细胞免疫检测技术.ppt

关于细胞免疫检测技术现在学习的是第1页，共39页v背景知识v免疫检测技术v实验内容课程内容现在学习的是第2页，共39页细胞免疫vCell-mediatedimmunityisanimmuneresponsethatdoesnotinvolveantibodiesbutratherinvolvestheactivationofphagocytes,naturalkillercells(NK),antigen-specificcytotoxicT-lymphocytes,andthereleaseofvariouscytokinesinresponsetoanantigen.v细胞免疫（cellularimmunity）T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。现在学习的是第3页，共39页现在学习的是第4页，共39页检测对象检测对象l免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术流式细胞术）lT细胞亚群（间接免疫荧光法，流式细胞术流式细胞术,免疫磁珠免疫磁珠）l细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR,Elispot）l免疫细胞活性(淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验)现在学习的是第5页，共39页应用范围v1、测定患病个体患病个体的细胞免疫状态与水平，以分析其发病机制；v2、测定动物疫苗疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应v3、筛选免疫增强剂或免疫抑制剂药物药物，或研究化学药物、营养成分以及物理疗法对机体免疫功能的影响v4、在研制细胞因子细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价现在学习的是第6页，共39页T细胞表面受体细胞表面受体v一、T细胞抗原受体v二、细胞因子受体 v三、绵羊红细胞受体v四、有丝分裂原受体现在学习的是第7页，共39页T细胞亚群v辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群（CD4+CD45RA-/CD4+CD45RO+）、功能亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亚群（CD95+）现在学习的是第8页，共39页1.E玫瑰花环形成试验erythocyterosettetestl实验原理：人和动物外周血中T细胞表面有红细胞受体（即CD2分子），在体外能直接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。TTBSRBCCD2检测技术检测技术现在学习的是第9页，共39页左左:（甲紫染色，（甲紫染色，800）：可见）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；淋巴细胞；右右:（吖啶橙染色）：图中可见（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。现在学习的是第10页，共39页lB细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体（A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花环实验和EAC玫瑰花环实验。现在学习的是第11页，共39页2.流式细胞术l定义：流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。l一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。检测技术检测技术现在学习的是第12页，共39页现在学习的是第13页，共39页w将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。现在学习的是第14页，共39页流式细胞术-T细胞亚群l具有CD3抗原的T细胞：外周血成熟的T细胞l具有CD4抗原的T细胞：TH（机体免疫应答的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答，活化的TH细胞可释放IL-2及IFN-r）l具有CD8抗原的T细胞：Tc（在TH辅助下特异性杀伤或溶解靶细胞）现在学习的是第15页，共39页现在学习的是第16页，共39页3.间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原l免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。检测技术检测技术现在学习的是第17页，共39页4.免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法*免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。磁珠磁珠(microbead)标记细胞上的磁珠在扫描电标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到镜下也几乎看不到检测技术检测技术现在学习的是第18页，共39页磁珠分离策略：磁珠分离策略：一一.阳性分选阳性分选磁珠标记目的细胞磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出未标记细胞先行流出移出磁场后收集移出磁场后收集目的细胞目的细胞CD4+T细胞细胞分离柱分离柱CD4-T细胞细胞现在学习的是第19页，共39页磁珠标记非目的细胞磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出目的细胞先行流出二二.阴性分选阴性分选现在学习的是第20页，共39页5.固相酶联免疫斑点技术ELISPOTl细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.检测技术检测技术现在学习的是第21页，共39页与与ELISA的区别的区别l1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。l2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率l3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。l4、捕获抗体不会影响活化细胞分泌细胞因子。现在学习的是第22页，共39页图注：ELISPOT法在检测低频率产生细胞因子的细胞时具有独一无二的敏感性。将指定数目的能产生IFN-的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（AntigenPresentingCells，APC）混合后，使用ELISPOT法（上图）、胞质内染法（中图）和ELISA法（下图）分别测量产生IFN-的细胞的数目。现在学习的是第23页，共39页现在学习的是第24页，共39页6.T淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。检测技术检测技术现在学习的是第25页，共39页l植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；l抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；l美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。现在学习的是第26页，共39页淋巴细胞转化试验方法淋巴细胞转化试验方法 l形态计数法lMTT法l同位素掺入法现在学习的是第27页，共39页形态计数法形态计数法l加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数l细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。现在学习的是第28页，共39页MTT 法法lMTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。lMTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。现在学习的是第29页，共39页同位素法同位素法l3H-TdR掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。l3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。现在学习的是第30页，共39页同位素法优势同位素法优势l3H-TdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以前者更能反映细胞增殖指数。l例，培养10个细胞，3天后A组为17个，B组为13个，此为MTT的结果；3H-TdR的结果则为7：3，A组细胞的增殖是B组的2.3倍。现在学习的是第31页，共39页实验步骤实验步骤l1、鸡脾淋巴细胞悬液制备、鸡脾淋巴细胞悬液制备淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离用用1640培养液配成液配成106细胞细胞/ml现在学习的是第32页，共39页l2、淋巴细胞增殖反应、淋巴细胞增殖反应l将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200L/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA作为对照。置5%CO2，37培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR20L，使其终浓度为（3.7-18.5）104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。l3、数据处理及结果判定、数据处理及结果判定l以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示l实验孔cpmSI=对照孔cpml受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。现在学习的是第33页，共39页原儿茶酸对SPF鸡的免疫刺激试验PoultryScience,2012,91:16041609现在学习的是第34页，共39页淋巴细胞分离液的原理v外周血中各种血细胞的密度不同，其中红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，淋巴细胞为1.0740.001。v主要成分：葡聚糖，泛影葡甲胺，氢氧化钠（1.0770-1.0800克/毫升）用用培养液调成液调成106细胞细胞/ml现在学习的是第35页，共39页鸡外周血淋巴细胞增殖实验1.加液：2.离心：3.计数4.铺板5.检测现在学习的是第36页，共39页现在学习的是第37页，共39页现在学习的是第38页，共39页感谢大家观看现在学习的是第39页，共39页