微生物的实验室培养()讲稿.ppt

微生物的实验室培养()第一页，讲稿共三十二页哦【目标导航目标导航】1.学学会培养基的制会培养基的制备备方法。方法。2.掌握大掌握大肠肠杆菌杆菌的的纯纯化方法。化方法。第二页，讲稿共三十二页哦一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1用用文字和箭文字和箭头头写出制写出制备备流程：流程：。2溶溶化化环环节节中中先先加加入入 ，取取出出称称量量纸纸后后再再加加入入蛋蛋白白胨胨和和 ，再加入，再加入琼琼脂，最后脂，最后补补加蒸加蒸馏馏水。水。3对对牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨进胨进行行灭灭菌的方法是菌的方法是 。计算计算称量称量溶化溶化灭菌灭菌倒平板倒平板牛肉膏牛肉膏氯氯化化钠钠高高压压蒸汽蒸汽灭灭菌法菌法第三页，讲稿共三十二页哦4倒倒平平板板是是制制备备牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨的的重重要要环环节节，下下图图为为倒倒平平板板的的操作示意操作示意图图。(1)请请用文字和箭用文字和箭头头写出正确的倒平板操作流程：写出正确的倒平板操作流程：。(2)甲、乙、丙中的甲、乙、丙中的灭灭菌方法是菌方法是 。(3)丁中的操作需要等待丁中的操作需要等待 才能才能进进行。行。丙丙乙乙甲甲丁丁灼灼烧灭烧灭菌菌平板冷却凝固平板冷却凝固第四页，讲稿共三十二页哦二、纯化大肠杆菌二、纯化大肠杆菌1接接种微生物的方法最常用的有种微生物的方法最常用的有 和和 。2下下图图中中甲甲为为平平板板划划线线法法中中最最重重要要的的环环节节，乙乙为为操操作作的的结结果果。每每一一次次划划线线后后要要将将接接种种环环 ，除除第第一一次次划划线线外外，每每一一次次划划线线的的起起点点是是 ，最最后后一一次次划划线线不不要要和和 相相连连。平板划平板划线线法法稀稀释释涂布平涂布平板法板法灼灼烧烧上一次划上一次划线线的末端的末端第一区域第一区域第五页，讲稿共三十二页哦3稀稀释释涂布平板法涂布平板法则则是将菌液是将菌液进进行一系列的行一系列的 ，然，然后将不同稀后将不同稀释释度的菌液分度的菌液分别别涂布到涂布到 的表面的表面进进行培养。只要行培养。只要 ，就能在培养基表面形成，就能在培养基表面形成单单个的菌落。个的菌落。梯度稀梯度稀释释琼琼脂固体培养基脂固体培养基稀稀释释度足度足够够高高第六页，讲稿共三十二页哦判断正判断正误误：(1)在在制制备备牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基的的过过程程中中，所所用用的的灭灭菌菌方方法法是是高高压压蒸汽蒸汽灭灭菌法菌法()(2)将培养基从干将培养基从干热灭热灭菌箱内取出立即就可以倒平板菌箱内取出立即就可以倒平板()(3)平板划平板划线线法和稀法和稀释释涂布平板法都要在固体培养基上操作涂布平板法都要在固体培养基上操作()答案答案(1)(2)(3)第七页，讲稿共三十二页哦一、培养基的制备一、培养基的制备1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤如下：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤如下：计计算：依据牛肉膏蛋白算：依据牛肉膏蛋白胨胨培养基配方比例培养基配方比例计计算配制算配制100 mL的培养基的培养基时时，各种成分的用量，各种成分的用量 称量：牛肉膏比称量：牛肉膏比较较黏稠，可用称量黏稠，可用称量纸纸称取，牛肉膏和蛋白称取，牛肉膏和蛋白胨胨都易吸潮，称取都易吸潮，称取时动时动作要迅速，称后要及作要迅速，称后要及时时盖上瓶盖盖上瓶盖 第八页，讲稿共三十二页哦第九页，讲稿共三十二页哦2注意事项注意事项天天平平称称量量时时，注注意意放放等等大大的的称称量量纸纸，防防止止牛牛肉肉膏膏粘粘在在托托盘盘上。上。在在溶溶化化时时要要用用玻玻璃璃棒棒不不断断搅搅拌拌，防防止止琼琼脂脂糊糊底底而而导导致致烧烧杯破裂。杯破裂。培培养养基基灭灭菌菌后后，需需冷冷却却至至50 左左右右时时才才能能倒倒平平板板，原原因是因是琼琼脂在脂在44 以下凝固。以下凝固。培养皿打开一条稍大于瓶口的培养皿打开一条稍大于瓶口的缝缝隙，不要完全打开。隙，不要完全打开。第十页，讲稿共三十二页哦整个操作整个操作过过程要在酒精灯火焰旁程要在酒精灯火焰旁进进行，避免行，避免杂杂菌菌污污染。染。平平板板冷冷凝凝后后要要倒倒置置的的原原因因：防防止止皿皿盖盖上上的的冷冷凝凝水水落落入入培培养养基，造成基，造成污污染。染。若若倒倒平平板板时时，培培养养基基溅溅在在皿皿盖盖和和皿皿底底之之间间的的部部位位，易易滋滋生生杂杂菌，菌，这这个平板个平板应丢应丢弃。弃。第十一页，讲稿共三十二页哦1请简请简述制述制备备牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨胨培养基培养基过过程中的几次程中的几次灭灭菌。菌。答答案案(1)对对培培养养皿皿进进行行干干热热灭灭菌菌；(2)对对制制备备成成的的培培养养基基进进行行高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌；(3)倒倒平平板板过过程程中中的的灼灼烧烧灭灭菌菌(酒酒精精灯灯火焰火焰进进行操作行操作)。第十二页，讲稿共三十二页哦2等平板冷却凝固后要将平板倒置，等平板冷却凝固后要将平板倒置，请简请简述倒置的原因。述倒置的原因。答答案案因因为为平平板板冷冷却却后后，皿皿盖盖上上会会有有凝凝结结的的水水滴滴，且且培培养养基基表表面面的的湿湿度度较较高高，平平板板倒倒置置后后，既既可可以以使使培培养养基基表表面面的的水水分分更更好好的的挥挥发发，又又可可以以防防止止皿皿盖盖上上的的水水滴滴滴滴入入培培养养基基造造成成污污染。染。第十三页，讲稿共三十二页哦1制制备备各各种种牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨固固体体培培养养基基，关关于于倒倒平平板板的的具具体体描述正确的是描述正确的是()待待培培养养基基冷冷却却至至40 左左右右时时，在在酒酒精精灯灯火火焰焰附附近近倒倒平平板板将将灭灭过过菌菌的的培培养养皿皿放放在在桌桌面面上上，左左手手拔拔出出棉棉塞塞右右手手拿拿锥锥形形瓶瓶，使使瓶瓶口口迅迅速速通通过过火火焰焰用用左左手手的的拇拇指指和和食食指指完完全全打打开开皿皿盖盖右右手手将将锥锥形形瓶瓶中中培培养养基基倒倒入入培培养养皿皿，左左手手立立即即盖盖上上培培养养皿皿的的皿皿盖盖等等待待平平板板冷冷却却510 s，将将平板倒平板倒过过来放置，使皿盖在下，皿底在上来放置，使皿盖在下，皿底在上A BC D第十四页，讲稿共三十二页哦【问题导析问题导析】(1)培培养养基基灭灭菌菌后后，需需冷冷却却至至 左左右右时时才才能能倒倒平平板板，原原因因是是琼琼脂在脂在44 以下凝固。以下凝固。(2)倒平板的倒平板的过过程要在程要在 附近附近进进行。行。50 酒精灯火焰酒精灯火焰第十五页，讲稿共三十二页哦解解析析琼琼脂脂是是一一种种多多糖糖，在在98 以以上上可可溶溶解解于于水水，在在44 以以下下凝凝固固，倒倒平平板板时时高高于于50 则则会会烫烫手手，低低于于50 时时若若不不能能及及时时操操作作，琼琼脂脂会会凝凝固固。无无菌菌操操作作应应贯贯穿穿于于操操作作的的全全过过程程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。答案答案C第十六页，讲稿共三十二页哦【一题多变一题多变】倒倒平平板板的的过过程程需需要要进进行行无无菌菌操操作作，在在培培养养基基的的制制备备过过程程中中，还还有哪些有哪些环节环节需要需要进进行无菌操作？行无菌操作？答答案案要要对对培培养养基基进进行行高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌，对对培培养养皿皿进进行行干干热热灭灭菌菌第十七页，讲稿共三十二页哦二、微生物分离与纯化技术二、微生物分离与纯化技术1原理原理微微生生物物的的分分离离与与纯纯化化就就是是将将待待检检测测微微生生物物样样品品通通过过划划线线或或涂涂布布接接种种在在固固体体培培养养基基上上，样样品品中中的的每每一一个个细细胞胞或或孢孢子子都都可可以以生生长长繁繁殖殖形形成成单单个个菌菌落落。将将单单个个菌菌落落接接种种到到斜斜面面培培养养基上，基上，经经培养后，即可得到一个微生物的培养后，即可得到一个微生物的纯纯种。种。第十八页，讲稿共三十二页哦2方法步骤方法步骤微微生物的分离包括生物的分离包括样样品稀品稀释释、划、划线线或涂布及培养三个步或涂布及培养三个步骤骤(1)梯度稀梯度稀释释操作操作(如如图图1)图图1微生物分离操作流程图微生物分离操作流程图第十九页，讲稿共三十二页哦a将将分分别别盛盛有有9 mL水水的的6支支试试管管灭灭菌菌，并并按按101106的的顺顺序序编编号。号。b用用移移液液管管吸吸取取1 mL培培养养的的菌菌液液，注注入入101倍倍稀稀释释的的试试管管中中。用用手手指指轻轻压压移移液液管管上上的的橡橡皮皮头头，吹吹吸吸三三次次，使使菌菌液液与与水水充充分分混匀。混匀。c从从101倍倍稀稀释释的的试试管管中中吸吸取取1 mL稀稀释释液液，注注入入102倍倍稀稀释释的的试试管管中中，重重复复第第2步步的的操操作作。以以此此类类推推，直直到到完完成成最最后后一一支支试试管的稀管的稀释释。注注意意：移移液液管管需需要要经经过过灭灭菌菌。操操作作时时，试试管管口口和和移移液液管管应应在在离火焰离火焰12 cm处处。第二十页，讲稿共三十二页哦(2)划划线线或涂布或涂布平平板板划划线线分分离离法法：在在近近火火焰焰处处，左左手手拿拿皿皿底底，右右手手拿拿接接种种环环，挑挑取取大大肠肠杆杆菌菌培培养养液液在在平平板板上上划划线线，常常用用的的划划线线方方法法有有平平行行划划线线和和连连续续划划线线两两种种。平平行行划划线线时时，每每转转一一个个角角度度烧烧一一次次接接种种环环。划。划线线完完毕毕后，盖上培养皿盖，做好后，盖上培养皿盖，做好标记标记。图图2划线示意图划线示意图第二十一页，讲稿共三十二页哦涂布分离法：取涂布分离法：取3个平板，底面分个平板，底面分别别用用记记号笔写上号笔写上104、105和和106三种稀三种稀释释度，然后用无菌吸管分度，然后用无菌吸管分别别吸取相吸取相应应稀稀释释度的度的稀稀释释液各液各0.1 mL，放入已，放入已标记标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面在培养基表面轻轻轻轻地涂布均匀，室温下静置地涂布均匀，室温下静置510 min，使菌，使菌液吸附液吸附进进培养基培养基(图图3)。第二十二页，讲稿共三十二页哦(3)培养培养将将划划线线或或涂涂布布接接种种的的平平板板倒倒置置于于培培养养箱箱或或温温室室中中37 培培养养1624 h，即可，即可长长出出单单菌落菌落(图图4)图图3涂布法示意图图涂布法示意图图4斜面接种法斜面接种法第二十三页，讲稿共三十二页哦(4)结结果分析果分析确确认认培养基制培养基制备备是否合格是否合格为为确确认认培培养养基基制制备备是是否否合合格格，需需设设置置对对照照实实验验，即即接接种种后后的的培培养养基基和和一一个个未未接接种种的的培培养养基基都都放放入入37 恒恒温温箱箱中中，培培养养12 h和和24 h，观观察察现现象象并并记记录录如如果果未未接接种种的的培培养养基基在在恒恒温温箱箱中中保保温温12 d后后无无菌菌落落生生长长，说说明明培培养养基基的的制制备备是是成成功功的的，否否则实验则实验失失败败需要重新制需要重新制备备。第二十四页，讲稿共三十二页哦接种操作成功的接种操作成功的标标准准如如果果培培养养基基上上生生长长的的菌菌落落的的颜颜色色、形形状状、大大小小基基本本一一致致，并并符符合合该该菌菌菌菌落落的的特特点点，则则说说明明接接种种操操作作是是符符合合要要求求的的；如如果果培培养养基基上上出出现现了了其其他他菌菌落落，则则说说明明接接种种过过程程中中无无菌菌操操作作还还未未达到要求，达到要求，实验实验失失败败，需要分析原因，再次制，需要分析原因，再次制备备。第二十五页，讲稿共三十二页哦1稀稀释释涂涂布布平平板板法法要要求求菌菌液液的的稀稀释释度度要要足足够够大大，平平板板划划线线法法要要求求连连续续多多次次划划线线，且且除除了了第第一一次次划划线线外外，每每一一次次划划线线的的起起点点是是上上一一次次划划线线的的末末端端，两两种种操操作作方方法法虽虽然然不不同同，但但目的相同，目的相同，该该目的是什么？目的是什么？答答案案目目的的是是将将菌菌种种充充分分地地分分散散，保保证证菌菌落落是是由由一一个个细细胞胞或或孢孢子繁殖而成，所子繁殖而成，所获获得的菌落中的菌种是得的菌落中的菌种是单单一的一的纯纯种。种。第二十六页，讲稿共三十二页哦2平平板板划划线线法法中中的的接接种种环环要要进进行行多多次次灼灼烧烧(取取菌菌液液前前的的灼灼烧烧、每每一一次次划划线线后后的的灼灼烧烧及及划划线线结结束束后后的的灼灼烧烧)，请请简简述述每每次次灼灼烧烧的目的。的目的。答答案案取取菌菌液液前前的的灼灼烧烧的的目目的的是是避避免免接接种种环环上上可可能能存存在在的的微微生生物物污污染染培培养养物物；每每一一次次划划线线后后的的灼灼烧烧的的目目的的是是杀杀死死上上次次划划线线结结束束后后接接种种环环上上残残留留的的菌菌种种，使使每每次次划划线线的的菌菌种种来来自自上上次次划划线线末末端端；划划线线结结束束后后的的灼灼烧烧杀杀死死接接种种环环上上残残留留的的菌种，避免菌种，避免细细菌菌污污染染环环境和感染操作者。境和感染操作者。第二十七页，讲稿共三十二页哦2下下图图中中甲甲是是稀稀释释涂涂布布平平板板法法中中的的部部分分操操作作，乙乙是是平平板板划划线线法操作法操作结结果。果。第二十八页，讲稿共三十二页哦下列叙述中，下列叙述中，错误错误的是的是()A甲甲图图中的涂布前要将涂布器灼中的涂布前要将涂布器灼烧烧，冷却后才能取菌液，冷却后才能取菌液B对对于于浓浓度度较较高高的的菌菌液液，如如果果甲甲中中的的稀稀释释倍倍数数仅仅为为102，则则所得的菌落不是由所得的菌落不是由单单一的一的细细胞或胞或孢孢子繁殖而成子繁殖而成C乙中培养皿中所得的菌落都符合要求乙中培养皿中所得的菌落都符合要求D乙中的乙中的连续连续划划线线的起点是上一次划的起点是上一次划线线的末端的末端第二十九页，讲稿共三十二页哦【问题导析问题导析】(1)对对菌菌液液进进行行稀稀释释时时，如如果果菌菌液液中中的的菌菌体体的的浓浓度度越越高高，则则稀稀释释的的倍倍数数也也要要 ，菌菌体体的的浓浓度度很很低低，则则稀稀释释的的倍倍数数不不必必 。(2)高高温温会会杀杀死死菌菌体体，所所以以一一些些经经过过高高温温或或灼灼烧烧灭灭菌菌的的器器材材需要需要 后才能接触菌种。后才能接触菌种。(3)平平板板划划线线法法中中的的多多次次划划线线中中，菌菌体体的的 ，即即不不同同划划线线处处的的 不不同同，所所以以形形成成的的菌菌落落并并非非全全部部是是由由单单个菌体繁殖而成的。个菌体繁殖而成的。越高越高太高太高冷却冷却越来越少越来越少菌体数目菌体数目第三十页，讲稿共三十二页哦解解析析灼灼烧烧后后的的接接种种环环如如果果没没有有冷冷却却就就接接触触菌菌种种，会会将将菌菌体体杀杀死死，A正正确确。稀稀释释倍倍数数过过低低，会会导导致致多多个个菌菌体体聚聚集集在在一一起起繁繁殖殖成成菌菌落落，B正正确确。平平板板划划线线法法中中最最后后一一次次划划线线的的末末端端处处形形成成的的菌菌落落才才是是由由单单一一的的细细胞胞或或孢孢子子繁繁殖殖而而成成，这这种种菌菌落落才才符符合合要要求求，C错错误误。连连续续划划线线中中，除除了了第第一一次次划划线线外外，每每一一次次划划线线的的起起点点是是上上一一次次划划线线的的末末端端，目目的的是是使使得得菌菌体体密密度度越越来来越越小小，保保证证最最后后划划线线末末端端处处的的菌菌落落是是由由单单一一的的细细胞胞或或孢孢子子繁殖而成。繁殖而成。答案答案C第三十一页，讲稿共三十二页哦【一题多变一题多变】1两两种种接接种种方方法法中中，如如果果操操作作均均正正确确无无误误，只只有有稀稀释释涂涂布布平平板板法法才才适适合合对对细细菌菌进进行行计计数数而而平平板板划划线线法法不不能能，请请简简述述原因。原因。答答案案只只要要稀稀释释倍倍数数足足够够高高，则则稀稀释释涂涂布布平平板板法法中中形形成成的的每每个个菌菌落落是是由由单单一一菌菌体体变变成成，即即一一个个肉肉眼眼看看不不见见的的细细菌菌对对应应着着一一个个可可以以看看见见的的菌菌落落，可可以以通通过过统统计计菌菌落落的的数数目目推推测测出出细细菌菌的的数数目目。而而平平板板划划线线法法中中除除了了最最后后一一次次划划线线末末端端处处的的菌菌落落是是由由单单一一的的细细菌菌繁繁殖殖而而成成，其其他他每每个个菌菌落落往往往往是是由由多多个个细细菌菌一一起起繁繁殖殖而而成成，即即一一个个菌菌落落并并非非对对应应着着一一个个细细菌菌，所以不适合用于所以不适合用于细细菌的菌的计计数。数。第三十二页，讲稿共三十二页哦