miRNA与肿瘤研究进展.doc

分子生物学进展综述学 号：单击此处键入毕业论文GRADUATE THESIS论文题目：miRNA与肿瘤的研究进展学生姓名：单击此处键入专业班级：单击此处键入学 院：单击此处键入指导教师：导师姓名 职称副导师姓名 职称XXXX年XX月XX日miRNA与肿瘤的研究进展摘要 微小RNA（miRNA）是一类长约22 nt 的非编码单链RNA，由前体经酶作用而得，它是细胞的内源性物质，普遍存在于动植物中，高度保守。miRNA参与早期胚胎发育、细胞增殖与凋亡、细胞分化、脂肪代谢等一系列重要的生命活动。近几年的许多研究表明miRNA与肿瘤的发生关系密切。本文主要就miRNA简介及其与肿瘤的关系作一简要综述。关键字 miRNA；肿瘤；进展 Research progress of the relationship between miRNA and cancerAbstract MicroRNAs (miRNAs) is a class of non-protein coding single-stranded small molecular RNA with a size of about 22 bases,which is cut by the enzyme from the precursor.It is Highly conserved cell endogenous substances. miRNAs involve tumor cell proliferation,differentiation and apoptosis processes in a role of oncogenes or tumor supressors. In recent years, many studies have shown that the cancer is closely related miRNA . This article is a brief overview of the relationship between miRNA and tumor.Key Words miRNA; tumor; progress1. miRNA简介1.1 miRNA的发现miRNA首次发现于1993年，Lee等 Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14JCell，1993，75(5) ：843-854.在对秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）发育过程的研究中发现一个小分子miRNA: lin-4，它能够通过与lin-14的3UTR相互作用，调节线虫的发育。2000年，Reinhart等 Reinhart BJ，Slack FJ，Basson M，et al . The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans JNature，2000，403(6772) ：901-906.在线虫中发现了第2个miRNA: let-7，通过与lin-47和lin-51的3UTR的结合，控制幼虫向成虫的转变。随后，在线虫（C. elegans 和C.briggsae）、果蝇（Drosophila melanogaster）、Hela 细胞、斑马鱼（Danio rerio）、人类、拟南芥（A rabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）等多种真核模式生物中找到了上百个类似的小分子RNA，并将其称为微小RNA（miRNA，miRNA） Ruvkun G. Molecular biology: Glimp ses of a tiny RNA worldJ. Science,2001, 294: 797-799. Lee R C, Ambro V. An extensive class of small RNAs in Caeno rhabditis elegansJ. Science, 2001, 294: 862-864. Reinhart B J, Weistein E G, Rhoades M W, et al. MicroRNAs in plants J. Genes and Dev, 2002, 16: 1616-1626.。目前已在各物种中共发现8000多个miRNA。1.2 miRNA的生物合成图 1 miRNA的生物合成miRNA是广泛存在于真核生物体内的RNAs，是一类非编码的长度约为18-25nt的单链RNAs。编码miRNA 的基因通常位于内含子，基因间区域和外显子内 Kim VN，Nam JWGenomics of microRNAJTrends Genet，2006，22( 3) : 165-173，人类miRNA 基因多位于内含子 Kim YK，Kim VNProcessing of intronic microRNAsJEMBOJ，2007，26( 3) : 775-783。miRNA通常由RNA Pol转录，一般最初产物大多为具有帽子结构和polyA尾巴的pri-miRNA。在哺乳动物细胞内，pri-miRNA是由核内的“微处理器复合物（microprocessor）”进行处理，复合物由Drosha、DGCR8及一个双链RNA结合蛋白组成。经过microprocessor处理即形成长约70nt的茎环结构pre-miRNA。然后pre-miRNA经图 2 pre-miRNA二级结构分区示意图Exportin-5蛋白转运进入细胞质中，经Dicer进一步加工。这一过程分为两个阶段，首先是pre-miRNA 被Dicer 酶切割成具有5端磷酸基和3端2 nt 突出的约22 nt 长度的miRNA: miRNA* 双体，然后在解旋酶的作用下，释放成熟的miRNA。其互补链miRNA*被水解，miRNA 则选择性地结合到RISC (RNA Induced Silencing Complex)上去，发挥生物学功能。1.3 miRNA的作用机制成熟的单链miRNA与Argonaute家族结合形成由RNA诱导的沉默复合物3，引导Argonaute蛋白进入完全或部分互补的mRNA标靶，主要通过miRNA 5'端的7 nt的序列与靶基因的3'非翻译区(3'UTR)的miRNA调控元件相互作用，从而调控靶基因的表达4。也有研究发现，动物细胞中的miRNA可以与靶基因的5'非编码区相互作用，参与基因表达的控5。miRNA与靶基因结合后，碱基对完全互补配对时，靶基因即被降解，碱基对不完全互补配对时，靶基因的翻译即被抑制。另有研究表明，miRNA可以通过降解与翻译偶联的蛋白质、抑制翻译延长、提前终止翻译( 核糖体脱落) 以及通过抑制翻译起始等机制抑制蛋白质表达，还可以在被称为mRNA加工体或P体的细胞质独立位点上，通过螯合mRNA使其沉默6。一种miRNA通常能够与多个mRNA结合，一种mRNA也可以被多种miRNA调节。2. miRNA与肿瘤的关系miRNA参与早期胚胎发育、细胞增殖与凋亡、细胞分化、脂肪代谢等一系列重要的生命活动。而细胞增殖及凋亡等常在肿瘤中发生异常，因此推测miRNA的异常缺失、突变或过表达与肿瘤的形成有关。近几年的许多研究也的确表明了miRNA与肿瘤的发生密切相关。表1 miRNA 的作用与常见肿瘤的关系常见肿瘤致癌基因(表达上调)抑癌基因(表达下调)相关靶基因、靶蛋白乳腺癌miR21、miR155miR125、miR -206、miR-10bER、ErbB、PTEN、TPM1宫颈癌miR21miR-143、miR-145、miR-127PDCD4、BCL-6、CDK234卵巢癌miR21miR-15、miR-16Bmi-1肺癌miR155、miR17-92 簇miR-126、let-7 家族PTEN、TPM1、Ras、Myc胃癌miR150、miR21miR-9、miR-433、miR-451、miR-34EGR2、RECK、GRB2、RAB34、MIF、P53、CBX7、RBMXL1肝癌miR151miR-194、miR-199a /b-3pRhoGDIA、N 型钙黏附素、PAK4恶性淋巴瘤miR17-92 簇miR-143、miR-145c-Myc、ERK5、E2F1、ICOSL2.1 miRNA与肿瘤的发生miRNA与通过调节癌基因及抑癌基因的表达，调控细胞的分化、增殖、凋亡，从而促进或抑制肿瘤的发生，期间有着复杂的调节机制，形成调控网络，共同促进或抑制肿瘤的发生。甲基化、生物起源上的缺陷、变异、转录的异常以及基因组的丢失或扩增等均导致miRNA在人类肿瘤中的异常，许多miRNA直接表现为一种原癌基因或抑癌基因的作用，致癌与抑癌miRNA通过正向或负向调控肿瘤抑制基因、癌基因或控制细胞周期进程、分化或凋亡的基因，直接调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，参与肿瘤的生成、发展甚至侵袭转移。Calin等 Calin G A. Frequent deletions and down -regulation of micro RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemiaJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 15524-15529.的研究首次证明miRNA的失调在肿瘤的发生中起着非常重要的作用。miR-15和miR-16定位于染色体13q14 区段，该区段的局部丢失与慢性淋巴性白血病（CLL相关），在检测的CLL病患中，有近68%的这两种miRNA完全缺失或表达下调。另外，在前列腺癌（60%）、外套淋巴细胞瘤（50%）和多发性骨髓瘤（16%40%）等肿瘤中也常有该区段的缺失 Dong J T, Boyd J C, Frierson H F Jr. Loss of heterozygosity at 13q14 and 13q21 in high grade, high stage prostate cancer J. Prostate, 2001,49 (3): 166-171.。Bcl-2蛋白是一种通过作用于线粒体来抑制细胞凋亡的蛋白，对于癌细胞的存活起着非常重要的作用。Cimmino等 Cimmino A, Calin G A, Fabbri M, et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2 J. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102:13944-13949.证实miR-15和miR-16的表达水平均与BCL-2蛋白的表达水平负相关，并且二者都在转录后水平通过靶向作用负调节BCL-2，其对BCL-2的抑制诱导了白血病细胞的凋亡。因此，miR-15、miR-16是BCL2的天然的反式作用因子，对BCL-2过表达的肿瘤具有潜在的治疗作用。2.2 miRNA与肿瘤干细胞( CSC)的关系 CSC具有极强的致瘤与自我更新、多向分化能力，以及高度的耐药性。miRNA通过调节蛋白及相关基因、调节信号转导通路，在肿瘤的恶性增殖、侵袭转移、复发过程中发挥重要作用。如let-7可负调控下游靶基因H-RAS而抑制CSC的自我更新; miRNA-199b-5p通过作用于Notch 信号通路而调控CSC的自我更新能力; miRNA-135a /b过表达会导致自我更新基因的活化及远期肿瘤发生; miR-302能同时抑制细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白D-CDK4 /6通路并加强G1期阻滞通路，导致多潜能干细胞致瘤性降低 宓林，于晓峰，邹健微小RNA对肿瘤干细胞的调控机制J国际消化病杂志，2011，31: 163-165 潘运宝，杨惠玲miRNA与肿瘤干细胞的研究进展J国际内科学杂志，2009，36: 548-550。2.3 miRNA 与肿瘤相关的信号转导正常情况下调控细胞生长、分化的信号转导通路如Wnt、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT、RAS等在肿瘤发展过程中往往会发生紊乱和异常。经研究证实，miRNA可以通过与信号蛋白直接或间接作用影响的肿瘤发生，miR-146通过特有的负反馈调节环下调IL-1受体依赖性激酶1和TNF受体相关因子6的蛋白水平控制Toll样受体和细胞因子的信号转导; miR-19的过度表达使PTEN蛋白的表达下调，而PTEN对PI3K/AKT途径有负调节作用，从而为PI3K/Akt信号通路的激活提供了一种转化机制; miR-17-5p和miR-20a能负调节c-myc转录靶点之一E2F1; miR-61经过一个正反馈环使lin-12的活性最大化并持续激活Notch信号通路;miR-34则通过与p53网络协调激活众多转录靶点来抑制异常的细胞增殖; miR-125a /miR-125b过表达可抑制Erb B2 /B3信号通路，导致细胞迁徙和侵袭力的下降 吴易阳，李岭 MicroRNA与肿瘤相关的信号转导通路J遗传，2007，29: 1419-1428 张超，谢书阳 微RNA 在肿瘤发病相关信号通路中的作用J生命的化学，2010，30: 751-755。Johnson等 Johnson S M, Grosshan H, Shingara J, et al. Ras is regulated by the let-7 microRNA familyJ. Cell, 2005, 120(5): 635-647.研究发现let-7家族通过与Ras基因的3UTR区中多个let-7补充位点（LCS）结合，负向调控Ras信号转导通路。实验表明，let-7miRNA的表达水平在肺癌组织要低于正常肺组织，然而Ras蛋白在肺癌组织中显著的高表达，为let-7miRNA在癌症中的作用提供了一个可能的机制。Akao等 Akao Y, Nakagawa Y, Naoe T. Let-7 microRNA functions as a potential growth suppressor in human colon cancer cells J. Biol Pharm Bull,2006, 29: 903-906.的研究表明，let-7在结肠癌中也起着肿瘤抑制因子的作用。Brueckner等 Brudckner B, Stresemann C, Kuner R, et al. The human let-7a-3 locus contains an epigenetically regulated microRNA gene with nocogenic functionJ. Cancer Res, 2007, 67: 1419-1423.研究发现，人类let-7a-3前体miRNA可以作为肺腺癌中后生的调节性miRNA基因，具有原癌基因的潜能，该基因的甲基化可能导致人类癌症的发生。2.4 miRNA 与肿瘤血管生成肿瘤血管生成是指肿瘤细胞通过分泌促血管生成因子激活静息状态的内皮细胞，使之增殖、迁移至肿瘤附近，并形成毛细血管网包绕。内皮细胞是肿瘤血管生成重要的效应细胞，Dicer或Drosha的沉默都能显著抑制血管内皮细胞的增殖和其管状形成。miRNA可作为控制内皮细胞功能的血管调节靶点，揭开了靶向抗血管生成治疗癌症的新篇章。2.5 miRNA 和肿瘤转移的关系miRNA在肿瘤转移过程的多个环节起作用，通过调节上皮间质转化(EMT)、相关靶基因、信号通路等方式促进或抑制多种恶性肿瘤的转移，miRNA有望成为多种恶性肿瘤诊断和转移预后的分子标志。如: miR-155、miRNA-200家族(如miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141和miR-429)和miR-205通过作用于RhoA 或影响E-钙黏素转录受体ZEB1和ZEB2的表达水平，调节TGF-途径影响EMT(上皮细胞间质转型) ; miR-146a /b通过IL-1和Toll样受体信号途径负向调节NF-kappaB活性，抑制靶因子IL-8、IL-6和MMP-9的表达，降低肿瘤细胞转移率。miR-21对神经胶质瘤、食管鳞癌、胆管癌、乳腺癌、肝细胞肝癌、结直肠癌、前列腺癌的转移均有促进作用; 而miR-34a对葡萄膜恶黑色素瘤 谢乐，姜汉国miRNA和肿瘤转移的研究进展J医学综述，2009，15: 1505-1508、肝癌的转移则有抑制作用 赵文芳，贾永肿瘤细胞侵袭转移机制的研究现状J健康必读，2011( 6) : 171-173。2.6 miRNA 与肿瘤耐药的关系 许多miRNA的表达水平与肿瘤细胞耐药性的产生有着密切的关系。miRNA 的多态性( miRSNP) 、突变、异常表达会导致miRNA功能丧失或增强，从而导致蛋白水平的表达改变，如果影响到药物吸收、代谢、分布通道上的基因表达及靶向参与临床功能将可能导致持续耐药。正常情况下，miRNA及靶蛋白的水平维持正常状态; miRNA的基因发生突变时无法与靶mRNA正常配对，靶蛋白高水平表达;miRNA过表达时靶蛋白低表达 莫益俊，赵健微小RNA与肿瘤耐药J肿瘤学临床研究，2011，23:283-286，若此类靶蛋白参与细胞对药物的反应，如药物靶点、药物转运体、细胞凋亡及修复等相关蛋白，将导致药物敏感度的改变，如miR-221和miR-222对抗雌激素的药物耐药及下调P27kip1抑制肿瘤坏死因子相关诱导配体介导的细胞凋亡信号通路 马维娜，王世明，原永芳.miRNA与肿瘤耐药关系的研究进展J医学综述，2011，17: 3401-3404。3. miRNA对肿瘤的诊断及治疗3.1 miRNA与肿瘤的诊断大量的研究显示，miRNA在肿瘤细胞、癌组织、癌旁组织、正常组织中都有特征性的表达谱改变，在肿瘤患者的血尿中也有特征性的表达水平改变，这就为肿瘤的诊断提供了新的思路，也提示miRNA可能可以成为肿瘤诊断的重要的分子生物学标志。Lu等人通过流式细胞术及生物芯片技术检测了将近20种肿瘤的miRNA表达，发现每种肿瘤都有特征性的miRNA表达谱，且表达谱还能反映肿瘤的发展、分化、分期，及肿瘤的组织细胞来源。Golub小组运用real-time PCR及miRNA芯片技术，对334种不同肿瘤的miRNA表达谱进行分析，发现表达谱与肿瘤组织来源及分化程度相关，进而提出建立各种肿瘤的miRNA表达谱基因库，可能对肿瘤的诊断有重要作用 Lu J, Getz G, Eric A, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancerJ. Nature, 2005, 435 (7043):834.。Lawrie L awrie CH, Gal S, Dun lop HM, et a l Detection of elevated levels of tum our associated microRNA s in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma J. B r J H a cmatol 2008, 141(5) :672 -675.等人对60例B细胞淋巴瘤及43例健康对照者的血清中的miR-155、miR-210、miR-21分析发现，三者明显高于对照组，提示血清中的miR-155、miR-210、miR-21可以作为诊断B淋巴细胞瘤分子标记。Zhou Zhou H, Guo JM, Lou YR, et al. Detection of circulating tumor cells in peripheral blood from patients with gastric cancer using microRNA as amarker J. M o lM ed 2010, 88 (7): 709-717.等人运用real-time PCR技术检测90例胃癌患者血液中miR-106a及miR-17的表达明显高于正常人血液，这提示miR-106a，miR-17可以作为胃癌的分子标记用于诊断。研究者发现，膀胱癌患者尿液中的miR-126、miR-152表达水明显升高，作为诊断标记物的特异性82%，敏感性72% Merle H, Kai H, H artmut M, et al. A robust methodlogy to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cance rJ. Uro l Onco, l, 2009.。雷宇等 雷宇，刘彦信等.肿瘤相关巨噬细胞microRNA 表达谱及生物信息学分析J.基础医学与临床，2012，32（7）：767-772.建立小鼠乳腺癌细胞系4T1 移植瘤模型，从移植瘤组织中分离TAM，用基因芯片检测microRNA 表达谱，与阴性对照细胞PEC相比，TAM 中有59 个microRNAs表达量出现显著变化，其中23 个microRNAs 表达上调，有36 个microRNAs 表达下调。图3 移植瘤TAM与PEC相比较的miRNA表达谱群聚图3.2 miRNA 与肿瘤的治疗因miRNA的表达对肿瘤的发生、发展、转移、分期、预后及肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡有着密切关系，其本身起着癌基因及抑癌基因的作用，因此对肿瘤中miRNA表达进行干预，为肿瘤的治疗开辟了一个新的途径。目前对miRNA 进行干预来治疗肿瘤主要有两条思路：1.通过转染或直接导入人工合成的miRNA，使有抑癌基因特性的miRNA表达上调，从而抑制肿瘤的生长；2.应用与特异miRNA互补的反义小分子核苷酸与相应的miRNA相结合，来沉默或竞争其与mRNA的结合，使有癌基因特性的miRNA功能得以阻断，从而抑制肿瘤的生长。表2 基于miRNA开发的抗肿瘤药物研究者靶点针对疾病开发阶段Regulus TherapeuticsmiR-21胶质母细胞瘤先导化合物发现和临床前研究miRNA Therapeuticslet-7 (NSCLC)非小细胞肺癌临床前研究miRNA TherapeuticsmiR-34黑色素瘤、肺、前列腺、肝及结肠癌先导化合物发现和临床前研究Kim等miR-145乳腺癌临床前研究4. 展望目前对miRNA在肿瘤中的研究还处于起步阶段，还有很多复杂的机制未完全清楚，但现有的研究显示，其无论是在肿瘤的基础理论研究，还是在肿瘤的临床诊断、治疗、判断预后及药物开发中，都有着巨大的潜在价值，为肿瘤的防治开辟了一条新的途径。随着生物信息学、生物芯片技术、real-time PCR等现代生物学技术应用于miRNA的研究，定将解开其复杂的生物学功能，使其成为人类防治疾病特别是肿瘤的一把利剑。参考文献13