微生物学显微镜油镜的使用和细菌形态的观察讲稿.ppt

微生物学显微镜油镜的微生物学显微镜油镜的使用和细菌形态的观察使用和细菌形态的观察第一页，讲稿共二十六页哦一、实验目的一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法；掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。第二页，讲稿共二十六页哦二、实验材料二、实验材料 1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘碘液、液、95乙醇、复红染色液乙醇、复红染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸纸第三页，讲稿共二十六页哦三、三、显微镜及油镜使用显微镜及油镜使用原理原理（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜构构造造（p.23-27）1.光学部分光学部分:接目镜接目镜接目镜接目镜 、接物镜接物镜接物镜接物镜 、照明装置照明装置照明装置照明装置(聚光镜、聚光镜、聚光镜、聚光镜、虹彩光圈、虹彩光圈、虹彩光圈、虹彩光圈、反光镜等反光镜等反光镜等反光镜等)。它使检视物放大它使检视物放大它使检视物放大它使检视物放大,造成造成造成造成物象。物象。物象。物象。2.机械部分机械部分:镜座、镜臂、镜筒、镜座、镜臂、镜筒、镜座、镜臂、镜筒、镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移物镜转换器、载物台、载物台转移物镜转换器、载物台、载物台转移物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。器、粗调节器、细调节器等部件。器、粗调节器、细调节器等部件。器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。它起着支持、调节、固定等作用。它起着支持、调节、固定等作用。它起着支持、调节、固定等作用。第四页，讲稿共二十六页哦图图1-1-2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理倒立的虚像倒立的虚像第五页，讲稿共二十六页哦n n1.1.放大倍数放大倍数放大倍数放大倍数=接物镜放大倍数接物镜放大倍数接物镜放大倍数接物镜放大倍数 接目接目接目接目镜放大倍数镜放大倍数镜放大倍数镜放大倍数 2.2.显微镜的分辨率显微镜的分辨率显微镜的分辨率显微镜的分辨率 是表示显微镜是表示显微镜是表示显微镜是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的辨析物体（两端）两点之间距离的辨析物体（两端）两点之间距离的辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：能力，可用公式表示为：能力，可用公式表示为：能力，可用公式表示为：D=0.61/nSin/2D=0.61/nSin/2n n式中式中式中式中D D D D：物镜分辨出物体两点间的最物镜分辨出物体两点间的最物镜分辨出物体两点间的最物镜分辨出物体两点间的最短距离。短距离。短距离。短距离。：可见光的波长（可见光的波长（可见光的波长（可见光的波长（平均平均平均平均0.550.550.550.55 m)m)m)m)n:n:n:n:物镜和被检标本间介质的折射率。物镜和被检标本间介质的折射率。物镜和被检标本间介质的折射率。物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。：镜口角（即入射角）。：镜口角（即入射角）。：镜口角（即入射角）。显微镜的放大倍数和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰第六页，讲稿共二十六页哦（二）油镜使用的原理（二）油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线油镜，即油浸接物镜。当光线油镜，即油浸接物镜。当光线油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间由反光镜通过玻片与镜头之间由反光镜通过玻片与镜头之间由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的的空气时，由于空气与玻片的的空气时，由于空气与玻片的的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，密度不同，使光线受到曲折，密度不同，使光线受到曲折，密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明发生散射，降低了视野的照明发生散射，降低了视野的照明发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油度。若中间的介质是一层油度。若中间的介质是一层油度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近其折射率与玻片的相近其折射率与玻片的相近其折射率与玻片的相近），），），），则几乎不发生折射，增加了视则几乎不发生折射，增加了视则几乎不发生折射，增加了视则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加野的进光量，从而使物象更加野的进光量，从而使物象更加野的进光量，从而使物象更加清晰。清晰。清晰。清晰。u根据公式根据公式D=0.61/nSin/2D=0.61/nSin/2，增大分母，使得，增大分母，使得D值减小，值减小，分辨率增大。分辨率增大。第七页，讲稿共二十六页哦1.1.1.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。以免损坏。以免损坏。2.2.2.2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.3.3.3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。碎玻片或损伤镜面。碎玻片或损伤镜面。碎玻片或损伤镜面。4.4.4.4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。拿，更不可倾斜拿。拿，更不可倾斜拿。拿，更不可倾斜拿。5.5.5.5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头；第三遍再用干净的擦油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头；第三遍再用干净的擦油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头；第三遍再用干净的擦油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头；第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的二甲苯。镜纸擦去多余的二甲苯。镜纸擦去多余的二甲苯。镜纸擦去多余的二甲苯。6 6 6 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片镜片镜片镜片。（三）显微镜保养和使用中的注意事项（三）显微镜保养和使用中的注意事项第八页，讲稿共二十六页哦三三.显微镜油镜观察操作方法显微镜油镜观察操作方法 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后将油镜在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏油滴加香柏油，从侧面注，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到最合适的观察点。调节器调节，在目镜下找到最合适的观察点。第九页，讲稿共二十六页哦p油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭去镜油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。残留的二甲苯。第十页，讲稿共二十六页哦一、实验目的一、实验目的 进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初步认识细进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初步认识细菌的基本形态和特殊结构特征菌的基本形态和特殊结构特征四、四、细菌形态的观察细菌形态的观察第十一页，讲稿共二十六页哦二、观察内容二、观察内容基本形态：杆菌，球菌基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、排（注意大小、染色性、排列）列）特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，再仔（先找到菌体，再仔细观察特殊结构）细观察特殊结构）以画图的方式完成该实验的报告以画图的方式完成该实验的报告第十二页，讲稿共二十六页哦图下标示：图下标示：1 1、菌种：杆菌（大肠、菌种：杆菌（大肠杆菌，杆菌，G G-）2 2、放大倍数放大倍数3 3、观察方法、观察方法画图注意事项：画图注意事项：1 1、以圆圈表示视野、以圆圈表示视野 2 2、注意菌体大小比例合适、注意菌体大小比例合适 3 3、标出菌体颜色，显示典型排列方式、标出菌体颜色，显示典型排列方式 4 4、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置第十三页，讲稿共二十六页哦五、革兰氏染色五、革兰氏染色（一）、实验目的（一）、实验目的学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术第十四页，讲稿共二十六页哦（二二）、革兰氏染色的工作原理革兰氏染色的工作原理革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢的革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。菌都呈现阴性反应。第十五页，讲稿共二十六页哦根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结构根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结构差异来达到染色的目的的。差异来达到染色的目的的。先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝紫先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝紫色；色；然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫碘复合物，从而碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。增强了染料与细菌的结合力。然后再用乙醇脱色处理然后再用乙醇脱色处理第十六页，讲稿共二十六页哦经典法，四步法经典法，四步法（p.30-32）第十七页，讲稿共二十六页哦由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫碘不易碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染剂的颜色（红色）。碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染剂的颜色（红色）。第十八页，讲稿共二十六页哦（三）（三）、实验操作、实验操作n np.3p.31 1，采用三区涂片法，采用三区涂片法，采用三区涂片法，采用三区涂片法n n步骤：步骤：步骤：步骤：n n1 1、在玻片的左右端各加、在玻片的左右端各加、在玻片的左右端各加、在玻片的左右端各加1 1滴水，用无菌接种环挑少量滴水，用无菌接种环挑少量滴水，用无菌接种环挑少量滴水，用无菌接种环挑少量金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有金黄色葡金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有金黄色葡金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有金黄色葡金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有金黄色葡萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。n n2 2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混合、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混合、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混合、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆菌菌液延伸至玻成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆菌菌液延伸至玻成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆菌菌液延伸至玻成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合成含有两种细菌的混合区。片中央，与金黄色葡萄球菌混合成含有两种细菌的混合区。片中央，与金黄色葡萄球菌混合成含有两种细菌的混合区。片中央，与金黄色葡萄球菌混合成含有两种细菌的混合区。第十九页，讲稿共二十六页哦（四）（四）、革兰氏染色的操作方法、革兰氏染色的操作方法无菌操作无菌操作涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检第二十页，讲稿共二十六页哦大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌第二十一页，讲稿共二十六页哦（1 1）涂片：）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平板先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平板上取一小环培养上取一小环培养2424小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体于生理盐水中涂片，（分别于斜面上挑取少许菌苔于体于生理盐水中涂片，（分别于斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。布均匀。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚第二十二页，讲稿共二十六页哦载玻片水滴菌体涂片第二十三页，讲稿共二十六页哦（2 2）干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。（3 3）涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体。固定时通过火焰涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体。固定时通过火焰1212次即次即可。可。染色前必须固定细菌，其目的是：染色前必须固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原有的形态。二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原有的形态。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。（4 4）初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染1-21-2分分钟钟minmin，水洗。，水洗。（5 5）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min1min，水洗。，水洗。第二十四页，讲稿共二十六页哦（6 6）脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，用用9595酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030s2030s，立即用水冲净酒精。，立即用水冲净酒精。注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。色过度，阳性菌被误染成阴性菌。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩甩去细胞去细胞上的残水，以免染色液被稀释。上的残水，以免染色液被稀释。第二十五页，讲稿共二十六页哦（7 7）复染：用番红液染复染：用番红液染12min,12min,水洗。水洗。（8 8）镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先在低倍镜，镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阳性菌呈紫色。注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。细菌，常常呈假阳性。（9 9）显微镜用毕后的处理（显微镜用毕后的处理（p.2p.26 6）油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但二油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但二甲苯量不可过多！甲苯量不可过多！第二十六页，讲稿共二十六页哦