第二章临床生物化学实验室基本技术与管理bqjq.docx

第二章 临床生生物化学学实验室室基本技技术与管管理实验室的的基本技技术与管管理是临临床生物物化学检检验工作作的重要要基础。本本章所涉涉及的实实验室基基本技术术与管理理主要是是应用于于临床生生物化学学检测的的分析技技术与质质量管理理，目的的在于加加强基础础，提高高生物化化学检验验的质量量。对于于实验室室的其他他基本知知识，基基本技术术以及实实验室的的管理方方法，可可参阅其其他相关关教材。第一节 常用用临床生生物化学学分析技技术 临床生生物化学学分析技技术很多多，常用用的主要要有光谱谱分析技技术、电电泳技术术、离心心技术、层层析技术术、电化化学分析析技术等等。一、光谱谱分析技技术利用各种种化学物物质所具具有的发发射、吸吸收或散散射光谱谱谱系的的特征，来来确定其其性质、结结构或含含量的技技术，称称为光谱谱分析技技术。根根据光谱谱谱系的的特征不不同，可可把光谱谱分析技技术分为为发射光光谱分析析、吸收收光谱分分析和散散射光谱谱分析三三大类。在在临床生生物化学学检验中中，光谱谱分析是是一类十十分重要要的技术术，应用用极为广广泛。分光光度度法(sspecctroophootommetrry)I.光光谱分析析法(pphottomeetryy)1.定定义：根根据物质质吸收、发发射或散散射辐射射能而建建立起来来的一类类分析方方法。2.光光的基本本性质：高速传传播的电电磁辐射射；具有波动动性(l=c/v)和微粒粒性(EE=hvv)；短波能量量大，长长波能量量小3.物物质对光光吸收的的基本原原理：能量转移移-当光光辐射通通过某种种物质时时，组成成该物质质的分子子与光子子发生“碰撞”，光子子的能量量就转移移至分子子、原子子上，使使它们由由基态(低能态态)跃迁到到激发态态(高能态态)，这种种跃迁称称为激发发。选择吸收收-组成成物质的的分子仅仅吸收与与其内能能变化(基态与与激发态态能量差差)相对应应的波长长或频率率的光，所所得到的的光谱称称为吸收收光谱。发 e.g.,射 荧光 光谱吸 收 激光 发谱激发态(E1)能量释放放-处于于较高能能态的分分子(激发态态分子)不稳定定，当其其返回基基态时，以以热或发发射光谱谱的形式式将能量量释放出出来。所所发射出出的相应应光谱，称称分子发发射光谱谱。DE=E1-E2=hv基态(E0)4.分分类(1)吸吸收光谱谱分析法法：根据据溶液能能吸收由由光源发发出的某某些可见、紫外分光光度法(visible and ultraviolet spectrophotometry) *原子吸收光谱法(atomic absorption spectrophotometry)：微量金属元素红外分光光度法波长的光光后所形形成的特特征光谱谱来鉴定定该物质质的性质质和含量量的方法法。(2) 发射光光谱分析析法：根根据物质质受到热热能或电电能等的的激发火焰发射光谱法(flame emission photometry)：碱金属/碱土金属元素荧光光谱法(fluorometry)：少量无机物、酶活力、激素等后所发射射出的特特征光谱谱来进行行定性及及定量分分析的一一种方法法。(3) 比浊/散射光光谱分析析法：测测定光线线通过溶溶液混悬悬颗粒后后的光吸收收或光散散射程度度的一类类定量方方法。比浊法(turrbiddimeetryy)：在在光源的的光路方方向上测测定透射射光强度度(透射光光&散射光光)与入射射光强度度的比值值和胶体体溶液中中质点浓浓度间的的关系。散射测浊浊法(nnephheloomettry)：在光光路的垂垂直方向向上测量量散射光光强度和和胶体溶溶液中质质点间的的关系。5. 特点：灵敏度度高；测测定简便便、快速速；试样样不被破坏等。II. 可见、紫紫外分光光光度法法1. 定义：根根据物质质分子对对于2000nmm7000nmm光区电磁辐射射的吸收收特性进进行分析析的方法法。 可见见光：44007000nm,有色物物质溶液液 紫外外光：22004000nm,无色物物质2. 特点：灵灵敏度高高(100-4110-77g/mml); 选择择性强；精确度和和准确度度高； 仪器器设备简简单，操操作易掌掌握3. 吸收光谱谱(1) 光谱的产产生：化化合物分分子的价价电子跃跃迁(2) 吸收光谱谱曲线：电子跃跃迁的吸吸收波长长和吸收收强度可可用仪器器测定，在在可见、紫紫外光区区内绘制制或扫描描得到一一条以波波长(l)为横坐坐标,吸吸光度(A)为为纵坐标标的吸收收曲线。4. 光吸收的的基本定定律(LLambber-Beeerss Laaw)(1) 定律：单色光光通过吸吸光溶液液后，吸吸光度与与浓度或或厚度之之间呈正正比关系系。Lambber定定律：说说明吸收收与厚度度间的关关系Beerr定律：说明吸吸收与浓浓度间的的关系(2)表表达式：-lgIIt/Io=a×b×c*¼¼It/Io为透光光率(ttrannsmiittaancee, TT) (%)ß A=-lggT= a×b×c*¼¼A为吸光光度(aaborrbannce) *aa为吸光光系数(abssorpptivvityy),即即吸光物物质在单单位浓度度及单位位厚度时时的吸光光度。 bb为液层层厚度c为溶液液浓度(conncenntraatioon)5. 比色法(colloriimettry)(1) 定义：用用可见光光作光源源，比较较溶液的的颜色深深浅度以以测定所所含有色色物质浓浓度的方方法(2) 所用仪器器：分光光光度计计(sppecttropphottomeeterr)(i)基本原原理：溶溶液中的的物质在在光的照照射激发发下，产产生了对对光吸收收的效应应，物质质对光的的吸收是是具有选选择性的的。各种种不同的的物质都都具有其其各自的的吸收光光谱，故故当某单单色光通通过溶液液时，其其能量就就会被吸吸收而减减弱，光光能量减减弱的程程度和物物质的浓浓度有一一定的比比例关系系。(ii)结构组组成(以以7222分光光光度计为为例)光源：可可见光区区的光源源为钨灯灯，波长长范围是是320010000nnm。(紫外光光区的光光源为氢氢灯或氘氘灯，波波长是22003200nm)单色器：一种将将光源产产生的混混合光分分解为单单一波长长的光学学系统。一一般是根根据通过过棱镜的的折射或或光栅的的衍射而而获得的的。试样室：由比色色皿座架架及光门门组成。 可可见光区区用光学学玻璃比比色皿(紫外光光区用石石英比色色皿)光电管暗暗盒：由由光电管管(可将光光能转变变为可以以放大检检测和记记录的电电能)和微电电流放大大器组成成。显示器：由放大大器和读读数元件件组成。(3) 比色法的的定量方方法：(i)标准曲曲线法：将一系系列浓度度不同的的标准溶溶液按照照一定操操作过程程显色后后，分别别测吸光光度(AA)，以以A为纵坐坐标，浓浓度为横横坐标制制标准曲曲线(至少要要5点)。在相相同条件件下处理理待测物物质并测测定其吸吸光度，即即可从标标准曲线线找出相相对应的的浓度。(ii) 对比法：将标准准品与待待测样品品在相同同条件下下显色并并测定各各自的吸吸光度。由由于测定定体系温温度、厚厚度及入入射光波波长一致致，故标标准与待待测样品品a&bb值相等等，可用用下式比比较计算算待测样样品浓度度Cx=Cs´As/AxIII.实验内内容1.可见光光分光光光度计波波长校正正(1) 原理：镨镨钕玻璃璃是一种种含有金金属镨与与钕的玻玻璃制品品，在可可见光波波长范围围内，它它具有特特征性的的吸收光光谱，吸吸收峰的的波长固固定，可可作校对对仪器波波长正确确性的依依据。(2) 操作：用用镨钕玻玻璃与空空白光路路作对照照，作出出波长从从51225441nmm的镨钕钕玻璃吸吸收曲线线，以横横坐标为为波长，纵纵坐标为为吸光度度，每隔隔2nmm作一个个点，查查找5229nmm处是否否有一个个吸收峰峰的极值值，若这这个吸收收峰的极极值相对对应的波波长大于于5299nm，则则反时针针方向调调节波长长调节螺螺杆，使使这个极极值相对对应地靠靠近5229nmm，一直直调到波波长误差差在允许许范围内内(5229±2nnm);反之，吸吸收峰极极值相对对应的波波长小于于5299nm，则则顺时针针方向调调节螺杆杆。2红红蛋白及及衍生物物吸收光光谱测定定(见书)H分光光度度计的使使用1开开电源开开关，打打开箱盖盖，预热热10mminss2将将空白管管、对照照管、测测定管分分别装入入比色皿皿(3/44voll),并并用吸水水纸擦干干光面外外壁。3选选定波长长4打打开箱盖盖(光路开开关自动动关闭)，用空空白管调调T=05盖上上箱盖(光路开开关自动动打开)，再用用空白管管调T=1000%(若调不不到，则则可调节节灵敏度度开关)6将将选择开开关旋至至A,此时时显示数数值应为为0，否否 则则调节“消光零零”旋钮调调至0。7逐逐步拉出出试样架架拉手，读读取各管管吸光度度值A。8全全部测定定结束后后，取出出比色皿皿(洗净)，关闭闭开关。二、电泳泳技术电泳 Eleectrrophhoreesiss一、定义义电泳带电粒粒子在直直流电场场中向着着电性相相反电极极移动的的现象。电泳分析析技术利用电电泳现象象进行物物质分离离的技术术。二、电泳泳分析技技术发展展概况18099年俄国国物理学学家首次发发现电泳泳现象。他他在湿粘粘土中插插上带玻玻璃管的的正负两两个电极极，加电电压后发发现正极极玻璃管管中原有有的水层层变混浊浊，即带带负电荷荷的粘土土颗粒向向正极移移动，这这就是电电泳现象象。  19009年MMichhaellis首首次将胶胶体离子子在电场场中的移移动称为为电泳。他他用不同同pH的的溶液在在U形管管中测定定了转化化酶和过过氧化氢氢酶的电电泳移动动和等电电点。   19937年年瑞典UUppssalaa大学的的Tisseliius对对电泳仪仪器作了了改进，创创造了TTiseeliuus电泳泳仪，建建立了研研究蛋白白质的移移动界面面电泳方方法，并并首次证证明了血血清是由由白蛋白白及、球蛋白白组成的的，由于于Tisseliius在在电泳技技术方面面作出的的开拓性性贡献而而获得了了19448年的的诺贝尔尔化学奖奖。  19448年WWiellandd和Fiischher重重新发展展了以滤滤纸作为为支持介介质的电电泳方法法，对氨氨基酸的的分离进进行过研研究。   从本本世纪550年代代起，特特别是119500年Duurruum用纸纸电泳进进行了各各种蛋白白质的分分离以后后，开创创了利用用各种固固体物质质（如各各种滤纸纸、醋酸酸纤维素素薄膜、琼琼脂凝胶胶、淀粉粉凝胶等等）作为为支持介介质的区区带电泳泳方法。  1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“LastCheck”。  由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。三、电泳分析技术的分类1.根据据被分离离样品的的量多少少分析电泳泳制备电泳泳2.根据据电泳电电压的高高低常压电泳泳 05000 V高压电泳泳 500030000V3.根据据电泳中中是否使使用支持持物自由电泳泳不使用用支持物物，在溶溶液中进进行。区带电泳泳使用支支持物(1) 按支持持物的物物理性状状不同，可可分为滤纸及及其他纤纤维薄膜膜电泳，如如醋酸纤纤维素、玻玻璃纤维维、聚氯氯乙烯纤纤维凝胶电电泳，如如琼脂、琼琼脂糖、硅硅胶、淀淀粉胶、聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳粉末电电泳，如如纤维素素粉、淀淀粉、玻玻璃粉电电泳丝状电电泳，如如尼龙丝丝、人造造丝电泳泳(2)按按支持物物的装置置形式不不同，可可分为平板式式电泳 垂直直板式电电泳垂直柱柱式电泳泳4.根据据电泳系系统pHH是否连连续§ 连续pHH电泳指电泳泳过程中中pH保持持不变，如如滤纸电电泳、醋醋纤膜电电泳§ 不连续ppH电泳泳指电极极缓冲液液和电泳泳支持物物的不同同区段也也有不同同的pHH，如 PAGGE、IFEE优点是在在不同 pH区区之间形形成高的的电位梯梯度区，使使蛋白质质移动加加速压缩缩为一极极狭的区区带而达达到浓缩缩的目的的。电泳技术术的特点点:§ 凡是带电电物质均均可应用用某一电电泳技术术进行分分离,并可进进行定性性或定量量分析;§ 样品用量量极少;§ 设备简单单;§ 可在常温温进行;§ 操作简便便省时;§ 分辨率高高.电泳技术术应用§ 基础理论论研究;§ 临床诊断断;§ 工业制造造.双向凝胶胶电泳和和质谱技技术的建建立和联联用,提供了了蛋白质质组研究究所需的的技术体体系,使得蛋蛋白质组组的研究究成为可可能.四、电泳泳的基本本原理§ 一个质点点，如能能解离或或能吸附附带电质质点，在在电场中中便会向向正极或或负极移移动。§ 电泳是指指带电颗颗粒在电电场的作作用下发发生迁移移的过程程。许多多重要的的生物分分子，如如氨基酸酸、多肽肽、蛋白白质、核核苷酸、核核酸等都都具有可可电离基基团，它它们在某某个特定定的pHH值下可可以带正正电或负负电，在在电场的的作用下下，这些些带电分分子会向向着与其其所带电电荷极性性相反的的电极方方向移动动。电泳泳技术就就是利用用在电场场的作用用下，由由于待分分离样品品中各种种分子带带电性质质以及分分子本身身大小、形形状等性性质的差差异，使使带电分分子产生生不同的的迁移速速度，从从而对样样品进行行分离、鉴鉴定或提提纯的技技术。  为了了更好的的了解带带电分子子在电泳泳过程中中是如何何被分离离的，下下面简单单介绍一一下电泳泳的基本本原理。在在两个平平行电极极上加一一定的电电压（VV），就就会在电电极中间间产生电电场强度度（E），LL是电极极间距离离。  在稀溶溶液中，电电场对带带电分子子的作用用力（FF），等等于所带带净电荷荷与电场场强度的的乘积。  这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F的大小服从Stokes定律，即：                 F=6r  式中r是球状分子的半径，是缓冲液粘度，是电泳速度(= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s)。当带电分子匀速移动时： F = F，                qE = 6r  由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。迁移率（Mobility)带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q M=-= - E 6prh五、影响响电泳速速度的因因素1.电场场强度（E） E电流流热效效应支持介介质上的的水分蒸蒸发样品的的热变性性 E电泳泳速度慢慢延长电电泳时间间样品扩扩散区带模模糊不清清分辨率率下降  电场场强度（VV/cmm）是每每厘米的的电位降降，也称称电位梯梯度。电电场强度度越大，电电泳速度度越快。但但增大电电场强度度会引起起通过介介质的电电流强度度增大，而而造成电电泳过程程产生的的热量增增大。电电流在介介质中所所做的功功（W）为为：                  W=II2.RR.t   上式式中：II为电流流强度，RR为电阻阻，t为为电泳时时间。   电流流所作的的功绝大大部分都都转换为为热，因因而引起起介质温温度升高高，这会会造成很很多影响响：  样品和和缓冲离离子扩散散速度增增加，引引起样品品分离带带的加宽宽；产生对对流，引引起待分分离物的的混合；如果样样品对热热敏感，会会引起蛋蛋白变性性；引起介介质粘度度降低、电电阻下降降等等。电电泳中产产生的热热通常是是由中心心向外周周散发的的，所以以介质中中心温度度一般要要高于外外周，尤尤其是管管状电泳泳，由此此引起中中央部分分介质相相对于外外周部分分粘度下下降，摩摩擦系数数减小，电电泳迁移移速度增增大，由由于中央央部分的的电泳速速度比边边缘快，所所以电泳泳分离带带通常呈呈弓型。降降低电流流强度，可可以减小小生热，但但会延长长电泳时时间，引引起待分分离生物物大分子子扩散的的增加而而影响分分离效果果。所以以电泳实实验中要要选择适适当的电电场强度度，同时时可以适适当冷却却降低温温度以获获得较好好的分离离效果。2.离子强度（I）溶液的II 越高高，质点点的泳动动速度越越慢，但但区带分分离度却却较清晰晰。 I缓冲冲能力越越大缓冲液液所载的的分电流流增加，而而样品所所载的电电流相应应减少电泳速速度减慢慢缓冲液的的浓度可可用摩尔尔或离子子强度表表示.离子强强度低,电泳速速度快,分离区区带不易易清晰,如果过过低,缓冲液液的缓冲冲量小,难以维维持pHH值的恒恒定;离子强强度高,电泳速速度慢,但区带带分离清清晰,如果过过高,除了使使得电泳泳速度过过慢,还会因因为离子子强度增增加使电电泳时的的电流变变大,增加热热量的产产生,引起温温度改变变,对电泳泳不利。一一般0.020.22M之间间。3.缓冲冲液的ppH pH值值决定了了化合物物解离的的程度，也也决定了了质点所所带的净净电荷。  缓冲冲液的ppH值会会影响待待分离生生物大分分子的解解离程度度，从而而对其带带电性质质产生影影响，溶溶液pHH值距离离其等电电点愈远远，其所所带净电电荷量就就越大，电电泳的速速度也就就越大，尤尤其对于于蛋白质质等两性性分子，缓缓冲液ppH还会会影响到到其电泳泳方向，当当缓冲液液pH大大于蛋白白质分子子的等电电点，蛋蛋白质分分子带负负电荷，其其电泳的的方向是是指向正正极。为为了保持持电泳过过程中待待分离生生物大分分子的电电荷以及及缓冲液液pH值值的稳定定性，缓缓冲液通通常要保保持一定定的离子子强度，一一般在00.0220.2，离离子强度度过低，则则缓冲能能力差，但但如果离离子强度度过高，会会在待分分离分子子周围形形成较强强的带相相反电荷荷的离子子扩散层层（即离离子氛），由由于离子子氛与待待分离分分子的移移动方向向相反，它它们之间间产生了了静电引引力，因因而引起起电泳速速度降低低。另外外缓冲液液的粘度度也会对对电泳速速度产生生影响。4.电渗渗（ellecttro-osmmosiis）指在在电场作作用下液液体相对对于固体体支持物物的相对对移动。由于支持持介质表表面可能能会存在在一些带带电基团团，如滤滤纸表面面通常有有一些羧羧基，琼琼脂可能能会含有有一些硫硫酸基，而而玻璃表表面通常常有Sii-OHH基团等等等。这这些基团团电离后后会使支支持介质质表面带带电，吸吸附一些些带相反反电荷的的离子，在在电场的的作用下下向电极极方向移移动，形形成介质质表面溶溶液的流流动，这这种现象象就是电电渗。在在pH值值高于33时，玻玻璃表面面带负电电，吸附附溶液中中的正电电离子，引引起玻璃璃表面附附近溶液液层带正正电，在在电场的的作用下下，向负负极迁移移，带动动电极液液产生向向负极的的电渗流流。如果果电渗方方向与待待分离分分子电泳泳方向相相同，则则加快电电泳速度度；如果果相反，则则降低电电泳速度度。5.分子筛筛在凝胶电电泳中，分分离蛋白白质等物物质除了了利用所所带电荷荷的差异异的效应应外，还还利用了了其分子子量的不不同及形形状不同同。5.温度度电泳时电电流通过过支持介介质会产产生热量量，按焦焦耳定律律，电流流通过导导体时的的产热与与电流强强度的平平方、导导体的电电阻和通通电的时时间成正正比（QQ=I22Rt）产热可促促使支持持介质上上溶剂的的蒸发，而而影响缓缓冲溶液液的离子子强度。温温度升高高时，介介质黏度度下降，分分子运动动加剧，引引起自由由扩散变变快，迁迁移增加加。温度度每升高高1度，迁迁移率约约增加22.4%。若温温度过高高可导致致分离样样品变性性而使电电泳失败败。醋酸纤维维薄膜电泳Celllullosee accetaate memmbraane eleectrrophhoreesiss，CAMME一、醋酸酸纤维素素是纤维素素醋酸酯酯，由纤纤维素的的羟基进进行乙酰酰化后制制得，将将它溶于于有机溶溶剂涂抹抹成均匀匀的薄膜膜，待有有机溶剂剂挥发后后，即为为白色不不透明的的醋酸纤纤维薄膜膜。厚度：00.155mm 二、特点点1.吸附附作用小小2.电渗渗作用小小3. 需需加样量量少4. 吸吸水性差差三、影响响醋纤电电泳结果果的因素素1.  电泳图图谱不齐齐 点样样时血清清点加不不均匀 薄膜膜局部干干燥电泳时时供给薄薄膜的液液量不均均匀或过过少缓冲液液变质电泳时时薄膜位位置不正正,与电流流方向不不平行2. 电电泳图谱谱分离不不清标本加加量过多多 电流流过低薄膜结结构过分分致密，透透水性差差 薄膜膜表面干干燥3.  电泳速速度慢电流过过低供给薄薄膜的液液量不足足电泳时时温度过过低缓冲液液离子强强度过高高薄膜中中杂质多多4.  白蛋白白区带中中间部分分不着色色，染色色不足可能为染染料使用用过久或或加血清清过多5.球球蛋白向向反方向向移动主要因为为电渗现现象可升高缓缓冲液液液面或加加大电流流量加以以改进，并并注意两两侧电泳泳槽内缓缓冲液液液面是否否在同一一水平。血清蛋白白质醋酸酸纤维薄薄膜电泳泳（实验验）原理 CAAME是是以醋纤纤膜（CCAM）作作支持物物的一种种区带电电泳技术术。 将将血清样样品点样样于醋纤纤膜上，在在pH88.6的的缓冲液液中电泳泳时，血血清蛋白白质均带带负电荷荷移向正正极。由由于血清清中各蛋蛋白组分分等点电电不同而而致表面面净电荷荷量不等等，加之之分子大大小和形形状各异异，因而而电泳迁迁移率不不同，彼彼此得以以分离。 电电泳后,CAMM经染色色和漂洗洗，可清清晰呈现现5条区区带。再再经脱色色，比色色即可计计算出血血清各蛋蛋白组分分的相对对百分数数。器材和和试剂1.器材材（1）醋醋酸纤维维薄膜（88×2mmm）（2）点点样器（3） 染色皿皿，漂洗洗器，镊镊子（4） 7222型分光光光度计计（5）电电泳仪：直流电电源整流流器，水水平电泳泳槽2.试剂剂（1）巴巴比妥缓缓冲液（ppH8.6 II=0.06）（2）氨氨基黑110B染染色液（3）漂漂洗液：95%乙醇、冰冰醋酸、HH2O（4）洗洗脱液：0.44moll/L NaOOH操作1.将电电泳槽置置于水平平平台上上。将缓缓冲液注注入电泳泳槽中两两边的电电极槽缓缓冲液的的高度要要在同一一点平面面上。2.在醋醋纤膜一一端欲点点样处作作好标记记，然后后将薄膜膜放进缓缓冲液中中，湿润润速度按按膜吸收收缓冲液液的快慢慢而定，应应让其自自然浸润润。3将充充分浸透透（指膜膜上没有有白色斑斑痕）的的薄膜取取出，用用滤纸吸吸去膜上上过多的的缓冲液液。4用加加样器蘸蘸取血清清（约55ul）,垂直印印在CAAM粗糙糙面上，待待样品全全部渗入入薄膜内内后，移移开点样样器。5电泳泳（1）加加样后，将将薄膜条条架于支支架两端端，无光光泽朝下下（点样样面），点点样侧置置于阴极极端，膜膜两侧分分别塔上上纱布，纱纱布一端端垂入缓缓冲液中中。薄膜膜应位正正，平直直无弯曲曲，加上上槽盖平平衡5分分钟后通通电电泳泳。（2）正正确连接接电泳槽槽与整流流器对应应的正负负极。开开启电源源通电。电电压10015VV/cmm膜总宽宽。电泳泳4060分分钟，泳泳动距离离约达33.54cmm时即可可断电。6.染色色 电泳泳完毕后后断电，用用镊子取取出薄膜膜条投入入染液5510分分钟，染染色过程程中不时时轻轻晃晃动染色色皿，使使染色充充分。7漂洗洗 从染染液中取取出薄膜膜条并尽尽量沥去去染液，投投入漂洗洗皿中反反复漂洗洗，直至至背景漂漂尽为止止。此时时清晰可可见5条条色带，待待干。 8.定量量（1）洗洗脱比色色：将各各蛋白质质区带仔仔细剪下下，分置置各试管管中，另另从空白白背景剪剪块平均均大小的的膜条置置于空白白管中。各各管加入入0.44moll/l NaOOH 44ml,于377水浴220分钟钟（不时时振荡），待待颜色脱脱净即用用波长6620nnm比色色，以空空白管调调零读取取各管吸吸光度。（2）计计算 吸光光度总和和（T） =A+1+2+（吸光光度）血清蛋白白组分的的相对百百分数：A%=AA/T××1000% 1%=1/TT×1000% 2%=2/TT×1000%=/T×1000% %=/T×1000%琼 脂 糖 凝凝 胶 电 泳泳 Agaarosse GGel Eleectrrophhoreesiss概述凝胶电泳泳：由琼琼脂、琼琼脂糖、淀淀粉胶及及聚丙烯烯酰胺等等物质作作支持体体的电泳泳。琼脂糖是是从琼脂脂中提纯纯出来的的，主要要是由DD半乳乳糖和33,6脱脱水L半乳糖糖连接而而成的一一种线性性多糖。琼琼脂糖凝凝胶的制制作是将将干的琼琼脂糖悬悬浮于缓缓冲液中中，通常常使用的的浓度是是13，加加热煮沸沸至溶液液变为澄澄清，注注入模板板后室温温下冷却却凝聚即即成琼脂脂糖凝胶胶。琼脂脂糖之间间以分子子内和分分子间氢氢键形成成较为稳稳定的交交联结构构，这种种交联的的结构使使琼脂糖糖凝胶有有较好的的抗对流流性质。琼琼脂糖凝凝胶的孔孔径可以以通过琼琼脂糖的的最初浓浓度来控控制，低低浓度的的琼脂糖糖形成较较大的孔孔径，而而高浓度度的琼脂脂糖形成成较小的的孔径。特点：1.可以以制成非非常均匀匀的凝胶胶，带电电质点在在凝胶的的孔中泳泳动。2. 电电泳操作作方法简简便，电电泳速度度快3. 分分辨率高高，重复复性好，电电泳图谱谱清晰。4. 适适用于生生化，免免疫等定定性定量量测定琼脂糖凝凝胶的特特点（一）优优点1.因不不含硫酸酸根和羧羧基，几几乎消除除了琼脂脂的电渗渗2.对蛋蛋白质吸吸附极微微，故无无拖尾现现象。3.凝胶胶结构均均匀，孔孔径较大大，可用用来分离离酶的复复合物、核核酸、病病毒 等等大分子子物质。4.透明明度较好好，可直直接或干干燥成薄薄膜后进进行染色色。5.不吸吸收紫外外光，可可直接利利用紫外外光吸收收法作定定量测定定6.有热热可逆性性（二）缺缺点1.机械械强度差差，易破破碎，浓浓度不能能太低。2.易被被细菌污污染，不不易保存存，临用用前配制制。3.琼脂脂糖支持持层上的的区带易易于扩散散，电泳泳后必须须立即固固定染色色。4.与PPAGEE相比，分分子筛作作用小，区区带少。 应 用1. 适适用于大大分子的的核酸、核核蛋白等等的分离离、鉴定定及纯化化2. 临临床生化化检验中中常用于于LDHH、CK等同同工酶的的分离与与检测3. 为为不同类类型的高高脂蛋白白血症、冠冠心病等等提供生生化指标标脂蛋白血清脂蛋蛋白(llipooprooteiin)的的组成 AApoAA AApoBB蛋白质：即载脂脂蛋白 AApoCC AppoD ApooE甘油三酯酯（TG）脂类 磷磷脂（PL）游离胆固固醇（FC）胆固醇酯酯（CE）少量糖（二）分分类1. 按按电泳法法分   乳乳糜微粒粒（chhyloomiccronn,CMM）    b-脂蛋白白（b-位）    前b-脂蛋白白（a2-位）a-脂蛋蛋白（a1-位）2. 按按超速离离心法分分乳糜微粒粒(chhyloomiccronn,CMM) ( < 0.996 )极低密度度脂蛋白白 (00.9661.0006) (veery loww deensiity lippoprroteein, VLLDL)中间密度度脂蛋白白 (11.00061.0019)(inttermmediiatee deensiity lippoprroteein, IDDL)  低低密度脂脂蛋白LLDL(1.00191.0063)(loww deensiity lippoprroteein, LDDL)高密度脂脂蛋白HHDL(1.00631.221)(higgh ddenssityy liipopprotteinn, HHDL)§ 原理：ppH 88.6 > ppI ，各各种脂蛋蛋白均带带负电，电电泳时由由负极到到正极；VLDDL为圆圆形，受受阻力小小，LDDL形态态不规则则，受阻阻力大，所所以VLLDL跑跑在前。血清脂蛋蛋白琼脂脂糖凝胶胶电泳（实实验）原理 血血清脂蛋蛋白经饱饱和乙酰酰苏丹黑黑B染色后后，以琼琼脂糖凝凝胶为载载体，在在pH88.6巴巴比妥缓缓冲液中中电泳分分离，各各种脂蛋蛋白将分分成不同同区带。器材1.玻片片2.水平平式电泳泳仪试剂 1.00.5%琼脂糖糖（Aggaroose）溶溶液：称称取0.5g琼琼脂糖，加加巴比妥妥缓冲液液1000ml，盛盛于三角角烧杯中中，置沸沸水浴中中煮沸溶溶解，备备用。2.新鲜鲜血清（无无溶血）3.pHH8.66、I=0.0075 巴比妥妥缓冲液液:称取155.4gg巴比妥妥钠，22.766g巴比比妥，00.2992gEEDTAA，以水水溶解后后加至1100mml，调调pH至8.66，4保存。4.苏丹丹黑B染色液液：苏丹丹黑B 1000mg，异异丙醇110mll，混合合。置337水浴使使之充分分溶解后后，离心心取上清清液置室室温备用用。操作1. 制制板 配制00.5%的琼脂脂糖或预预先配好好置4冰箱，用用时置沸沸水溶解解，再冷冷却到550600，取约44ml琼琼脂糖迅迅速铺在在玻璃片片上，然然后放上上开槽器器（注意意：开槽放放在中央央，距一一侧1.5cmm处；避免产产生气泡泡），静静置室温温待凝固固，把开开槽器小小心取下下，样品品槽即制制成。2. 加加样 取预染染血清220ml加入样样品槽 （预染染血清：血清00.2mml + 苏丹丹黑B染色液液0.002mll）3. 电电泳 将载有有琼脂糖糖凝胶玻玻片（已已加血清清样品）放放在电泳泳槽中，槽槽内倒入入巴比妥妥缓冲液液，用四四层纱布布搭板，加加样端接接负极，电电压1220V，待最最前端区区带泳动动至玻片片2/33处时可可终止电电泳，观观察实验验结果。参考值值 正常人人血清脂脂蛋白可可分出三三条区带带：b脂蛋白（占占55%，着色色最深） 前b脂蛋蛋白（占占15%，着色色最浅）a脂蛋白（占占3040%，着色色居中） 在原点点处应无无乳糜微微粒可见见聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳PPolyyacrrylaamidde GGel Eleectrrophhoreesiss ，PAGGE一、PAAG 的的 组成成PAG是是由丙烯烯酰胺（aacryylammidee，Accr）单单体和NN，N-亚甲甲双丙烯烯酰胺（NN，N，NN，N-meethyylenne bbixaacryylammidee，Biis）交交联剂通通过自由由基聚合合而成的的一种多多孔三维维网状结结构。Acr + BBis-® 多孔孔三维网网状结构构 l （1）丙丙烯酰胺胺结构式式（2）亚亚甲双丙丙烯酰胺胺二、PAAG 的的 聚 合需要催化化剂氧化还还原系统统作用，使使Acrr单体带带有游离离基，从从而与BBis进进行聚合合。 （一）化化学聚合合：APP-TEEMEDD系统 过硫酸胺胺(NNH4)2S22O8（Ammmonniumm peersuulfaate，AAP）作作为催化化剂，四四甲基乙乙二胺（TTEMEED）为为加速剂剂。 AP在水水溶液中中能产生生游离基基SO442-，使使丙烯酰酰胺单体体的双键键打开，活活化形成成自由基基丙烯酰酰胺，然然后游离离Acrr和Biis作用用就能聚聚合形成成凝胶。TEMEED的游游离碱基基能促进进AP的的形成SSO422- 。注意： ¬TEMMED量量多少都都会影响响催化作作用，须须在碱性性条件下下聚合­分子氧氧存在，聚聚合不完完全，须须去除分分子氧，隔隔绝氧®升高温温度能提提高聚合合，降低低温度能能延迟聚聚合（二）光光聚合：核黄素素-TEEMEDD系统核黄素（rribooflaavinn）在光光照下（可可见光或或紫外光光）分解解，其黄黄素部分分被还原原成无色色型，但但在有氧氧条件下下无色型型又被氧氧化成带带有游离离基的黄黄素，其其也能使使Acrr和Biis聚合合形成凝凝胶。注意：分离胶的的合成一一般采用用化学聚聚合。因因为若用用光聚合合，凝胶胶的孔径径受光照照强度与与时间的的影响，导导致孔径径大小不不同，从从而影响响蛋白质质的分离离。三、PAAG的浓浓度与孔孔径的关关系PAG孔孔径的大大小主要要由Accr和BBis这这两种单单体的浓浓度决定定。可以以根据要要分离