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植物内生菌对苹果树腐烂病防治的研究进展中文摘要植物内生菌作为一种天然的资源菌，其发挥的生物防治作用已受到广大学者的关注，本文从植物内生菌的作用、苹果树腐烂病的研究现状以及植物内生菌对苹果树腐烂病防治进行综述，旨在探讨有关植物内生菌对苹果树腐烂病防治方面的相关问题和发展趋势，以期为今后开展相关研究提供参考。关键词：植物内生菌；苹果树腐烂病；防治作用。Abstract: As a kind of natural resource bacteria,the biologyical control effect of plant endophytes has been paid more and more attention by scholars.In this paper,the effects of plant endophytes,the research status of apple tree rot and the control of apple tree rot are reviewd by plant endophytes.In order to provide reference for the future research,the related problems and development trend of the control of apple tree rot were discussed. Key words: Plant endophytic bacteric; Apple tree rot; Control effect.目 录1植物内生菌作为资源菌的作用41.1对宿主植物生长的促进作用42苹果树腐烂病的概述53植物内生菌防治苹果树腐烂病63.1植物内生菌的研究方法63.2内生菌防控植物病害的机制63.3植物内生菌对苹果树腐烂病的防治83.3.1植物内生细菌对苹果树腐烂病的抑制作用83.3.2植物内生真菌对苹果树腐烂病的抑制作用83.3.3植物内生放线菌对苹果树腐烂病的抑制作用104问题与展望12参考文献13致 谢15正 文植物内生菌（Endophyte）主要是指存在于植物各组织或器官内，在植物整个生命或某一特定生活阶段，不使其出现明显被感染症状的一种微生物。最具代表性的有内生细菌、内生真菌和内生放线菌等三种1。从1886年德国科学家DeBarry首次提出“内生菌（endophyte）”一词2，到20世纪30年代人们通过牲畜误食感染了内生真菌的牧草，人们才开始对内生菌有了初步认识，并由此展开了研究。随着研究领域的拓宽，内生菌的生理作用、防治作用被农业和医药领域内的国内外学者不断挖掘，并逐步推广应用。作为生物农药，植物内生菌具有的优势：如不易产生抗药性、无害、无毒、无污染、能够保持生态平衡等，使它逐渐成为国内外学者的研究焦点。1植物内生菌作为资源菌的作用植物内生菌在植物中的分布具有多样性和普遍性，目前在研究过的所有植物中都发现有内生菌存在3,4，可分布于大部分植物的组织和器官中，其种类也趋于多样性，目前，全世界已经在80多个属4,5290多种禾本科植物中发现内生菌，一种植物中能够分离到几十种甚至多达几百种内生真菌或内生细菌6。植物内生菌在各种水生、陆生低等植物和高等植物中都有分布 7-8。正是由于植物内生菌有种类多、分布广的特点，决定了其发挥作用的多样性。植物内生菌对植物体的作用与抗病性主要表现在植物内生菌能够产生一些次级代谢产物，比如水解酶、抗生素类物质、植物生长调节剂以及生物碱等。1.1对宿主植物生长的促进作用固氮作用。大气中氮气的含量很高，但能被生物吸收利用的却很少，固氮生物能将大气中的氮气转化成氨，这个过程被称为生物固氮。固氮生物一般情况下都是个体微小的原核生物，所以又把固氮生物称为固氮微生物。根据固氮生物与高等植物之间的关系，可以将固氮生物分为自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌9。最开始，人们对固氮的认识并不多，以为它的形成条件非常苛刻，只有微生物与豆科植物共生形成的根瘤才能够产生。直至Dobereine等在甘蔗中分离出固氮内生细菌后，对非豆科植物内生细菌的研究逐渐收到学者的关注4。近年来，已相继在小麦、甘蔗、水稻、玉米等植物中分离到了具有固氮作用的内生菌。溶磷解钾的作用。有研究表明，许多微生物可使有机磷发生矿化或是将其转化为可溶性的磷，从而促进植物对磷的吸收10。铁载体作用。铁载体是一种螯合铁，是通过植物或微生物合成分泌而产生的，它是一种微生物摄取铁元素的低分子量化合物，几乎遍布所有微生物中。有大量研究表明，许多植物都能够吸收细菌中的铁载体，这对于植物吸收并利用铁元素是至关重要的，该方式也是这种细菌促进植物生长的一个方面，另一方面是内生菌通过与病原菌竞争铁营养来抑制病原微生物的生长繁殖，从而起到生物防治的作用11。图1 3种铁载体的类型对植物生长的促进作用。生长素、赤霉素及细胞激动素等植物激素都能够通过内生菌产生，并能直接促进植物的生长。张集慧等12通过对药用植物的分离，得到5种内生真菌，并在其菌丝和发酵液中分别提取到脱落酸、吲哚乙酸、赤霉素、玉米核苷以及玉米素等5种植物激素，这些激素能够较好的促进兰花的生长发育。内生菌抑制病原菌使通过直接产生拮抗物质来发挥作用的，同时也能通过加强植物对相关营养元素的吸收、与宿主内病原菌竞争生存空间和物质等方式，抑制病原菌的生长，以此达到促进植物健康成长的目的。当然，除了能促进植物生长外，内生菌还具有防治植物病害的重要作用，而这也正是本文将要重点展开讨论的内容。2苹果树腐烂病的防治苹果腐烂病（Valsa mali Miyabe et yamada）俗称臭皮病、烂皮病，是通过黑腐皮壳属（Valsa ceratosperma，无性型为壳囊孢属)真菌引发的一种对苹果树干有严重危害的病害之一，其症状主要有溃疡型和枯枝型。19世纪末，首先在日本发现苹果树腐烂病；到了20世纪初，山田太郎和宫布金吾发现了该病，并给它命名Vasla mali Miyabe et Yamada。随后世界各地相继出现苹果树腐烂病及其危害的相关报道，引起了果农和科研工作者的重视，并陆续开始探索防治措施及相关的研究工作并取得了好的效果。苹果作为水果产业的主力军，无论在水果产业还是经济发展中都发挥着重要作用，但是近年来随着苹果树腐烂病发病率逐年升高，侵染面积不断扩大，对苹果产业的发展造成严重的影响，苹果树腐烂病的特征主要有以下几点：（1）病菌的潜伏期长。腐烂病菌从树体的木质部侵入树体后，一般不会立即发病，而是潜伏起来，等到条件适宜再从木质部扩展到皮层而引起发病，据观察，苹果树腐烂病的潜伏期可以长达3-4年之久：（2）侵染点多。腐烂病可以通过剪锯口、转枝口等人为伤害，及虫害、机械损伤冻害等自然灾害导致的伤口都能侵染果树。此外，果树的皮孔、果痕、叶痕出也可以作为侵染腐烂病的入口，总之能够被腐烂病侵染的点很多，足以导致每个枝条都被染菌；（3）田间菌源多、数量大。苹果树腐烂病菌孢子可以通过气流、雨水及昆虫等多种介质进行传播，而果农一般都将清理的病变组织堆放在果园中或者倒入果园边的杂草中，不注重病菌的彻底清理，这很容易造成大面积感染。截止目前，苹果树腐烂病仍然是一种难以治愈的疾病。目前，对苹果腐烂病的综合防治研究不断深入，主要防治措施包括栽培管理、化学防止、物理防治、生物防治及植物源农药防治等，其中在生产中以喷施化学药剂和农业防治为主。由于人们长时间、大剂量的喷施化学药剂，不仅是内生菌株产生抗性，而且引发了严重的环境污染及果品农药残留等问题。在植物体内内生菌存在普遍，并在长期的协同进化过程中与植物形成了相互促进的关系。研究表明，被内生菌感染的宿主植物具有抗胁迫、抗病害、抗逆境及生长快速等优势，相比于未感染植株有更强的生存竞争力13。而且植物内生菌可以产生生物活性物质，能够作为生物防治的资源及以新药的来源14，作为潜在资源菌，它们以其独有的优势，例如可以很好的定殖于植物相应的部位、占据有利的生态地位、不易受到环境条件的影响以及能够抵抗病原物入侵等，在防治植物病害方面展示出强大的应用前景。近年来，随着人们环保意识的增强，加上生物防治有安全、环保、成本低等优势，所以，利用拮抗微生物来防治植物病害，并将其作为绿色环保长效防治的途径已经被推到了生物病害防治的前沿3。3植物内生菌对苹果树腐烂病防治植物内生菌能够增强宿主植物抵抗病虫的能力。一方面，植物内生菌能通过产生如水解酶、抗生素类物质、生物碱以及植物生长调节剂等，增强植物生长力；另一方面，内生菌还会和病原菌共同竞争所学的营养物质与生存空间，使寄主植物产生抗性，从而对宿主植物起到防治的作用。因植物内生菌与宿主植物关系比较复杂，且因其生长环境非常特殊，因而当前关于内生菌加强宿主植物抗逆性作用的研究甚少，可供参考的研究结论也比较匮乏，多为推论或间接得出的结论。这些推论可大致归纳为以下四点：（1）内生菌刺激宿主植物生长的方式主要为产生活性物质或影响宿主植物的代谢，去改变它的生理特性的方式15,16；（2）以诱导的方式使寄主植物产生抗逆性；（3）夺去病原菌所需要的营养物质和生长空间；一定量的内生菌及其诱导植物产生的醌类和酚类物质在细胞间的积累，这往往是构成病原菌在植物体内运转或是进入植物体内的机械化学屏障17。植物内生菌种类多、数量大，且不同的内生菌具有不同的防病机制。下面笔者将分为三点详细阐述植物内生菌对苹果树腐烂病的防治作用：3.1植物内生细菌对苹果树腐烂病的抑制作用植物内生菌在其生长过程中能产生抗生素、水解酶和生物碱等抗菌活性物质，而这些在植物体内产生和运输的抗菌性活性物质，又能直接抵抗病原菌的入侵，从而有效防治植物病害。1992年，Kloepper和Beauchamp首次提出植物内生细菌(Endophytic bacteria)这一概念，并认为植物内生细菌可定殖于健康植物组织内，并能与植物本身和谐共处19。随着研究的不断深入，发现在植物内生细菌的生长和增殖过程中，不仅能够与寄主植物产生相同的化合物，还能产生一些次级代谢产物20，这些次级代谢产物主要有酚类、醌类、生物碱类等，具有促进植物生长和抗病虫害的作用21。王彩霞等从山东栖霞苹果果园根际土壤中分离筛选到微嗜酸寡氧单胞菌细菌菌株BJ1，并通过测定发现BJ1对苹果树腐烂病菌孢子萌发和菌丝生长有抑制作用22。吴玉星23等从苹果抗性资源东北黄海棠的树皮中筛选出的苹果树皮内生细菌HFn3对苹果树腐烂病有拮抗作用，经室内离体枝条生物测定及田间药效试验表明细菌悬浮液对苹果树腐烂病有一定的田间防治效果和拮抗作用，且对苹果树腐烂病病斑的愈合有明显的促进作用。尹宝重等24在苹果树皮中筛选出对苹果树腐烂病有较好的拮抗作用的内生细菌B5014，并且发现其发酵液无论对苹果树腐烂病病菌菌丝生长还是孢子萌发都有明显的抑制作用。苹果树皮内生细菌B5014从苹果树皮中分离得到，对苹果树有较好的亲和性，接种在苹果树上很容易被果树接收，从而可以长时间甚至永久定殖于果树内部发挥生防作用。3.2植物内生真菌对苹果树腐烂病的抑制作用内生菌可通过夺走病原菌生长需要的营养物质18，使病原菌因缺乏足够的营养，生长力不足，而出现生长态势缓慢或停止生长的现象。在一些植物组织或器官内，内生菌与病原菌的生态位是相同的，所以内生菌就可通过夺取病原菌生长空间的方式提升寄主植物的抵抗力，从而起到防治作用。因此，利用自身优势抢先在植物内占据病原菌的生态位，夺走它所需的营养，抑制其生长，是内生菌有效防治植物被病原菌侵害的重要方式之一。近些年来，随着植物内生菌在防治方面作用的凸显和扩大，关于内生真菌的研究也引起了相关学者的高度关注。植物内生真菌普遍存在于各种水生和陆生植物中，种类多、分布广，增强寄主植物其抗病能力、能够促进其生长，并能通过与病原菌争夺空间和营养物质来抑制病原菌生长，及产生水解酶类和抗生素类等活性物质影响病原菌的正常生长，从而导致其死亡25。目前，有关内生真菌防治苹果树腐烂病已有报道，高克祥等26通过研究表明，从生防因子螺旋毛壳ND35的培养滤液提取的粗酶液可以强烈抑制苹果树腐烂病病原菌菌丝生长和孢子萌发。邓正振山等27通过研究银杏内生真菌对苹果腐烂病的抑制作用，发现分离出的16株内生真菌中有4株通过产生活性物质对病菌的抑菌作用最明显。徐涛等28从健康的富士苹果树树皮中分离到分属于13个属的内生真菌126株，并通过室内抑菌试验和田间保护作用试验测定，发现对苹果树腐烂病菌的生长有抑制作用的内生真菌共有42株，挑选抑菌作用好的拮抗内生菌，不同内生真菌的ME无菌培养液对苹果树腐烂病菌菌丝的生长及其分生孢子的萌发有抑制作用，其中链格孢属真菌占87.5%，可见链格孢属真菌对防治腐烂病方面存在巨大潜力。此外，发现内生菌产生的挥发物质也能抑制苹果树腐烂病菌菌丝的生长。图 1 内生真菌对苹果树腐烂病菌的抑制情况注:a、b、c:同时接种;d:对照;e、f、g:接种内生真菌3天后再接腐烂病菌。如图，在抑制菌带边缘苹果树腐烂病菌菌丝有了显著变薄的变化、分布也呈不均匀趋势、色泽呈褐色，可见菌丝的生长受到了显著抑制。若能提前3天将内生菌接种，其抑制作用将更明显和强烈。链格孢是一类存在普遍的真菌，多寄于植物上且分布范围非常广泛，少量会出现在有机质上或土壤中，同时有个别菌种，还是人和动物的条件致病菌，链格孢能够产生多种毒素，在防治植物病害方面具有巨大潜力，成为植物重要的病原菌。赵倩等39将分离到的11株苹果内生链格孢和V.mali对峙培养时发现，11株内生链格孢对苹果树腐烂病菌都有不同程度的抑制作用，用有机溶剂提取苹果内生链格孢Al67培养滤液中的活性物质，发现被氯仿和乙酸乙酯萃取后的活性物质其水相、有机相都有抑制活性。图 2 苹果内生链格孢产生的挥发物质对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用注:a e:优先接种内生真菌 8、6、4、2 天和 CK。3.3植物内生放线菌对苹果树腐烂病的抑制作用有研究证明，通过诱导植物产生系统抗性（Induced systemic resistance,简称ISR），以抵抗病原菌的侵染而降低病害的发生，是体现植物内生菌防止作用的另一方式。诱导系统抗性（ISR）不同于传统的系统获得性抗性（SAR），ISR的表型与病菌诱导的SAR相似，它们都能够诱导植物产生对病菌的广谱抗性，一般情况下，ISR的抗性和酚类物质的积累与植保素水平提高有关6。这类内生菌中最为典型的就是内生放线菌。此外，植物内生菌还可通过增强宿主植物抵抗力或促进其生长的方式防治病害。一般情况下，一个被内生菌感染的植物和一个没有被感染的植物相比，前者要生长的更快一些。这主要是因为内生菌能加快宿主植物对营养物质的吸收，典型代表有内生固氮菌。此外，还因为内生菌可以产生或者促进宿主产生一些植物生长调节剂，比如细胞激动素、赤霉素等等，以此提高植物生长速度。植物内生放线菌指存在于健康植物的各种组织和器官内部，并对宿主植物的生长不构成危害的放线菌30。它们在植物的各个组织都有分布31,可促进植物抵御病害、适应逆境、吸收养分及维持植物体内微生态平衡32。植物内生放线菌与其他的微生物相比有以下优势：（1）这种细菌可在植物组织内定居，因而能避免与土壤及根际微生物间的竞争，从而具有突出的竞争优势；（2）该菌能通过在植物组织中产生抗菌素、溶菌酶等拮抗物质等作用去增强植物的抗性；（3）这种细菌能与寄主植物共生固氮，不仅能加快植物生长且还能提高产量。植物内生放线菌在植物病害的生物防治中的优势已引起广泛关注，它主要是通过产生抗生素类物质、分泌一些细胞壁降解酶等方式抑制病原菌的生长，或借助固氮作用、铁载体及信号分子的产生去诱导植物产生抗体，达到防治的目的。此外，生放线菌同样也能通过产生一些生长调节物去加快植物生长，提高植物抗病性。原犇犇等33分离到灰色链霉菌的一个变种对苹果树腐烂病病菌菌丝的生长有抑制作用，萃取其发酵液，发现其乙酸乙酯相抑菌活性很强。王磊34研究发现349株植物内生放线菌中足足有82株菌对苹果树腐烂病的病原菌菌丝的生长有抑制作用，进一步选出其中效果最为明显的12株菌并将其发酵，可发现这一发酵滤液，不但对病原菌菌丝的生长及孢子萌发有显著抑制的作用，且还能防止其在离体枝条上的扩散。薛应钰等35从苹果树根际土壤中分离到公牛链霉菌JPD-1,该菌株对苹果树腐烂病的抑制率达72.50%，其发酵滤液原液苹果树腐烂病的抑制率为78.14%，并使腐烂病菌呈现菌丝膨大和末端畸形的症状。郜左鹏等36研究了内生放线菌对苹果树腐烂病的防治效果，结果表明，7株植物内生放线菌无菌发酵原液都能很好的抑制病原菌分生孢子的萌发和病原菌菌丝的生长，其中以Hhs.015菌株的抑制作用为例：如图一，经Hhs.015菌株的无菌发酵滤液原液处理后，使菌株呈现出菌丝原生质体外溢、菌丝分支增多、顶端钝圆以及不规则弯曲等现象。图 1施用菌株Hhs.015无菌发酵滤液前后苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的变化注:a:25暗培养24h时分生孢子萌发情况;b:分生孢子经Hhs.015(BAR1-5)菌株无菌发酵滤液 2倍稀释液处理后培养24h时分生孢子萌发情况。C:分生孢子,GT:芽管图 2菌株Hhs.015无菌发酵滤液作用前后苹果树腐烂病菌菌丝生长的对比注:a:苹果树腐烂病菌在PDA平板上25暗培养24h时的生长情况;b:苹果树腐烂病菌与 Hhs.015菌株皿内对峙暗培养24h( 25)时的菌丝形态。标尺=50m。如图 2，正常的苹果树腐烂病菌菌株在PDA培养上显示出表面光滑、顶端尖细、粗细均匀及菌丝纤细的特征，经Hhs.015菌株的无菌发酵滤液原液处理后，使菌株呈现出菌丝原生质体外溢、菌丝分支增多、顶端钝圆以及不规则弯曲等现象。综上，植物内生菌主要是通过产生次生代谢物和活性物质使苹果树腐烂病菌菌丝生长及孢子萌发变为畸形来抑制苹果树腐烂病的发生。4问题与展望我国地大物博，植物资源十分丰富，植物内生菌有种类丰富、生存环境特殊特点，加之植物内生菌具有产生生长调节剂、诱导寄主植物产生抗性及抑制病原菌生长等作用，不仅能防治植物产生病害，且还具有环保、安全等优点，非常符合目前农业生产及生物防治的需要。而苹果树腐烂病自从20世纪初被发现以来，其危害性收到人们的广泛关注，对其进行的防治和研究也一直在持续，但是截止目前，苹果树腐烂病的防治主要以化学药剂防治为主，仍然是难以治愈的果树病害。所以，利用植物内生菌防治苹果树腐烂病在当今植物病理研究领域非常有前景。目前，虽然苹果树腐烂病在生物防治方面取得了一定的成效，但在生产实践中还存在很大的问题，主要包括：一是还有很多防治苹果树腐烂病的内生菌种未被发现，等待挖掘，已被发现并证明具有防治作用的菌种实际应用效果并不佳，加之目前对植物内生菌产生的活性物质的研究还不成熟，很难获取纯度较高的有效成分，不利于大量推广应用；二是缺乏高效而又稳定的生防菌株。有的菌株在试验条件下防治效果较好，但由于植物内生菌本身是生物活体，在田间施用后，会受到田间环境（温度、土壤pH值、湿度）、残留农药、微环境因子等因素的影响而使防治效果不稳定。因此，植物内生菌防治苹果树腐烂病的研究可以从以下方面努力:（1）加大对抑制腐烂病内生菌种类的挖掘，尤其扩大对对苹果树腐烂病有抑制作用的新的植物内生菌种类的调查，争取将更多的内生菌资源应用到腐烂病的防治，从而拓宽我国对苹果树腐烂病防治的新领域；（2）加强对植物内生菌的分布部位，定殖规律及防治植物病害机制方面的研究，从而加强植物内生菌防治苹果树腐烂病的研究和应用；（3）针对生防菌施入田间后的定殖、防治规律等问题可以通过优化菌株、控制发酵条件等方法加大研究力度，为植物内生菌在苹果树腐烂病的综合防治中发挥重要作用奠定坚实的基础。参考文献1 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