第二章 微生物菌种选育(笔记类)bqiq.docx

第二章        工业微微生物基基础知识要要点和教教学要求求1）、了了解微生生物的特特点2）、了了解常见见的工业业微生物物3）、掌掌握工业业微生物物菌种的的分离和和选育4）、掌掌握工业业微生物物菌种的的改良5）、掌掌握工业业微生物物菌种的的保藏6）、掌掌握工业业微生物物菌种的的扩大培培养能力培培养要求求通过本章章节的学学习，学学生能掌掌握工业业微生物物菌种的的分离和和选育、改改良和保保藏方法法，以及及菌种扩扩大培养养的基本本工艺。教案内内容2.1微微生物的的特点（1）种种类多，分分布广目前已发发现的微微生物在在10万种种以上。不不同种类类的微生生物具有有不同的的代谢方方式，能能分解各各式各样样的有机机物质和和无机物物质，当当前国内内外积极极利用微微生物来来防治公公害，分分解三废废中许多多毒性强强、结构构复杂的的物质。另另一方面面，不同同微生物物在生化化过程中中积累不不同的代代谢产物物，所以以发酵工工业上常常利用各各种微生生物来生生产各种种产品，如如酒类、酒酒精、丙丙酮丁醇醇、抗生生素、酶酶制剂、有有机酸、氨氨基酸、核核酸、维维生素、菌菌体蛋白白、医药药产品和和化工产产品等到到。（2）高高面积-体积比比，代谢谢能力强强（3）生生长迅速速，繁殖殖快（4）适适应性强强，容易易培养（5）易易变性   2.2常常见的工工业微生生物    广义的的微生物物包括病病毒、立立克次氏氏体、细细菌、放放线菌、酵酵母菌、霉霉菌、单单细胞藻藻类、原原生动物物和支原原体等。在在发酵工工业中经经常遇到到的是细细菌、放放线菌、酵酵母菌、霉霉菌及危危害、放放线菌生生长的噬噬菌体。微生物工工业的范范围微生物工工业越来来越深地地同国民民经济各各部门发发生关系系，涉及及的范围围十分广广泛，而而且越来来越大，大大致可分分为下列列14类：（1）酿酿酒工业业（啤酒酒、葡萄萄酒、白白酒等）（2）食食品工业业（酱、酱酱油、食食醋、腐腐乳、面面包、酸酸乳等）（3）有有机溶剂剂发酵工工业（酒酒精、丙丙酮、丁丁醇等）（4）抗抗生素发发酵工业业（青霉霉素、链链霉素、土土霉素等等）（5）酶酶制剂发发酵工业业（柠檬檬酸、葡葡萄糖酸酸等）（6）酶酶制剂发发酵工业业（淀粉粉酶、蛋蛋白酶等等）（7）氨氨基酸发发酵工业业（谷氨氨酸、赖赖氨酸等等）（8）核核苷酸类类物质发发酵工业业肌苷酸酸、肌苷苷等）（9）维维生素发发酵工业业（维生生素B22、维生生素B112等）（10）生生理活性性物质发发酵工业业（激素素、赤霉霉素等）（11）微微生物菌菌体蛋白白发酵工工业（酵酵母、单单细胞蛋蛋白等）（12）微微生物环环境净化化工业（利利用微生生物处理理废水、污污水等）（13） 生物能能工业（沼沼气、纤纤维素等等天然原原料发酵酵生产酒酒精、乙乙烯等能能源物质质）（14）微微生物冶冶金工业业（利用用微生物物探矿、冶冶金、石石油脱硫硫等） 2.33工业微微生物菌菌种的分分离和选选育    2.3.1微生生物菌种种的分离离从自然界界分离新新菌种一一般包括括以下几几个步骤骤；采样样、增殖殖培养、纯纯种分离离和性能能测定等等几个步步骤。1.采样样：采样样地点的的确定要要根据筛筛选的目目的、微微生物的的分布概概况及菌菌种的主主要特征征与外界界环境关关系等，进进行综合合、具体体地分析析来决定定。如果果预先不不了解某某种生产产菌的具具体来源源，一般般可从土土壤中分分离。采土方法法多在选选好地点点后，用用小铲去去除表土土，取离离地面55-155cm处处的土壤壤几十克克，盛入入预先消消毒好的的牛皮纸纸袋或塑塑料袋中中，扎好好，记录录采样时时间、地地点、环环境情况况等，以以备查考考。一般般土壤中中芽孢杆杆菌、放放线菌和和霉素的的孢子2.增殖殖培养：收集到到的样品品，如含含所需菌菌种较多多，可直直接进行行分离。如如果样品品含所需需菌种很很少，就就要设法法增加该该菌的数数量，进进行增殖殖（富集集）。所所谓增殖殖培养就就是给混混合菌群群提供一一些有利利于所需需菌株生生长或不不利于其其他菌型型生长的的条件以以促使所所需菌株株大量繁繁殖，从从而有利利于分离离它们。例例如筛选选纤维素素酶产生生菌时，以以纤维素素作为唯唯一碳源源进行增增殖培养养，使得得不能分分解纤维维素的菌菌不能生生长；筛筛选脂肪肪酶产生生菌时，以以植物油油作为唯唯一碳源源进行增增殖培养养，能更更快更准准确地将将脂肪酶酶产生菌菌分离出出来。3.纯种种分离：通过增增殖培养养还不能能得到微微生物的的纯种，生生产菌在在自然条条件下通通常是与与各种菌菌混杂在在一起的的，所以以有必要要进行分分离纯化化，才能能获得纯纯种。分分离方法法很多，常常用的有有划线法法和稀释释法。4.生产产性能的的测定：一般采采用两步步法，即即初筛和和复筛，经经过多次次重复筛筛选，直直至获得得者-33株较好好的菌株株，供发发酵条件件的摸索索和生产产试验，进进而作为为育种的的出发菌菌株。2.3.2菌种选选育菌种选育育就是按按照生产产的要求求，根据据微生物物的遗传传和变异异的理论论，用人人工方法法造成菌菌种变异异，再经经过筛选选而达到到菌种选选育的目目的。育育种的目目的，就就是要改改善菌种种的特性性，使能能提高产产量、改改进质量量、降低低成本、改改革工艺艺、方便便管理及及综合利利用等。工工业微生生物育种种的基本本方法的的包括自自然选育育、生产产育种、抗抗噬菌体体菌株的的选育、诱诱变育种种、代谢谢控制育育种及基基因重组组定向育育种等。诱诱变育种种一般采采用物理理、化学学诱变因因素使微微生物DDNA的的碱基排排列发生生变化，以以使排列列错误的的DNAA模板形形成异常常的遗传传信息，造造成某些些蛋白结结构变异异，而使使细胞的的功能发发生改变变。代谢谢控制育育种主要要有两个个方面：一方面面是改变变代谢通通路的育育种，另另一方面面改变代代谢自动动调节系系统的育育种。而而基因重重级的方方法一般般有转化化、转导导及杂交交等。有有关育种种的方法法在微生生物学中中已详细细介绍，这这里不再再赘述。   2.5工工业微生生物菌种种的保藏藏菌种保藏藏的目的的在于使使菌种的的生命得得以延续续并保持持它们原原有的生生物学特特性。在在基础的的研究中，可可保证同同一菌种种在工作作过程及及工作结结束后，均均可获得得重复的的实验结结果。对对于有经经济价值值的生产产菌，良良好的保保藏条件件可保持持其高产产、高抗抗性等优优良的性性能。对对于通过过生物工工程技术术所得的的重组菌菌，则需需保持其其遗传特特性的稳稳定。菌种的保保藏方法法有很多多，但其其基本原原理是大大同不异异的，主主要是根根据微生生物生理理、生化化特点，人人工地创创造条件件，使微微生物处处于代谢谢不活泼泼、生长长繁殖受受抑制的的休眠状状态。这这些人式式造成的的环境主主要是低低温、干干燥、缺缺氧三方方面，使使菌株尽尽可能少少发生突突变，以以达到保保持纯种种的目的的。2.5.1斜面面保藏法法和穿刺刺保藏法法2.5.2 干干燥保藏藏法2.5.3 悬悬液保藏藏法2.5.4 冷冷冻干燥燥保藏法法2.5.5液氨氨保藏法法2.5.6 低低温保藏藏法2.6 工业微微生物菌菌种的扩扩大培养养2.6.1 微微生物的的培养方方法1.表面面培养表面培养养是将纯纯种微生生物接种种在固体体或液体体培养基基的表面面的在恒恒温条件件下进行行静置培培养的方方法。如如实验室室中进行行的固体体斜面培培养、固固体平板板培养都都是表面面培养；进行液液体培养养时，若若细胞在在液面生生长繁殖殖，形成成一层膜膜状物，也也为表面面培养。表表面培养养的特点点是生长长在培养养基表面面上的微微生物既既能与空空气接触触吸收氧氧气，又又能与培培养基接接触吸收收营养。但但是由于于表面培培养近于于自然培培养，因因此存在在生长缓缓慢，占占用面积积大，容容易染菌菌等缺点点，在大大规模工工业生产产中很少少采用，仅仅在实验验室或小小试中用用得较多多。微生物类类别微生物名名称产物用途细菌短杆菌味精、谷谷氨酸食用、医医药肌苷酸枯草杆菌菌淀粉酶酒精浓醪醪发酵、啤啤酒酿造造、葡萄萄糖制造造、糊精精制造、糖糖浆制造造、纺织织品退浆浆、铜板板纸加工工、洗衣衣业、香香料加工工（除去去淀粉）蛋白酶皮革脱毛毛柔化、胶胶卷回收收银、丝丝绸脱胶胶、酱油油速酿、水水解蛋白白、饲料料、明胶胶制造、洗洗衣业梭状杆丙酮、丁丁醇工业有机机溶剂巨大芽孢孢杆菌葡萄糖异异构酶由葡萄糖糖制造果果糖大肠杆菌菌酰胺酶制造新型型青霉素素节杆菌强的松医药蜡状芽孢孢杆菌青霉素酶酶青霉素的的检定、抵抵抗青霉霉素敏感感症酵母菌酒精酵母母酒精工业、医医药酵母甘油医药、军军工假丝酵母母石油及蛋蛋白制工业造造低凝固固点石油油及酵母母菌体蛋蛋白环烷酸工业啤酒酵母母细胞色素素丙医药辅酶甲酵母片凝血质类酵母脂肪酶医药、纺纺织脱腊腊、洗衣衣业阿氏假囊囊酵母核黄素医药脆壁酵母母乳糖酶食品工业业2.固体体培养固体培养养法是将将纯种微微生物接接种在固固体培养养基上。工工业上常常用大米米、麸皮皮、米糠糠、谷壳壳、木屑屑等为基基本原料料，适当当补充一一些其他他营养成成分和水水分，经经灭菌后后制成微微生物培培养基。固固体培养养基的特特点是疏疏松，在在培养基基内部充充满了空空气，因因此既可可以静置置培养，又又可以通通风培养养。固体体培养是是介于表表面培养养和深层层培养之之间的一一种培养养方式，它它的优点点是设备备简单，投投资少，适适合于小小规模生生产。缺缺点是占占地面积积大，劳劳动强度度高，产产品质量量不太稳稳定。   3.液体体深层培培养液体深层层培养又又叫液体体通风培培养，菌菌体在液液体培养养基中处处于悬浮浮状态，导导入培养养基中的的空气通通过气液液界面传传质进入入液相，再再扩散进进入细胞胞内部。液液体深层层培养是是在专门门的发酵酵罐中进进行的。它它的优点点是可以以根据微微生物在在生长过过程中对对碳源、氮氮源、生生长因子子等营养养物质及及温度、PH值、需氧量等条件的不同需要，合理配制，补加各种营养物质和随时调节温度、PH值和通风量，这就有可能把微生物培养过程的生长、代谢都控制在最佳状态而收到最好的培养效果。微生物类类别微生物名名称产物用途霉  菌黑曲霉柠檬酸工业、食食用、医医药柚甙酶桔柑罐头头脱除苦苦味酸性蛋白白酶啤酒防浊浊剂、消消化剂、饲饲料单宁酶分解单宁宁、制造造没食子子酸、酶酶的精制制糖化酶酒表发酵酵工业栖土曲霉霉蛋白酶同上根霉根霉糖化化酶葡萄糖制制造、酒酒精厂糖糖化用  甾体激素素医药土曲霉甲义丁二二酸工业赤霉菌赤霉素农业、植植物生长长激素梨头霉甾体激素素医药青霉菌青霉素医药  葡萄糖氧氧化酶蛋白除去去葡萄糖糖、脱氧氧、食品品罐头贮贮存、医医药灰黄霉菌菌灰黄霉素素医药木霉菌纤维素酶酶淀粉和食食品加工工、饲料料黄曲霉菌菌淀粉酶医药、工工业红曲霉红曲霉糖糖化酶葡萄糖制制造、酒酒精厂糖糖化用放线菌各类放线线菌链霉素医药氯霉素土霉素金霉素红霉素新生霉素素卡那霉素素小单孢菌菌庆大霉素素医药灰色放线线菌蛋白酶同上球孢放线线菌甾体激素素医药 2.7种种子扩大大培养1、种子子扩大培培养的任任务现代的发发酵工业业生产规规模越来来越大，每每只发酵酵罐的容容积有几几十立方方米甚至至几百立立方米，要要使小小小的微生生物在几几十小时时的较短短时间内内，完成成如此巨巨大的发发酵转化化任务，那那就必须须具备数数量巨大大的微生生物细胞胞才行。菌菌种扩大大培养的的目的就就是要为为每次发发酵罐的的投料，提提供相当当数量的的代谢旺旺盛的种种子。因因为发酵酵时间的的长短和和接种量量的大小小有关，接接种量大大，发酵酵时间则则短。将将较多数数量的成成熟菌体体接入发发酵罐中中，就有有利于缩缩短发酵酵时间，提提高发酵酵罐利用用率，并并且也有有利于减减少染菌菌的机会会。因此此，种子子扩大培培养的任任务，不不但要得得到纯而而壮的培培养物，而而且要获获得活力力旺盛的的、接种种数量足足够的培培养物。对对于不同同产品的的发酵过过程来说说，必须须根据菌菌种生长长繁殖速速度快慢慢来决定定种子扩扩大培养养的级数数。抗生生素生产产中，放放线菌的的细胞生生长繁殖殖速度较较慢，常常常用三三级种子子培养，即即将种子子罐中之之菌丝移移植到较较大的种种子罐中中扩大培培养后，再再移入发发酵罐中中，这种种流程称称为三级级发酵。一一般500t发酵酵罐多采采用三级级发酵，有有的甚至至采用四四级发酵酵，如链链霉素生生产。有有些酶制制剂发酵酵生产也也采用三三级发酵酵。而谷谷氨酸及及其他氨氨基酸发发酵所用用的菌种种是细菌菌，生长长繁殖速速度很快快，所以以采用二二级发酵酵。二级发酵酵的流程程如下：斜面菌种种一级种种子摇床床培养二级种子子罐培养养发酵罐罐  2.种子子罐级数数种子罐级级数是指指制备种种子需逐逐级扩大大培养的的次数，一一般根据据种子的的生长特特性、孢孢子发芽芽及菌体体繁殖速速度，以以及发酵酵罐的容容积而定定。对于于生长快快的细菌菌，种子子用量少少，帮种种子罐数数相应也也少。如如谷氨酸酸生产，种种子接入入种子罐罐后于332C培培养7-10hh，菌浓浓达到1108-1099个/mll，即可可接入发发酵罐作作为种子子，这称称为一级级种子罐罐扩大培培养，也也称二级级发酵。生生长较慢慢的菌种种，如青青霉素生生产菌种种，种子子接入一一级种子子罐277C培养养40hh后，再再需移入入装有新新鲜培养养基的第第二级种种子罐，于于27CC培养100-244h移至至发酵罐罐作为种种子，这这称为二二级种子子罐扩大大培养，也也称三级级发酵。一一般500m3发发酵罐都都采用三三级发酵酵。种子罐的的级数越越少，越越有利于于简化工工艺和控控制，并并可减少少由于多多次移种种而带来来染菌的的机会。但但也必须须考虑尽尽量延长长发酵罐罐最终代代谢产物物积累的的时间，缩缩短由于于种子发发芽、生生长而占占用的非非生产时时间，以以提高发发酵罐的的生产率率。  3.   接种龄龄与接种种量接种龄是是指种子子罐中培培养的菌菌丝体开开始移入入下一级级种子罐罐或发酵酵罐时的的培养时时间。通通常接种种龄以菌菌丝处于于生命极极为旺盛盛的对数数生长期期，且培培养液中中菌体尚尚未达到到最高峰峰时较为为合适。对对于年轻轻的种子子接入发发酵罐后后往往会会出现前前期生长长缓慢，整整个发酵酵周期延延长；过过老的种种子会引引起生产产能力下下降而菌菌丝过早早自溶。不不同品种种或同一一品种而而工艺条条件不同同，其接接种龄是是不一样样的，一一般要以以过多次次试验来来确定。接种量是是指移入入的种子子液体积积和接种种后培养养液体积积的比例例。如大大多数抗抗生素发发酵的最最适接种种量为77%-115%，由由棒状杆杆菌进行行谷氨酸酸发酵的的接种量量只需用用%。采用用较大的的接种量量可以缩缩短发酵酵罐中菌菌丝繁殖殖到达高高峰的时时间，但但是，如如果接种种量过多多，往往往使菌丝丝生长过过快，培培养液粘粘度增加加，造成成溶解氧氧供应不不足而影影响产物物的合成成。近年年来，生生产上多多以加大大种子量量及采用用丰富培培养基作作为获得得高产的的的措施施。有的的产品采采用两面面三刀只只种子罐罐接一只只发酵罐罐的双种种法。如如卡那霉霉素采用用双种比比单种的的发酵单单位提高高8%；而而且达到到产量高高峰的时时间提前前。也有有采用倒倒种法，即即以适宜宜的发酵酵液倒出出适量级级另一发发酵罐作作种子。例例如链霉霉素发酵酵中，使使用倒种种法比单单种的发发酵单位位提高112%。14