生物化学实验课程教案(1).doc

生物化学 实验课程教案（ 1 ）实验题目 实验一 氨基酸的分离与鉴定滤纸层析法实验学时6 实验目的（1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。（2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。实验原理滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响Rf值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。实验仪器新华中速薄层析滤纸，层析缸，鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样毛细管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮手套。实验材料（1）展层剂：将正丁醇和乙酸以体积比4:1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5:3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。（2）氨基酸溶液：0.5%（m/V）赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组分均为0.5%）。（3）显色剂：0.1%（m/V）水合茚三酮正丁醇溶液。实验内容与实施过程备 注一、滤纸的剪裁选用国产新华1号滤纸，剪裁成22cm×14cm，在滤纸的一端距边缘2.0cm处用铅笔轻轻划线，在线上每间隔3cm作一记号。 二、点样将准备好的滤纸平放在干净的玻璃板上。用定量点样毛细管准确吸取样品到某一刻度，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，点子的扩散直径控制在0.5cm以内。点样过程中必须在第一点样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可用电吹风机吹干，注意温度不宜过高，避免破坏氨基酸，影响定量结果。将点好样品的滤纸两侧边缘比齐，用线缝好，揉成筒状(图1.2)。注意缝线处纸的两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。 图1.2 图1.3 三、展层将圆筒状的滤纸放入结晶皿，注意滤纸不要与皿壁接触，皿周围放3个小烧杯，内盛平衡溶剂，盖好盖子，平衡1h后打开盖子少许，用移液管（管下端接触到结晶皿底部）加入层析溶剂（展层剂），取出移液管时勿使它碰纸。当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前缘位置，用吹风机凉风吹干。双向层析溶剂系统：四、定性鉴定把已经除去溶剂的层析滤纸用茚三酮丙酮溶液在纸的一面均匀喷雾，待自然晾干后，用铅笔轻轻描出显色斑点的形状。用一直尺量度每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得该氨基酸的Rf值。应该注意的是，使用茚三酮显色法，在整个层析操作中，避免用手接触层析纸，因手上常有少量含氨物质，在显色时也得出紫色斑点，污染层析结果，因此，在操作过程中应戴手套或指套。同时也要防止空气中氨的污染。一种氨基酸在同样条件下，其Rf值是一个常数，因此，将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，即可得知该斑点是哪一种氨基酸。实验作业实验结果：计算标准氨基酸的Rf值，并分析未知样品课后思考题：1做好本实验的关键是什么？2实验操作过程，为何不能用手接触滤纸？3影响Rf值的因素有哪些？参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结1、氨基酸样品不能放置时间太长，容易变质。2、展层溶液要现配现用。3、结果图需要当时照相。 生物化学 实验课程教案（ ）实验题目 实验二 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验学时4 实验目的（1）学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术。（2）了解区带电泳技术的基本原理。（3）测定人血清中各种蛋白质的相对含量。实验原理醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，厚度为120m。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：电泳后区带界限清晰；通电时间较短（二十分钟至一小时）；它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。 本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次是1、2、球蛋白。实验仪器醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔实验材料巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏水50ml；洗脱液0.4molLNaOH；透明液；无水乙醇：冰醋酸7：3；人血清。实验内容与实施过程备 注1、 仪器与薄膜的准备（1）醋酸纤维薄膜的选择与润湿用镊子取一片薄膜，在距醋纤膜一端1.5cm用铅笔作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在1530秒内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此薄膜均匀可以用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹或斑点，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30分钟，当完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，方可用于电泳。（2）电泳槽的准备（如下图）将电泳槽置于水平平台上，将缓冲液注入电泳槽中，两边的电极槽缓冲液的高度要在同一平面。根据电泳槽支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个膜支架上,各放2层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。2、 点样将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下，点样前应在滤纸上反复练习，此步是实验的关键，掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30分钟后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）， 再在膜条一端23厘米处轻轻水平落下并随即提起，使血清完全深透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。3、 电泳用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上，点样面朝下，另一端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行,则图谱不整。膜条与滤纸桥之间压严,使膜条绷直,中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距13mm ,使之不互相接触,以免相互干扰。盖严电泳室,平衡10分钟后方可通电,否则分离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V，电流强度0.40.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。4、染色 电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液510分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。5、漂洗 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。6、透明将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有气泡。干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。实验作业实验结果：得到电泳图谱，并分析条带。课后思考题：1、 为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？2、 用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结1、 电极缓冲液不动，可电泳2次，若正负混合再电泳可用4次以上。2、 点样只点一次，点样量千万不能大。3、 电泳仪使用方法：电流最大默认恒压，电压最大默认恒流。 生物化学 实验课程教案（ 3 ）实验题目 实验三 蛋白质的性质实验蛋白质及氨基酸的呈色反应实验学时2 实验目的（1）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。（2）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。实验原理双缩脲反应尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。茚三酮反应除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，11 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。黄色反应含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。乙醛酸反应在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。实验仪器试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。实验材料尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；大豆提取液；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。实验内容与实施过程备 注双缩脲反应实验操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。茚三酮反应实验操作取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。黄色反应实验操作向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4大豆提取液4指甲少许头发少许0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象乙醛酸反应实验操作试剂管号水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白质溶液（滴）冰醋酸（ml）浓硫酸（ml）现 象1-521241-2135-21 取3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约1毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热。实验作业实验结果：各种反应的结果，颜色变化情况。课后思考题：1.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。2.你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。3.能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？4.哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结1、 乙醛酸反应中的浓硫酸需要新开口的。2、 硝化反应需要加热。3、 乙醛酸反应结果颜色与预期的不一样。 生物化学 实验课程教案（ 4 ）实验题目实验四 蛋白质的变性、沉淀反应实验学时3 实验目的（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。（3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。实验原理在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。（1）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。蛋白质的盐析：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。（2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。实验仪器试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。实验材料0.2%鸡蛋清溶液；pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；3%硝酸银溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；饱和硫酸铵溶液；硫酸铵结晶粉末；0.1 mol·L-1盐酸溶液；0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液；0.05 mol·L-1碳酸钠溶液；0.1 mol·L-1醋酸溶液；甲基红溶液；2%氯化钡溶液；10%NaOH；饱和的NaCl；10%醋酸。实验内容与实施过程备 注1盐析：加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？3某些有机酸沉淀蛋白质：取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加1 ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。4加热沉淀蛋白质：取5支试管，编号。依下表顺序加入试剂：试剂管号蛋清蛋白质（滴）0.1mol/L醋酸（滴）10%醋酸（滴）饱和的NaCl（滴）10%NaOH（滴）蒸馏水（滴）110-72105-5310-5-5410-52-510-25 将各管混匀，观察记录各管情况，然后，放沸水浴中加热10min，注意观察各管的沉淀情况，最后将第3、4、5号管分别用10%NaOH或10%醋酸中和，观察并解释实验结果。5乙醇引起的变性与沉淀：取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 试剂（ml）管号5%卵清蛋白溶液0.1 mol·L-1氢氧化钠溶 液0.1 mol·L-1盐酸溶液95%乙醇pH4.7缓冲溶液123111111111振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 mol·L-1醋酸溶液及0.05 mol·L-1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 mol·L-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。实验作业实验结果：分析实验结果，并说明变性和沉淀的关系。课后思考题：1鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？2氯化汞为何能做为杀菌剂？参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结乙醇引起的蛋白质变性中，卵清蛋白需要加量，水的量需要减少。 生物化学 实验课程教案（ 5 ）实验题目实验五 凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验学时4 实验目的学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操作技术实验原理凝胶过滤也称凝胶层析，其分离纯化物质的原理是，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量被分开了。此法可用于测定蛋白质的分子质量、样品的浓缩和脱盐等方面。目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它是葡萄糖通过-1，6-糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交连而成的具有三维空间的多孔网状结构物，呈珠状颗粒。实验仪器铁架台；层析柱；滴定管夹；刻度离心管；白瓷板；细乳胶管 ；螺旋夹 ；烧杯;紫外检测仪；部分收集器；层析柱；恒流泵。实验材料Sephadex G-25（粒度粗，50100目）；10% 磺柳酸；纳氏试剂（萘斯特试剂）；蛋白质(NH4)2SO4溶液；无离子水（洗脱液）实验内容与实施过程备 注1. 溶胀凝胶：用去离子水浸泡Sephadex G-25凝胶24h以上（中间换一次水）或用去离子水沸水浴溶胀2h左右。2. 凝胶装柱：按实验教程要求安装层析装置，将溶胀好的SephadexG-25装入层析柱中。3. 洗柱：接通洗脱液，按要求洗柱并调整好流速。4. 加样洗脱：吸取1ml样品（蛋白质硫酸铵溶液），小心地加到床面上，拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。5. 收集检查：每管收集1ml洗脱液。取洗脱液2滴加入白瓷板穴中，加入纳氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。取洗脱液2滴置小试管中，加入磺柳酸1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。实验作业实验结果：作出洗脱曲线图。课后思考题：1. 利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？3. 蛋白质溶液中的盐分为何能通过凝胶过滤方法被脱除？4. 凝胶过滤法在蛋白质分析中还有何应用？参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结1、 铵离子的洗脱曲线效果较差。2、 Sephadex G-50用于分离牛血清白蛋白中的铵离子是可行的。 生物化学 实验课程教案（ 6 ）实验题目实验六    酵母RNA的分离及组分鉴定 实验学时4 实验目的(1)学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。(2)了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。实验原理    酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。    核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。实验仪器1乳钵    2150mL锥形瓶    3水浴    4量筒    5布氏漏斗及抽滤瓶   6吸管    7滴管    8试管及试管架    9烧杯    10离心机    11漏斗。实验材料1004 molL氢氧化钠溶液           1000 mL2酸性乙醇溶液                        500mL将03毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。395乙醇                            1000mL4乙醚                                 500 mL515 molL硫酸溶液                 200mL6浓氨水                              50 mL701 molL硝酸银溶液               50mL8氯化铁浓盐酸溶液                   80mL将2mLl0三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。9苔黑酚乙醇溶液                    10 mL溶解6g苔黑酚于100mL 95乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。10定磷试剂                           50mL（1）17硫酸溶液  将17 mL浓硫酸(比重184)缓缓加入到83mL水中。（2）25钼酸铵溶液  将25g钼酸铵溶于100mL水中。（3）10抗坏血酸溶液  10 g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17硫酸溶液:2.5钼酸铵溶液:10抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(VV)。11酵母粉    200 g实验内容与实施过程备 注1、 提取将15 g酵母悬浮于90 mL 0.04 molL氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3 000rmin)15分钟，将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000rmin)3分钟。弃去清液。用95乙醇洗涤沉淀两次，乙醚 洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。取200nag提取的核酸，加入15 molL硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟2、 制成水解液并进行组分的鉴定（1）嘌呤碱  取水解液1 mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 01 molL硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（2）核糖  取1支试管加人水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液02 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。（3）磷酸  取1支试管，加入水解液1 mL和定磷试剂I mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。实验作业实验结果：制备并观察RNA干粉；写出RNA组分定性分析结果。课后思考题：1如何得到高产量RNA的粗制品?2本实验RNA组分是什么?怎样验证的?参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结1、 戊糖和磷酸定性鉴定中需要加热。2、 定磷试剂需现配现用。3、 离心机cd47调转速，cd59调时间。 生物化学 实验课程教案（ 7 ）实验题目实验七 血糖含量的测定（Folin-Wu法）实验学时4 实验目的（1）理解血糖在生物体内的重要意义。（2）掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。实验原理1.血糖指的是血液中哪一种糖？葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。2.用什么方法测定？测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。实验仪器分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）。实验材料1、标准葡萄糖溶液（1）1%（m/V）葡萄糖母液 称取葡萄糖1.0g，溶于蒸馏水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。（2）标准葡萄糖溶液 用移液管吸取1%葡萄糖母液1.0ml，放入100ml容量瓶内，然后定容至刻度。2、碱性硫酸铜溶液（A、B液）（1）A液：称取无水碳酸钠35.0g，酒石酸钠13.0g及碳酸氢钠11.0g，用蒸馏水溶解，然后用1000ml容量瓶定容至刻度。（2）B液：称取硫酸铜5.0g，用蒸馏水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。碱性硫酸铜（现配现用） 取A液25ml,B液5ml，混合后，再用A液定容至50ml，摇匀。该混合液在4冰箱里可保存数日，如果暴露于阳光下，数小时即失效。3、酸性钼酸盐溶液 称取钼酸钠104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静置数小时。置于1000ml容量瓶中，缓慢加入85%（V/V）H3PO4225ml，边加边摇匀。再加入25%（V/V）硫酸150ml，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸75ml，摇匀，加蒸馏水稀释至1000ml，贮存于棕色瓶中。4、10（m/V）钨酸钠溶液5、0.33mol/L硫酸溶液6、动物血（家兔心脏取血）实验内容与实施过程备 注1.无蛋白血滤液的制备先在烧杯中加0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血10ml放入烧杯，振荡摇匀。用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入20ml锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红色透明时加10钨酸钠1ml，摇匀，再加 0.33mol/L 硫酸，随加随摇，加完放置515min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。2.血糖的测定取具25ml刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却，各加入4ml酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于420440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。3.计算按下式计算100ml全血中所含的血糖质量（mg）。mA1×C0÷A0÷0.1×100式中：m：100ml血中所含的糖质量C0：标准葡萄糖溶液浓度A1：样品溶液吸光度A0：标准溶液吸光度六、注意事项1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应少于1min。2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入10硫酸12滴，待变为暗棕色后再滤。 3.血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验结果可能偏高20%30%。实验作业实验结果：计算出兔心脏血中还原糖的含量。课后思考题：1移液管使用时应注意哪些问题?2全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质?参考资料（含参考文献、期刊、杂志等）刘箭生物化学实验教程实验总结1、 碱性硫酸铜需现配现用。2、 实验结果偏高是因为血液中除了葡萄糖还有其它还原性的糖。 生物化学 实验课程教案（ ）实验题目实验八 脂肪酸的-氧化实验学时5 实验目的（1）了解脂肪酸的-氧化；（2）通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定-氧化的方法及原理。实验原理根据-氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成-羟丁酸。乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：2NaOH+I2NaIO+NaI+H2OCH3COCH3+3NaOICHI3+CH3COONa+2NaOH                  碘仿                剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。NaOI+NaI+2HClI2+2NaCI+H2O   I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。实验仪器恒温水浴、微量滴定装置、解剖用具、玻璃器皿等。（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）。实验材料1、0.5%（m/V）淀粉溶液 2、0.9%（m/V）NaCl溶液3、0.5mol/L丁酸溶液 4、15%三氯乙酸溶液 5、10%氢氧化钠溶液 6、10%盐酸溶液 7、0.1mol/L碘溶液 称取碘12.7g和KI25g，溶于蒸馏水中，稀释到1000ml，混匀，用标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定。8、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液 临用时将已标定的标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液稀释成标准0.01mol/L。9、1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液1/15 mol/LNa2HPO4溶液86.8ml与1/15 mol/LNaH2PO4溶液13.2ml混合。实验内容与实施过程备 注1、肝糜制备（1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用0.9%NaCl溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。（2）称取肝组织5g置研钵中，加少量0.9%NaCl溶液，研磨成细浆。再加0.9%NaCl溶液至总体