实时荧光定量PCR原理.docx
实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反响体系中加入荧光基团，利用荧光信号积 累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1 . Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念- Ct值。C代表Cycle”代表threshold, Ct值的含义是：每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。2 .荧光域值(threshold)的设定PCR反响的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3.15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold =10, SDcycle 3-15. Ct值与起始模板的关系研究说明，每个模板的Ct值与该模板的起始接见药的对数存在线性关系，起始拷贝数 越多，Ct值越小。利用起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷 贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出 该样品的起始拷贝数。3 .荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述 如下： 1) TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光 探针，该探针为一寡核甘酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完 整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3,外切酶活性 将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团别离，从而荧光监测系统可接收到荧光信 号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因 突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2) SYBR荧光染料：在PCR反响体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保 证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。内标在传统定量中的意义.几种传统定量PCR方法简介：1)内参照法：在不同的PCR反响管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法 合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相别离开来，分 别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2)竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反响管中，待测样品与竞争模板用同一对 引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的 产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分 别测定荧光强度，根据模板推测未知模板的起始拷贝数。 3) PCR-ELISA法：利 用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或 生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只 是定性实验，假设加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。1 .内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期 扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所 得结果有很大差异(见图4),因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后, 可局部消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定 量、粗略定量的方法。内标对荧光定量PCR的影响.实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循 环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算，根 据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1) Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对 数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一 时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2) Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时 荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。1 .内标对实时荧光定量PCR的影响假设在待测样品中加入起始拷贝数的内标，那么PCR反响变为双重PCR,双重PCR反 应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比拟大时，这种竞 争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已 知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的 方法。 美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比拟，得 出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种 准确的、值得信赖的科学方。Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外 标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基 因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。荧光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，西安天隆生产的国产实 时荧光定量PCR仪为肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、同时也为沙门氏 菌阪崎氏肠杆菌等食品平安检测提供了先进手段。即使在兴旺国家，荧光定量PCR仪和堇 因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其极高的灵敏度、极宽的检测范围， 以及精确定量、方便快速、无窗口期等优点，美国FDA及我国国家标准已将定量PCR仪规 定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品平安检测的必备仪器。实时荧光定量PCR仪(real-time qPCR)的创造实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞 跃。
