在人白色脂肪细胞分化过程及肥胖人群脂肪组织中的表达研究.docx

目的探讨长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）KCNQ1OT1在人白色脂肪前体细胞分化过程中的表达情况，以及在肥胖人群脂肪组织中的表达变化，明确KCNQ1OT1与肥胖的相关性，为阐明KCNQ1OT1在人脂肪细胞分化过程及肥胖中的潜在作用提供线索。方法通过实时定量PCR技术，检测KCNQ1OT1在两种内参基因（PPIA/GAPDH）标准化条件下，于人白色脂肪细胞分化第0，1，3，5，9，12天的表达水平；应用实时定量PCR技术检测KCNQ1OT1在肥胖和正常人群白色脂肪组织中的表达变化；采用Pearson相关分析探讨KCNQ1OT1与人群体质指数（Body mass Index, BMI）、血清甘油三酯（Triglyceride，TG）及胆固醇(Cholesterol，CHOL)的相关性。 结果 1 KCNQ1OT1在脂肪细胞分化第1、3、5、9和12天的表达量分别为6.36E-05±0.00、1.88E-03±0.00、1.13E-03±0.00、4.91E-04±0.00、3.50E-04±0.00（PPIA）；3.94E-05±0.00、8.61E-04±0.00、8.61E-04±0.00、9.96E-04±0.00、3.12E-04±0.00、3.12E-04±0.00（GAPDH），与第0天相较，均呈上升趋势，且变化差异有显著性（p<0.05）, 在分化前期（第1天、第3天）增长尤为明显。2. KCNQ1OT1在肥胖人群内脏脂肪组织中的表达量为3.37E-03±0.002（PPIA）/3.37E-03±0.002(GAPDH), 较正常人显著增加，差异具有统计学意义（P < 0.05）；3. KCNQ1OT1与人群BMI呈正相关，相关系数为r=0.656（PPIA）和r=0.554（GAPDH），（P < 0.05）。KCNQ1OT1与人血清甘油三酯呈正相关，相关系数为r=0.578（PPIA）和r=0.627（GAPDH），（P < 0.05）。结论 1、KCNQ1OT1在白色脂肪细胞分化过程中呈增高趋势；2、KCNQ1OT1在肥胖人群脂肪组织中的表达增高；3、KCNQ1OT1与BMI、血清TG等肥胖相关指标呈正相关。提示其在人脂肪细胞分化过程中可能发挥重要的调控作用以及作为肥胖防治的潜在靶标。析 将收集的临床样本分为两组，即正常组(n=8)和超重肥胖组(n=14)，结果发现，KCNQ1OT1在超重肥胖组脂肪组织中的表达量显著高于正常组（p<0.05）其表达水平与BMI成正相关，相关系数分别为r=0.656（PPIA）和r=0.554（GADPH），p<0.05(图4)，KCNQ1OT1表达水平与血清TG水平呈正相关，相关系数分别为r=0.578（PPIA）和r=0.627（GADPH），p<0.05(图5), 与血清CHOL水平的相关性分析显示：以PPIA为内参的表达量呈正相关r=0.557，p<0.05；以GADPH为内参的表达量无相关性，r=0.367，p>0.05。3、不同内参基因下，KCNQ1OT1表达量与BMI、血清TG、CHOL 的相关性分2. KCNQ1OT1在肥胖人群白色脂肪组织中的表达情况将收集的样本分为两组：正常组（n=8），超重/肥胖组（n=14）。提取两组人群白色脂肪组织中的总RNA，并经实时定量PCR检测其中KCNQ1OT1的表达。KCNQ1OT1在正常组人群中的表达水平（2-CT）为8.20E-03±0.003（PPIA）和1.90E-02±0.007（GAPDH），在肥胖超重人群中表达量的表达量分别为3.37E-03±0.002（PPIA）、3.37E-03±0.002（GAPDH），两组人群白色脂肪组织中KCNQ1OT1的表达量有显著性差异。详见表2和图3。结果1 KCNQ1OT1在脂肪组织细胞分化不同时间点的表达量 KCNQ1OT1在脂肪细胞分化第0天的表达量（2-CT）为6.36E-05（内参基因为人PPIA）和3.94E-05（内参为人GAPDH），第1、3、5、9和12天的表达量均呈现上升趋势（与d0天相比），特别是分化前期（第1天、第3天）增长趋势更为明显，差异有显著性（P < 0.05）。于分化第4天加入诱导剂，分化第5、9和12天，KCNQ1OT1的表达量与分化第1和3天相比，略有下降。（详见表1和图1、2）1.3.5定量PCR参照PowerUp SYBR® Green Master Mix PCR试剂盒说明，以上述逆转录cDNA为模板进行KCNQ1OT1的qPCR 扩增。采用2-CT法计算，以 人PPIA和GAPDH基因作为内参，计算KCNQ1OT1的相对表达量。1.4 统计学方法运用SPSS21.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准差 (X ± SD) 表示，计量资料用t 检验、分化不同时间点表达量的总比较用ANOVA方差分析，；采用Pearson分析法对KCNQ1OT1表达量（2-CT）与BMI、血清甘油三酯和胆固醇水平进行相关性分析。P0.05表示差异具有统计学意义。肥胖是指体内脂肪组织过度沉积、达到损害健康的一种疾病状态，目前已经成为全球流行性最广的慢性非传染性疾病之一1-3。肥胖不仅表现为体重超标，通常还伴有胰岛素抵抗 4，肥胖是与型糖尿病、高血压、血脂代谢异常等有密切联系，严重影响人体健康5。长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是一类转录本长度超过200nt、不参与编码蛋白的RNA分子4，在多种生理病理过程中扮演多种角色，其中在细胞增值、分化、凋亡过程中所发挥的作用4。 lncRNA KCNQ1OT1为位于人类染色体11p15.5 5，目前KCNQ1OT1的研究多集中在肿瘤方面，其水平在多种上皮细胞肿瘤、腺癌中呈上调趋势，并有介导肿瘤恶变倾向的作用6，另有研究发现KCNQ1OT1可致机体对紫杉醇等抗癌药物的抗药性增加7。在大鼠体内研究发现，KCNQ1OT1在高糖刺激下，可以加速心肌组织纤维化，进一步提示糖脂代谢异常会改变该lncRNA表达，进而参与疾病的发生 8，目前KCNQ1OT1与肥胖的相关研究未见报道，因此，KCNQ1OT1是否在肥胖过程中发挥作用引起了我们的关注。修改语句，和张娜的重复性高，是否能够进修修改本研究以人白色脂肪前体细胞为模型，分析了KCNQ1OT1在脂肪前体细胞分化过程的水平变化，初步明确了KCNQ1OT1在肥胖人群中的表达情况、并分析了其与BMI、血清甘油三酯及胆固醇的相关性，为进一步探讨KCNQ1OT1在人脂肪细胞分化及肥胖中的作用与机制提供线索。1、 材料与方法1.1样本 内脏脂肪组织取自江苏省人民医院、南京市妇幼保健院的就诊患者共28名。组织经生理盐水冲洗，RNAlaterer® RNA稳定试剂处理后，-80保存，排除严重心肺功能障碍、肝肾等疾病患者。分组：按照2003年中国肥胖工作组制定的中国成人超重和肥胖症预防和控制指南8 建议，将BMI指数大于24kgm2纳入超重、肥胖组/BMI指数介于18kgm2和24kgm2之间纳入正常对照组。最终纳入统计的病例共22例，其中：正常对照组8例；肥胖组中肥胖/超重14例，所有研究工作均经南京医科大学附属南京市妇幼保健院伦理审查委员会批准（伦理号：宁妇伦字（2010）36号），并签署知情同意书。1.2细胞及实验材料 人前体脂肪细胞（Human preadipocyte from visceral fat, HPA-v）（Sciencell公司 美国）；DMEM/F12培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin Solution, P/S）（Gibco 公司 美国）；I型胶原酶、胰岛素(Insulin)、地塞米松（DEX）、3-丁基-1-甲基次黄嘌呤（IBMX）(Sigma 公司 美国)；PBS 缓冲液(维森特 中国)； RNeasy mini 试剂盒(QIAGEN 德国)；逆转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser, TARAKA, Japan)；PCR试剂盒（PowerUp SYBR® Green Master Mix，赛默飞公司 美国）；定量PCR仪(Biosystems ViiA 7 , life technologies, 美国)。1.3 方法1.3.1 人前体脂肪细胞（HPA-v）的培养将人前体脂肪细胞 (HPA-v)按105/ml 密度接种于6孔板，加入含5%胎牛血清、PAM完全培养液，置37、5% CO2 培养箱中培养。1.3.2脂肪细胞的诱导分化待细胞长满培养基（诱导第0天）后，将PAM完全培养液换成诱导剂培养基（DMEM+1%青链霉素+0.5 mmol/L IBMX+1 umol/L 地塞米松+5 ug/ml胰岛素），第四天后换成诱导剂（DMEM+1%青链霉素+5ug/ml 胰岛素）直至分化成熟。收集d0、d1、d3、d5、d9、d12的细胞样品。1.3.3 总 RNA 抽提及 cDNA 逆转录 按TianGen试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA并逆转录1.3.4引物设计通过加州大学基因数据库（UCSC），生物信息学数据库（Ensembl），RefSeq等数据库查找KCNQ1OT1，PPIA，GAPDH等基因的正确序列，选择人PPIA和GAPDH作为内参。利用Primer blast (https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)在线设计引物并验证特异性，最后送锐真生物技术公司合成，引物序列如表：讨论脂肪前体细胞分化是肥胖研究的重要方向10。肥胖是一种病理状态，由于能量代谢失衡导致体内脂肪细胞增多，脂肪细胞数量的增多是由脂肪前体细胞分化增加所致。前脂肪细胞与分化成熟的脂肪细胞相比，有近百个lncRNAs 的差异表达，在对这些lncRNAs 进行干扰后发现，脂肪细胞成熟标记物表达水平也随之发生了相应改变14，说明这些lncRNAs的表达水平可能和脂肪细胞的成熟过程密切相关。以往研究发现，有多个处于活跃状态的lncRNAs在脂肪细胞的分化中起到非常重要的作用3，如SPA、U90926，和Gm15441等lncRNAs 11-13。除此之外，lncRNA-MIR31HG, HOXA11-AS1, lncRNA-ADINR，lncRNA-paral1和lncRNA-NEAT1等基因对脂肪前体细胞分化也起到一定的作用15-19。以上研究说明：lncRNAs可能是脂肪细胞分化过程的关键调控因子，可为肥胖的深入研究提供线索。 本研究采用Realtime PCR技术对小鼠脂肪前体细胞中KCNQ1OT1的表达量进行检测，我们发现，在脂肪前体细胞分化过程中，尤其在加入诱导剂I（分化早期）后，KCNQ1OT1水平显著增加，加入诱导剂II后较之分化早期略有下降，就提示KCNQ1OT1有可能参与了脂肪细胞的早期分化。本研究对肥胖人群白色脂肪组织中KCNQ1OT1的含量进行检测，其水平显著高于正常人，且与BMI呈正相关，与血清脂类物质（TG、CHOL）水平呈正相关。而脂肪在体内代谢的生化过程主要分为甘油三酯、磷脂、胆固醇和脂蛋白等四类物质的代谢，我们的研究证实，人白色脂肪组织中KCNQ1OT1水平与脂代谢密切相关。因此，我们认为KCNQ1OT1在肥胖过程中发挥重要的作用，提示，KCNQ1OT1可作为肥胖发生和脂代谢的重要调控因子做进一步研究，今后将通过功能实验来进一步验证。本研究中，肥胖人群KCNQ1OT1的表达呈上升趋势，且与脂类物质水平呈正相关。本人前期研究中发现TG和TC两种脂质物质水平和OGTT试验结果呈一定程度正相关，脂质物质代谢紊乱可导致机体呈现一定程度的胰岛素抵抗14。Fan Yang等人的研究证实，在30mmol/L血糖作用下，人心肌纤维组织中KCNQ1OT1被大量激活，通过沉默糖尿病大鼠模型的KCNQ1OT1基因，可显著改善病鼠心功能和心脏纤维化的程度，这也提示KCNQ1OT1水平可能与糖脂代谢、胰岛素抵抗之间存在某种关联。在胰岛素抵抗状态下，组织对血浆葡萄糖利用减少，刺激胰岛Beta细胞释放胰岛素，继而导致高胰岛素血症。高胰岛素血症又通过负反馈调节性激素结合求蛋白水平进一步加速脂质在脂肪组织聚集，导致肥胖9。本研究中肥胖/超重组中KCNQ1OT1的表达水平高于正常人群，进一步提示了KCNQ1OT1与肥胖或脂类代谢之间的高度关联，为后期进一步研究KCNQ1OT1导致肥胖的机制提供了可靠线索。综上所述，KCNQ1OT1在白色脂肪组织细胞分化过程中的表达水平提示其可能作为脂肪细胞分化重要调控因子。KCNQ1OT1在肥胖人群脂肪组织中表达明显高于正常人群，且与BMI呈正相关，提示KCNQ1OT1可作为肥胖相关疾病的预警指标，对于代谢相关疾病早发现、早干预，有很大的研究意义。