，灯管管须预热热 200minn。照射射后平皿皿用黑布布包严，防防止发生生可见光光的修复复作用。 l 培养：用用吸管吸吸取诱变变后的孢孢子悬液液，稀释释 100-110-3倍涂涂布细胞胞色素CC性平皿皿，用三三角耙把把菌液涂涂匀。单单菌落于于 300培养 1418 天，第第二天倒倒置培养养。 得得到诱变变后的目目的的菌菌株。2.1.6 菌种初初筛用于生产产的菌株株必须要要有一定定的生活活能力和和生产能能力，所所获得的的菌株需需要经过过一定的的手段进进行检测测，其符符合规定定后才能能作为生生产菌种种来使用用。将各诱变变处理后后的待测测菌株接接种在固固体培养养基斜面面上，活活化3代代(每代代24hh)。取取各菌株株以相同同量接种种于液体体培养基基试管中中(装样样量5mmL)，在在30培养箱箱中静置置24hh .再再将装有有增殖菌菌株的各各试管内内液体倒倒入装有有60 mL 发酵培培养基的的三角烧烧瓶中，用用纱布封封口，于于30 摇床(转速1140rr/miin)培培养155h。即即可得到到一些所所需的菌菌种，挑挑选性能能优良菌菌落，传传代培养养233代，斜斜面保藏藏备用。2.1.7 菌种的的复筛将用分离离培养得得到的菌菌种实验验室中保保藏的某某些菌种种筛选。选选取菌株株生长状状况比较较好的菌菌落，分分别编号号，选取取10株株，做标标记，分分别为 Y1Y100 ，进进行发酵酵培养基基和发酵酵条件优优化的研研究。 2.2 菌种种的保藏藏菌种保藏藏主要是是根据菌菌种的生生理生化化特点，人人工创造造条件，使使孢子或或菌体的的生长代代谢活动动尽量降降低，以以减少其其变异。一一般可通通过保持持培养基基营养成成分在最最低水平平、缺氧氧状态、干干燥和低低温，使使菌种处处于“休眠”状态，抑抑制其繁繁殖能力力。常用用的菌种种宝藏方方法有：斜面冰冰箱保藏藏法、沙沙土管保保藏法、菌菌丝速冻冻法、石石蜡油封封法、真真空冷冻冻干燥保保藏法、液液氮超低低温保藏藏法。在这里我我们采用用沙土保保藏法。方法：将将需保藏藏的菌种种经斜面面培养后后用无菌菌水制成成孢子悬悬液，加加入经灭灭菌处理理的沙和和土的混混合物（或或纯沙亦亦可）作作为载体体，减压压抽去水水分，这这些吸附附有孢子子的干燥燥沙土载载体，在在低温下下保存。操作步骤骤：斜面面孢子先先加灭菌菌蒸馏水水222.5mml，沿沿斜面轻轻刮孢子子后，再再吸0.200.3 ml到到灭菌备备用的沙沙土管中中，在真真空度1100 Pa以以下进行行干燥，直直至沙土土管外貌貌呈松散散状态，然然后低温温（4）保存存。经真真空干燥燥后的沙沙土管，最最好放在在密闭容容器内，容容器内可可放硅胶胶等，保保藏期间间整个容容器置于于冰箱内内。一般般保存期期为一年年左右。2.2.1 菌种保保藏的意意义菌种保藏藏是进行行微生物物研究和和微生物物育种工工作的重重要组成成部分，其其首要任任务是使使菌种不不死亡，同同时还要要尽可能能设法把把菌种的的优良特特性保持持下来而而不致向向坏的方方面发展展。3 培培养基的的配制3.1 培养养基的营营养要求求3.1.1 碳源碳源是组组成培养养基的主主要成分分之一。主主要功能能有两个个：一，为为微生物物菌种的的生长繁繁殖提供供能源和和合成菌菌体所必必需的碳碳成分；二，为为合成目目的产物物提供所所必需的的碳成分分。常用用的碳源源有糖类类、油脂脂、有机机酸和低低碳醇等等，可分分为速效效碳源和和长效碳碳源。糖糖类是发发酵培养养基中最最为广泛泛应用的的碳源，主主要有葡葡萄糖、糖糖蜜和淀淀粉糊精精等。糖糖蜜是制制糖生产产时的结结晶母液液，而且且它是制制糖工业业中的副副产物。糖糖蜜中含含有丰富富的糖、氮氮类化合合物、无无机盐和和维生素素等，是是微生物物发酵培培养基价价廉物美美的碳源源。这种种糖蜜主主要含有有蔗糖，总总糖可达达50%755%。一一般地，糖糖蜜分为为甘蔗糖糖蜜和甜甜菜糖蜜蜜，二者者在糖的的含量和和无机盐盐的含量量上有所所不同，即即使同一一种糖蜜蜜由于其其加工方方法的不不同其成成分也存存在或多多或少的的差异（如如下表所所示），因因此，要要注意合合理选择择。3.1.2 氮源源用于构成成细胞菌菌体物质质（氨基基酸，蛋蛋白质，核核酸等）。常常用的氮氮源可分分为两类类，有机机氮源：黄豆饼饼粉、玉玉米浆、蛋蛋白胨、酵酵母粉、鱼鱼粉等。无无机氮源源：铵盐盐、硝酸酸铵和氨氨水等。不不同氮源源以鱼粉粉最好，辅辅加氮源源以硝酸酸铁为佳佳。氨水水在发酵酵中除可可调节ppH外，也也是一种种容易利利用的氮氮源，在在抗生素素的生产产中得到到广泛应应用。氨氨水碱性性较强，使使用时要要防止局局部过碱碱，应加加搅拌的的强度，并并且注意意应该少少量多次次加入。3.1.3 无机机盐及微微量元素素成分：NNaCll，其主主要作用用是改变变细胞外外的渗透透压，从从而改善善传质效效果。但但Cl或Naa+浓度过过高会对对微生物物产生毒毒性。CCaCOO3，(55177g/LL)稳定定发酵液液的pHH值，中中和代谢谢过程中中产生的的酸性物物质。MMgSOO4,（00.2553.0 gg/L）作作为微量量元素，可可能与某某些酶的的活性或或一些物物质的运运输有关关。Mgg3(POO4)2，在00.01.00%的范范围内，MMg3(POO4)2浓度越越高，细细胞色素素C发酵酵效价越越高，但但更高的的Mg33(POO4)2加量对对细胞色色素C发发酵的影影响不明明显。在在生产中中需要通通过试验验预先了了解菌种种对无机机盐和微微量元素素的最适适需求量量，以稳稳定或提提高产量量。常用用无机盐盐的浓度度查阅新新编生物物工艺学学（P1104）3.1.4 水水是所有有微生物物的主要要组成成成分，也也是微生生物机体体的重要要组成成成分。它它还是一一切营养养物质传传递的介介质，而而且它还还直接参参与许多多代谢反反应。不不同来源源的水（如如深井水水、自来来水、地地表水）所所含的物物质不同同，因此此水的质质量对微微生物生生长会产产生一定定的影响响。水源源质量的的主要考考虑参数数包括ppH值、溶溶解氧、可可溶性固固体、污污染程度度以及矿矿物质的的组成和和含量。在在发酵工工业中，一一个高单单位的生生产菌种种也会因因水质不不同而导导致其在在异地不不能发挥挥其生产产能力。所所以水的的选取尤尤其值得得注意，不不能大意意。3.1.5 生长长因子、前前体、产产物促进进剂和抑抑制剂生长因子子是微生生物生长长不可缺缺少的有有机物质质，如氨氨基酸、嘌嘌呤、嘧嘧啶、维维生素等等均称生生长因子子。氨基基酸是一一种有机机氮源，同同时也可可以作为为一种生生长因子子。在生生产实践践中因为为氨基酸酸价格比比较昂贵贵，且许许多有机机氮源中中如玉米米浆中含含有一定定量的氨氨基酸，能能够满足足发酵的的需要，所所以常用用玉米浆浆代替氨氨基酸在在工业生生产培养养基中使使用。前前体是能能直接被被微生物物在生物物合成中中结合到到产物分分子中去去，而自自身的结结构没有有多大变变化的化化合物，但但产物的的产量却却因加入入前体而而有较大大的提高高。促进进剂：是是指那些些非细胞胞生长所所需的营营养物质质，又非非前体，但但加入后后能提高高产品产产量的添添加剂。3.2 培养养基的种种类培养基可可以按照照用途可可以分成成孢子培培养基、种种子培养养基和发发酵培养养基。3.2.1 孢子子培养基基孢子培养养基配制制的目的的是供菌菌体繁殖殖孢子的的，常采采用的是是固体培培养基，对对这类培培养基的的要求是是能使菌菌体生长长快速，产产生数量量多而优优质的孢孢子，并并且不会会引起菌菌体变异异。对孢孢子培养养基的要要求：营养不不要太丰丰富；所用无无机盐的的浓度要要适量；注意培培养基的的pH和和湿度。斜面、分分离培养养基（gg/L）：蔗糖 60，酵酵母粉 200，蛋白白胨 110，琼琼脂 20，自自来水配配制，ppH=55。3.2.2 种子子培养基基种子培养养基是供供孢子发发芽、生生长和大大量繁殖殖菌丝体体，并使使菌丝体体长得粗粗壮成为为活力强强的种子子。对于于种子培培养基的的营养要要求比较较丰富和和完全，氮氮源和维维生素的的含量也也比较高高些，浓浓度以稀稀薄为好好，可以以达到较较高的溶溶解氧，供供大量菌菌体生长长和繁殖殖。细胞色素素C的种种子培养养基的配配比为（gg/L）：蔗糖110.55，硫酸酸铵0.1，磷磷酸二氢氢钾0.1%，七七水硫酸酸镁0.04，ppH=55。3.2.3 发酵酵培养基基发酵培养养基的要要求是营营养要适适当丰富富和完全全适合于于菌种的的生理特特性和要要求，使使菌种迅迅速生长长、健壮壮，能在在比较短短的周期期内充分分发挥产产生菌合合成发酵酵产物的的能力，但但要注意意成本和和能耗。细胞色素素C的发发酵培养养基配比比为（gg/L）：蔗糖110.55，蛋白白胨100，酵母母粉5，NNaCll 100，KCCl 11.8，酵酵母膏22.5，醋醋酸8.2。培养基灭灭菌后，接接入种子子，搅拌拌，288，通风风量0.8vvvm,培培养3d，pHH=6.4 灭灭菌原理：对对数残留留定律：N=NN0×e-ktt，灭菌菌结束时时，培养养基中的的活微生生物数一一般为00.0001个。4.1 灭菌菌的方法法化学灭菌菌，射线线灭菌，干干热灭菌菌，湿热热灭菌，过过滤灭菌菌。4.2 培培养基的的连续灭灭菌本次条件件为在1121（表压压约0.1MPPa）维维持300分钟。将配制好好的培养养基在通通入发酵酵罐时进进行加热热、保温温、降温温的灭菌菌过程，称称为连续续灭菌，特特点是高高效、快快速。连连续灭菌菌时培养养基在短短时间内内被加热热到灭菌菌温度，短短时间保保温后被被快速冷冷却，再再进入早早已灭完完菌的发发酵罐，这样可以减少对培养基的破坏，提高发酵设备利用率，实现自动控制。培养基连续灭菌设备流程如图4.1所示：图4.11培养基基连续灭灭菌设备备流程影响灭菌菌效果的的因素微生物物的种类类和数量量；培养基基性质、浓浓度、成成分；灭菌的的温度、时时间。热阻：微微生物对对热的阻阻抗能力力。 培培养基灭灭菌之前前，先对对种子罐罐、发酵酵罐等其其他设备备进行空空罐灭菌菌。灭菌菌条件为为1211（表压压约0.1MPPa）维维持300分钟。4.3 空气气灭菌细胞色素素C的生生产属于于好氧发发酵，所所以制备备无菌空空气至关关重要。发发酵用的的无菌空空气就是是将自然然界的空空气经过过压缩、冷冷却、减减湿、过过滤等过过程。空空气除菌菌的流程程图如图图4.22所示：图4.22 空气气除菌设设备流程程图流程如下下：采风风塔空气粗粗过滤器器空气压压缩机储气罐罐冷却器器旋风分分离器冷却器器丝网除除沫器空气加加热器总空气气过滤器器。设备如下下： 采风风塔：采采风塔建建在工厂厂的上风风头，高高至少110 mm,气流流速度88 m/s。 粗过滤滤器：主主要作用用是拦截截空气中中较大的的灰尘以以保护空空气压缩缩机，同同时起一一定的除除菌作用用，减轻轻总过滤滤器的负负担。 空气压压缩机：作用是是提供动动力，以以克服随随后各设设备的阻阻力。 空气储储罐：作作用是消消除压缩缩空气的的脉动。 要求：H/BB=22.55 VV=（00.10.22）V11 其中，HH为罐高高；B为罐直直径；V1为空空压机每每分钟排排气量（220，1×105Pa状状况下）。 旋风分分离器：是利用用离心力力进行气气-固或或气-液液沉降分分离的设设备。作作用是分分离空气气中被冷冷却成雾雾状的较较大的水水雾和油油雾粒子子。 冷却器器：空压压机出口口温度气气温在1120左右，必必须冷却却。另外外在潮湿湿的地域域和季节节还可以以达到降降湿的目目的。丝网除沫沫器：可可以除去去空气中中绝大多多数的220µm 以以上的液液滴和11µm以上上的雾滴滴，一般般采用规规格为直直径0.25×40孔孔且高度度为1550的的不锈钢钢丝网。空气加热热器：列列管内走走空气，管管外走蒸蒸汽。可可将空气气湿度由由1000%降低低到700%以下下。总过滤器器：填充充物按下下面顺序序安装：孔板铁丝网网麻布活性炭炭麻布棉花麻布铁丝网网孔板。介介质要紧紧密均匀匀，压紧紧一致，上上下棉花花层厚度度为总过过滤层厚厚度的11/4，中中间活性性炭层为为1/33。过滤是空空气除菌菌的主要要手段，按按过滤介介质孔隙隙将空气气过滤器器分为两两类：绝绝对过滤滤，相对对过滤。后后者主要要原理为为：1惯惯性滞留留作用，22拦截滞滞留作用用，3布布朗扩散散作用，44重力沉沉降，55静电作作用。5 种种子扩大大培养作为种子子的准则则是：菌种细细胞的生生活力强强，移种种至发酵酵罐后能能迅速生生长，迟迟缓期短短；生理性性状稳定定；菌种总总量及浓浓度能满满足大容容量发酵酵罐的要要求；无杂菌菌污染；保持稳稳定的生生产能力力。种子子的制备备主要包包括实验验室种子子的制备备和种子子的扩大大培养两两个阶段段。细胞色素素C采用用二级发发酵。其其流程为为：沙土土管孢子斜斜面培养养基摇瓶液液体培养养基种子罐罐发酵罐罐发酵液液5.1 种子子制备工工艺种子扩大大培养是是指将保保存在砂砂土管、冷冷冻干燥燥管处于于休眠状状态的生生产菌种种接入试试管斜面面活化后后，再经经过扁瓶瓶或摇瓶瓶及种子子罐逐级级扩大培培养而获获得一定定数量和和质量的的纯种的的过程。包包括：实验室室种子制制备阶段段，包括括琼脂斜斜面、固固体培养养基扩大大培养或或摇瓶液液体培养养；生产车车间种子子制备阶阶段，如如种子罐罐扩大培培养。5.1.1 孢子子制备保藏在沙沙土管或或冷冻干干燥管中中的菌种种经无菌菌手续接接入适合合孢子发发芽或菌菌丝生长长的斜面面培养基基中，培培养成熟熟后挑选选菌落正正常的孢孢子用摇摇瓶液体体培养，在在摇床上上恒温振振荡培养养，获得得菌丝体体作为种种子。5.1.2 实验室室种子阶阶段取保藏菌菌种，将将其在固固体斜面面培养基基中，223个个月移种种一次，培培养一段段时间，然然后再转转移到摇摇瓶培养养，然后后放在摇摇床上恒恒温培养养。从活活化的斜斜面上挑挑取两环环菌种接接入种子子培养基基，摇瓶瓶种子培培养采用用2500mL的的锥形瓶瓶，装液液量800mL，接接种量110%（88mL），瓶瓶口用棉棉花塞住住。摇床床转速1120rrpm，温温度300，培养养1824h。5.1.3 生产车车间种子子制备阶阶段将筛选得得到的菌菌种用于于工业生生产还必必须经过过种子的的扩大过过程，也也就是生生产种子子的制备备。因发发酵生产产的不同同，生产产种子一一般可分分为一级级种子制制备、二二级种子子制备和和三级种种子制备备。本设设计的细细胞色素素C发酵酵中采用用一级种种子制备备，二级级发酵。一级种子子制备，是是指将来来自摇瓶瓶培养的的菌体，打打开接种种口在火火焰保护护下接种种到1mm³种子罐罐中培养养，接种种量为种种子罐内内的培养养基量的的10%，培养养18hh，以备备发酵接接种使用用。一级级种子制制备的培培养温度度均为330，转速速为1550rppm，通通气量为为1vvvm。5.2 种子子质量的的控制措措施种子质量量的最终终指标是是考察其其在发酵酵罐中说说表现的的生产能能力。因因此首先先必须保保证生产产菌种的的稳定性性，其次次是提供供种子培培养的适适宜环境境，保证证无杂菌菌侵入，以以获得优优良种子子。主要要包括菌菌种稳定定性检查查和无杂杂菌检查查。在接接种过程程中所有有设备和和培养基基必须经经过灭菌菌。在种种子罐培培养中要要严格控控制罐温温、罐压压，并定定时取样样做无菌菌试验，观观察菌体体形态，测测定罐内内种子液液的发酵酵单位并并对其进进行生化化分析，观观察有无无杂菌情情况，只只有种子子质量合合格，浓浓度达到到1088个/mmL水平平时才可可移出接接种到发发酵罐中中发酵。6 发发酵工艺艺控制6.1 发酵酵的分类类微生物发发酵过程程可分为为分批、补补料-分分批、半半连续和和连续等等几种方方式。分批发酵酵是一种种准封闭闭式系统统，种子子接种到到培养基基后除气气体流通通外发酵酵液始终终留在生生物反应应器内。补料-分分批发酵酵是在分分批发酵酵过程中中补入新新鲜的料料液，以以克服由由于养分分的不足足，导致致过早结结束。由由于只有有料液的的输入，没没有输出出，因此此，发酵酵液的体体积在不不断增加加。半连续发发酵是在在补料-分批发发酵的基基础上加加上间歇歇放掉部部分发酵酵液便可可称为半半连续发发酵。考考虑到补补料-分分批发酵酵虽可通通过补料料补充养养分或前前体的不不足，但但由于有有害代谢谢物的不不断积累累，产物物合成最最终难免免受到阻阻遏。放放掉部分分发酵液液，再补补入适当当料液不不仅补充充养分和和前体而而且代谢谢有害物物被稀释释，从而而有利于于产物的的继续合合成。连续发酵酵是发酵酵过程中中一边补补入新鲜鲜的料液液，一边边以相近近的流速速放料，维维持发酵酵液原来来的体积积。本设计采采用分批批发酵。6.2 发酵酵条件的的影响及及控制6.2.1 基质浓浓度基质浓度度必须严严格控制制，培养养基过于于丰富，会会使菌体体生长过过于旺盛盛，发酵酵液非常常粘稠，传传质状况况很差，细细胞不得得不花费费许多能能量来维维持其生生存环境境，即用用于非生生产的能能量倍增增，对发发酵不利利。6.2.2 灭菌情情况培养基的的灭菌情情况对不不同品种种的发酵酵生产的的影响是是不一样样的。一一般，随随着灭菌菌温度的的升高，时时间的延延长，对对养分的的破坏作作用越大大，从而而影响菌菌体的生生长，特特别是葡葡萄糖，不不宜同其其它养分分一起灭灭菌。6.2.3 种子的的质量发酵期间间生产菌菌种生长长的快慢慢很大程程度上取取决于种种子的质质和量。具具体的反反映在接接种龄和和接种量量上。接种龄是是指种子子罐中培培养的菌菌体开始始移种到到下一级级种子罐罐或发酵酵罐的培培养时间间。一般般，接种种菌龄以以对数生生长期的的后期，即即培养液液中菌浓浓度接近近高峰时时所需的的时间较较为适宜宜。太年年轻的种种子接种种后往往往会出现现前期生生长缓慢慢，整个个发酵周周期延长长，产物物开始形形成时间间推迟。过过老的种种子虽然然菌量较较多，但但接种后后会导致致生产能能力的下下降，菌菌体过早早自溶。接种量是是指移种种的种子子液体积积和培养养液体积积之比。一一般，发发酵常用用的接种种量为55%110%。接接种量的的大小是是由发酵酵罐中菌菌的生长长繁殖速速度决定定的。通通常，采采用较大大的接种种量可以以缩短生生长达到到高峰的的时间，使使产物合合成提前前，比较较节省时时间。这这是由于于种子量量多，同同时种子子液中含含有大量量胞外水水解酶类类，有利利于基质质的利用用，并且且生产菌菌在整个个发酵罐罐内迅速速占优势势，从而而减少杂杂菌生长长的机会会。但是是，如接接种量过过大，也也可能使使菌种生生长过快快，培养养液粘度度增加，导导致溶氧氧不足，影影响产物物合成，对对于大规规模培养养有一定定的局限限性。6.2.4 温度对对发酵过过程的影影响温度对发发酵的影影响主要要表现在在以下四四个方面面：（1） 温度对微微生物菌菌体的生生长、呼呼吸以及及产物合合成影响响程度不不同。（2） 温度影响响发酵过过程中基基质和营营养物溶溶解的速速率和气气体的传传递效率率。（3） 温度影响响生物合合成的方方向。（4） 温度影响响代谢调调控。在菌体生生长期，保保持较高高的温度度，酶反反应速率率增大，有有利于菌菌体快速速生长，从从而可以以缩短生生长期，但但酶本身身很容易易因过热热而失去去活性，使使菌体容容易衰老老，发酵酵周期缩缩短；控控制发酵酵0224h培培养温度度为288，菌体体基础代代谢较快快，营养养物质消消耗也快快。所以以，要注注意营养养的及时时补充。6.2.5 pHH对发酵酵过程的的影响pH是微微生物生生长和产产物合成成的最重重要的状状态参数数，pHH的变化化会影响响各种酶酶活、菌菌对基质质的利用用速率和和细胞的的结构，从从而影响响菌的生生长和产产物的合合成。大大多数微微生物的的生长适适应的ppH跨度度为34个ppH单位位，最佳佳生长ppH跨度度在0.511个单位位。酵母母菌的最最适范围围在45。其其生长和和产物合合成阶段段的最适适pH通通常是不不一样的的。控制制pH在在合适范范围应首首先从基基础培养养基的配配方考虑虑，然后后通过加加酸或碱碱或中间间补料来来控制，如如pH上上升超过过最适值值时，意意味着菌菌体处于于饥饿状状态，可可加葡萄萄糖；ppH下降降时，可可加尿素素，过滤滤的氨水水。用氨氨水中和和有机酸酸时需谨谨慎，过过量的氨氨水会使使微生物物中毒，导导致呼吸吸强度急急速下降降。6.2.6 溶氧对对发酵过过程的影影响溶氧是微微生物生生长所必必需的，溶溶氧是影影响细胞胞色素CC发酵的的重要因因素，溶溶氧太低低会使糖糖代谢缓缓慢，菌菌体生长长不良，产产物合成成受阻。溶溶氧太高高则使菌菌体生长长过于旺旺盛，底底物完全全氧化的的比例过过高，也也不利于于细胞色色素C的的合成。对对溶氧的的控制还还应考虑虑底物的的浓度，在在不同的的底物浓浓度下应应有不同同的溶氧氧水平，底底物浓度度较高时时，增加加DO可可以加强强菌体的的代谢活活性，不不会因为为基质的的完全氧氧化降低低产量。底底物浓度度较低时时，过高高的溶氧氧会导致致基质的的完全氧氧化而降降低细胞胞色素CC的产量量。DOO水平应应该保持持在500%以下下。6.2.7 COO2 对发发酵的影影响溶解在发发酵液中中的COO2对发酵酵有抑制制或刺激激作用。大大多数微微生物适适应低浓浓度COO2，当尾尾气COO2浓度高高于4