第八章 人体健康优秀课件.ppt

第八章 人体健康第1页，本讲稿共47页几种重大疾病几种重大疾病癌症癌症心血管疾病：高血压、动脉粥样硬化（冠心血管疾病：高血压、动脉粥样硬化（冠心病）心病）艾滋病艾滋病传染性疾病：肝炎、肺结核、流感传染性疾病：肝炎、肺结核、流感第2页，本讲稿共47页癌症癌症化学致癌物：占化学致癌物：占80以上以上放射性物质放射性物质病毒病毒第3页，本讲稿共47页原癌基因原癌基因是一些与调节和控制细胞生长、是一些与调节和控制细胞生长、分裂和细胞周期相关的基因。原癌基因的分裂和细胞周期相关的基因。原癌基因的结构变化或者失控就会演变成癌基因。结构变化或者失控就会演变成癌基因。原癌基因的结构变化或者失控就会演变成原癌基因的结构变化或者失控就会演变成癌基因。癌基因。抑癌细胞抑癌细胞：编码防止细胞无节制分裂的蛋：编码防止细胞无节制分裂的蛋白的基因。白的基因。第4页，本讲稿共47页一、非特异性防御及淋巴系统一、非特异性防御及淋巴系统人体对病原体侵害的防御共设置了三道防线。（1）皮肤、口腔、鼻腔、消化道与呼吸道中的黏膜及其分泌物等构成了第一道防线第一道防线。第一道防线对病原体不具有选择性或特异性，因此称为非非特异性防御特异性防御。第5页，本讲稿共47页（2）部分侵入到组织或细胞内的病原体还会）部分侵入到组织或细胞内的病原体还会受到人体内特殊免疫细胞与化学成分的抵受到人体内特殊免疫细胞与化学成分的抵御和攻击，吞噬作用、抗菌蛋白和炎症反御和攻击，吞噬作用、抗菌蛋白和炎症反应等构成了人体抵御病原体入侵的应等构成了人体抵御病原体入侵的第二道第二道防线。防线。这些特殊的免疫细胞与化学成分一般都是这些特殊的免疫细胞与化学成分一般都是淋巴系统的组成部分。淋巴系统的组成部分。第6页，本讲稿共47页人体的淋巴系统是各种免疫细胞协同作用的网状系统，它们由淋巴管、淋巴结和包括胸腺、骨髓、脾脏和扁桃体等器官共同组成。第7页，本讲稿共47页在人体及哺乳动物中最重要的一类非特异性防御细胞在人体及哺乳动物中最重要的一类非特异性防御细胞是是白细胞。白细胞。它们既可存在于它们既可存在于血管血管中，又可分布于中，又可分布于组织液组织液中。中。巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞是是3 3种具有非种具有非特异性防御作用的白细胞。特异性防御作用的白细胞。第8页，本讲稿共47页巨噬细胞巨噬细胞由单核细胞（一种吞噬性白细胞）特化而由单核细胞（一种吞噬性白细胞）特化而来，细胞内富含来，细胞内富含溶酶体，溶酶体，可以通过其伸展可以通过其伸展出的伪足捕捉细菌和病毒。出的伪足捕捉细菌和病毒。巨噬细胞可以通过其伸展出的伪足捕捉细菌第9页，本讲稿共47页中性粒细胞中性粒细胞吞噬受感染组织中的细菌和病吞噬受感染组织中的细菌和病毒毒释放出杀死细菌的其他化学物释放出杀死细菌的其他化学物质质第10页，本讲稿共47页自然杀伤细胞自然杀伤细胞不直接攻击入侵的微生物不直接攻击入侵的微生物通过增加质膜的通透性来杀死受通过增加质膜的通透性来杀死受到病毒感染的细胞到病毒感染的细胞第11页，本讲稿共47页人体非特异性防御系统中抗菌蛋白可以直接攻击细菌和病毒，阻碍其复制。例：干扰素的作用机理研究发现，这种抗菌蛋白的短期免疫作用对于抵御引起流感和普通感冒的病毒比较有效。第12页，本讲稿共47页干扰素（干扰素（IFN）1957年年Isaacs和和Indemann用灭活的流感病毒作用用灭活的流感病毒作用于鸡胚后，可使细胞产生一种干扰病毒繁殖的可溶于鸡胚后，可使细胞产生一种干扰病毒繁殖的可溶性物质，并将这种物质命名为干扰素性物质，并将这种物质命名为干扰素最早被发现最早被发现研究最多研究最多第一个被克隆第一个被克隆第一个用于临床治疗第一个用于临床治疗干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。第13页，本讲稿共47页干扰素的分类干扰素的分类INF-INF-INF-INF-INF-INF-INF-INF-INF-INF-2525个亚型个亚型4 4个亚型个亚型4 4个亚型个亚型1b1b2a2a氨基酸序列氨基酸序列个别氨基酸差异个别氨基酸差异第14页，本讲稿共47页三种主要干扰素比较三种主要干扰素比较INF-INF-INF-INF-INF-INF-位置位置9 9号号9 9号号1212号号基因产基因产物大小物大小188-189 Aa188-189 Aa187 Aa187 Aa166 Aa166 Aa成熟产成熟产物大小物大小165-166 Aa165-166 Aa166 Aa166 Aa143 Aa143 Aa主要产主要产生细胞生细胞白细胞、白细胞、B B淋巴淋巴细胞、成纤维细胞、成纤维细胞、肿瘤细细胞、肿瘤细胞胞成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、胚胎细胞、羊膜细胞、细胞、羊膜细胞、上皮细胞、肿瘤细上皮细胞、肿瘤细胞胞活化活化T T细细胞、胞、NKNK细细胞胞 第15页，本讲稿共47页干扰素生物学活性干扰素生物学活性抑制病毒等细胞内微生物的增殖抑制病毒等细胞内微生物的增殖抗细胞增殖抗细胞增殖通过作用于巨噬细胞、通过作用于巨噬细胞、T淋巴细胞、淋巴细胞、B淋巴淋巴细胞而进行免疫调节细胞而进行免疫调节改变细胞表面的状态，使负电荷增多，组改变细胞表面的状态，使负电荷增多，组织相容性抗原表达增加织相容性抗原表达增加增加细胞对双链增加细胞对双链DNA的敏感性的敏感性第16页，本讲稿共47页干扰素的用途干扰素的用途病毒性疾病病毒性疾病：普通感冒、疱疹性角膜炎、带：普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎恶性肿瘤恶性肿瘤：成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓：成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、鼻咽癌等，可获得部分缓解鼻咽癌等，可获得部分缓解用于病毒引起的良性肿瘤，控制疾病发展用于病毒引起的良性肿瘤，控制疾病发展第17页，本讲稿共47页重组干扰素重组干扰素国外：国外：19861986年年 rHuIFN-rHuIFN-2a2a和和rHuIFN-rHuIFN-2b2b上市上市19901990年年 rHuIFN-rHuIFN-上市上市19931993年年 rHuIFN-rHuIFN-上市上市国内：国内：19891989年申报，年申报，19931993年试生产年试生产rHuIFN-rHuIFN-1b1b同期，同期，rHuIFN-rHuIFN-2a 2a 和和rHuIFN-rHuIFN-批准上市批准上市第18页，本讲稿共47页中国上市的主要重组干扰素剂型中国上市的主要重组干扰素剂型IFN-IFN-2a2a福康泰（长春生物制品研究所）福康泰（长春生物制品研究所）莱福隆（长生药业）莱福隆（长生药业）迪恩安（辽宁生物制品研究所）迪恩安（辽宁生物制品研究所）因特粉（沈阳三生制药公司）因特粉（沈阳三生制药公司）贝而芬（新大洲药业公司）贝而芬（新大洲药业公司）毛细胞白血病毛细胞白血病乙、丙、丁型肝炎乙、丙、丁型肝炎原发性肝癌原发性肝癌各种恶性肿瘤各种恶性肿瘤第19页，本讲稿共47页中国市场上主要重组干扰素剂型中国市场上主要重组干扰素剂型赛若金（深圳科兴公司）赛若金（深圳科兴公司）毛细胞白血病毛细胞白血病慢性乙、丙、型肝炎慢性乙、丙、型肝炎慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病尖锐湿疣尖锐湿疣慢性宫颈炎慢性宫颈炎疱疹性角膜炎疱疹性角膜炎IFN-IFN-1b1b干扰灵（上海生物制品研干扰灵（上海生物制品研究所）究所）毛细胞白血病毛细胞白血病慢性乙、丙、型肝炎慢性乙、丙、型肝炎第20页，本讲稿共47页中国上市的主要重组干扰素剂型中国上市的主要重组干扰素剂型IFN-IFN-2b2b安达芬（安科生物制品公司）安达芬（安科生物制品公司）隆化诺（华新生物制品公司）隆化诺（华新生物制品公司）安福莱（浙江汉生制药公司安福莱（浙江汉生制药公司）急慢性乙型肝炎急慢性乙型肝炎毛细胞白血病毛细胞白血病丙型肝炎丙型肝炎尖锐湿疣尖锐湿疣慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病生殖器疱疹等病毒病生殖器疱疹等病毒病肿瘤肿瘤第21页，本讲稿共47页传统方法生产干扰素传统方法生产干扰素第22页，本讲稿共47页传统方法生产干扰素传统方法生产干扰素成本高成本高组分多组分多纯度低，活性低纯度低，活性低产品不稳定产品不稳定第23页，本讲稿共47页启动种子启动种子制备种子液制备种子液发酵培养发酵培养粗提粗提精提精提半半成品制备成品制备半成品检定半成品检定分装分装冻干冻干成品检定成品检定成成品包装品包装基基因因工工程程干干扰扰素素的的生生产产工工艺艺 第24页，本讲稿共47页基因工程干扰素的纯化基因工程干扰素的纯化提取：离心、冰浴超声破碎、离心、提取：离心、冰浴超声破碎、离心、超滤浓缩、离子层析超滤浓缩、离子层析纯化：纯化：DE-52柱纯化、利用不同浓度柱纯化、利用不同浓度的的NaCl磷酸缓冲液洗涤，收集磷酸缓冲液洗涤，收集第25页，本讲稿共47页基因干扰素质量检验半成品基因干扰素质量检验半成品（）干扰素效价测定：用细胞病变抑制法，（）干扰素效价测定：用细胞病变抑制法，以以wish细胞、细胞、VSV病毒为基本检测系统。测病毒为基本检测系统。测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位位（）蛋白质含量测定及比活性：以福林酚法（）蛋白质含量测定及比活性：以福林酚法（）纯度测定：（）纯度测定：SDS-PAGE、高效液相色谱、高效液相色谱反相柱或柱反相柱或柱（）相对分子质量测定：（）相对分子质量测定：SDS-PAGE第26页，本讲稿共47页（）残余外源性（）残余外源性DNADNA含量测定：放射性核素或生物素含量测定：放射性核素或生物素探针法探针法（）残余血清（）残余血清IgGIgG含量测定：亲和层析含量测定：亲和层析（）残余抗生素活性测定（）残余抗生素活性测定（）紫外光谱扫描（）紫外光谱扫描（）肽图测定：（）肽图测定：CNBrCNBr裂解法裂解法（）等电点测定：等电点聚焦电泳（）等电点测定：等电点聚焦电泳（）无菌试验、热原质试验（）无菌试验、热原质试验第27页，本讲稿共47页基因干扰素质量检验成品基因干扰素质量检验成品物理性状：冻干制品白色或微黄色疏松体物理性状：冻干制品白色或微黄色疏松体鉴别试验：应用鉴别试验：应用ELISA或中和试验或中和试验水分测定：水分低于水分测定：水分低于无菌试验无菌试验热原质试验热原质试验干扰素效价测定干扰素效价测定安全试验安全试验第28页，本讲稿共47页炎症反应也是一种非特异性防御现象。炎症与发烧：炎症与发烧：白细胞遭遇入侵微生物时会释放出一种调节白细胞遭遇入侵微生物时会释放出一种调节性化学分子白细胞介素性化学分子白细胞介素-1-1，白细胞介素，白细胞介素-1-1经经过血液输送到大脑，与细菌内毒素共同作用过血液输送到大脑，与细菌内毒素共同作用刺激下丘脑中神经元，导致发烧。刺激下丘脑中神经元，导致发烧。体温升高（发烧）可刺激白细胞的吞噬作用，体温升高（发烧）可刺激白细胞的吞噬作用，还可以增加肝脏和脾脏中铁的浓度以降低血还可以增加肝脏和脾脏中铁的浓度以降低血液中铁的浓度。液中铁的浓度。发烧对机体也有伤害作用。发烧对机体也有伤害作用。第29页，本讲稿共47页（3 3）第三道防线：特异性免疫）第三道防线：特异性免疫特异性免疫的发现：天花JennerPasteur可以引起人或动物体内免疫应答的特殊外来物质称为抗原。人体和哺乳动物对不同的抗原具有特殊的识别能力，并能立即作出相应的反应，释放出许多直接攻击入侵抗原的细胞，或者通过另一类细胞制造出相应的具有识别抗原功能的防御性蛋白质，我们把这些特异性的蛋白质称为抗体。第30页，本讲稿共47页骨髓种牛痘或患天花、麻疹等疾病痊愈以后，人体一种称为B细胞的淋巴细胞产生出游离于体液中的抗体蛋白，依靠B细胞的免疫方式称为体液免疫。人体还能针对病原体产生出一种称为T细胞的淋巴细胞直接对病原体进行攻击，依靠T细胞的免疫方式称为细胞免疫。B细胞和T细胞的分化特异性免疫特异性免疫第31页，本讲稿共47页二、特异性免疫识别抗原性病原体和启动免疫应答二、特异性免疫识别抗原性病原体和启动免疫应答二、特异性免疫识别抗原性病原体和启动免疫应答二、特异性免疫识别抗原性病原体和启动免疫应答当一种病毒或细菌突破了非特异性防御由呼当一种病毒或细菌突破了非特异性防御由呼吸道进入人体后，巨噬细胞便会立即启动免吸道进入人体后，巨噬细胞便会立即启动免疫应答。疫应答。MHCMHC（组织相容性复合体）（组织相容性复合体）第32页，本讲稿共47页免疫系统的免疫系统的T细胞通过细胞表面细胞通过细胞表面MHC蛋白的蛋白的进行自我与非我的识别。进行自我与非我的识别。MHC分子嵌合抗原的细胞（抗原呈递细胞）分子嵌合抗原的细胞（抗原呈递细胞）将加工过的抗原提交给将加工过的抗原提交给T细胞，进一步激活细胞，进一步激活细胞毒性细胞毒性T细胞，最终杀死被病毒和细菌感细胞，最终杀死被病毒和细菌感染的细胞。染的细胞。第33页，本讲稿共47页细胞介导的免疫应答可以防御病毒感染和癌症，杀死并消灭被感染的体细胞，同时也消灭了其中的病毒等病原体。T细胞介导的细胞免疫过程三、三、T T细胞及细胞介导的免疫应答细胞及细胞介导的免疫应答第34页，本讲稿共47页当细菌和病毒等病原体当细菌和病毒等病原体入侵到我们的血液、淋入侵到我们的血液、淋巴或组织液中时，由巴或组织液中时，由B B细细胞介导的体液免疫起着胞介导的体液免疫起着关键的作用。关键的作用。四、四、B B细胞及体液介导的免疫应答细胞及体液介导的免疫应答细胞被抗原活化，克隆细胞被抗原活化，克隆出更多的浆细胞和记忆出更多的浆细胞和记忆细胞。细胞。B B细胞与抗原结合后的分细胞与抗原结合后的分化发育还需要巨噬细胞和化发育还需要巨噬细胞和T T细胞的参与。细胞的参与。第35页，本讲稿共47页在体液免疫中，抗体是攻击病原体的分子级武器，它是在体液免疫中，抗体是攻击病原体的分子级武器，它是一种一种-球蛋白球蛋白(Ig)(Ig)，或称为免疫球蛋白。，或称为免疫球蛋白。免疫球蛋白的基本结构：免疫球蛋白的基本结构：“Y”“Y”型的四链分子型的四链分子按照抗体的结构与功能按照抗体的结构与功能的差别，它们被分成的差别，它们被分成IgM,IgG,IgD,IgA,IgM,IgG,IgD,IgA,IgEIgE等等5 5类类第36页，本讲稿共47页免疫球蛋白分类免疫球蛋白分类IgG：体内最主要的免疫球蛋白，唯一能通过胎盘体内最主要的免疫球蛋白，唯一能通过胎盘由母体传输给胎儿的免疫球蛋白由母体传输给胎儿的免疫球蛋白 IgA：主要由黏膜相关淋巴组织中浆细胞产生，主要分主要由黏膜相关淋巴组织中浆细胞产生，主要分布在鼻、咽、支气管、胃肠道、生殖器官等黏膜及分泌布在鼻、咽、支气管、胃肠道、生殖器官等黏膜及分泌液中液中 IgM：主要分布在血液中，具有补体激活功能，在防止发主要分布在血液中，具有补体激活功能，在防止发生菌血症、败血症等方面起重要作用生菌血症、败血症等方面起重要作用 IgE：是半衰期最短、血清浓度最低的一类免疫球蛋白是半衰期最短、血清浓度最低的一类免疫球蛋白 IgD：为单体球免疫蛋白，仅在为单体球免疫蛋白，仅在B细胞成熟的某一阶细胞成熟的某一阶段出现在段出现在B细胞膜上，在防止免疫耐受方面有一定的作细胞膜上，在防止免疫耐受方面有一定的作用用 第37页，本讲稿共47页单克隆是指所有制备抗体的细胞都是同一个细胞的拷贝，因此其产生的抗体完全相同。单克隆抗体是大规模细胞培养的产物，而不是直接来自于动物血清。单克隆抗体制备单克隆抗体的过程涉及到细胞培养、细胞融合等多种步骤。第38页，本讲稿共47页Monoclonal antibody动物细胞融合技术动物细胞融合技术骨髓瘤（骨髓瘤（Myeloma）是一种恶性肿瘤，可）是一种恶性肿瘤，可在体外进行培养并无限制繁殖，但不能产在体外进行培养并无限制繁殖，但不能产生抗体生抗体免疫淋巴细胞可以产生抗体，但不能在体免疫淋巴细胞可以产生抗体，但不能在体外长期培养和无限期繁殖外长期培养和无限期繁殖不能产生抗体的骨髓瘤细胞与产生抗体的不能产生抗体的骨髓瘤细胞与产生抗体的B细胞融合，产生杂交瘤细胞（细胞融合，产生杂交瘤细胞（Hybridoma cells）第39页，本讲稿共47页接接接接受受受受抗抗抗抗原原原原刺刺刺刺激激激激后后后后，能能能能分分分分泌泌泌泌针针针针对对对对该该该该抗抗抗抗原原原原的的的的特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体体体体，在体液免疫中具有重要功能。在体液免疫中具有重要功能。在体液免疫中具有重要功能。在体液免疫中具有重要功能。B B淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞本本本本身身身身是是是是一一一一种种种种终终终终末末末末分分分分化化化化细细细细胞胞胞胞，通通通通常常常常不不不不再再再再进进进进行行行行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡细胞分裂，存活一段时间后便会死亡细胞分裂，存活一段时间后便会死亡细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞短命细胞短命细胞短命细胞杂交瘤技术产生的杂交瘤技术产生的杂交瘤技术产生的杂交瘤技术产生的33个技术关键个技术关键个技术关键个技术关键1.B1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(B lymphocytes)(B lymphocytes)：第40页，本讲稿共47页骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (myeloma cells):(myeloma cells):恶恶恶恶性性性性增增增增殖殖殖殖的的的的转转转转化化化化细细细细胞胞胞胞，只只只只要要要要营营营营养养养养条条条条件件件件适适适适合合合合可可可可永永永永远分裂和存活远分裂和存活远分裂和存活远分裂和存活长命细胞长命细胞长命细胞长命细胞。经经经经筛筛筛筛选选选选与与与与驯驯驯驯化化化化，现现现现已已已已建建建建立立立立多多多多种种种种骨骨骨骨髓髓髓髓瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞株株株株没没没没有有有有抗体分泌物抗体分泌物抗体分泌物抗体分泌物。第41页，本讲稿共47页2.2.细胞融合技术：细胞融合技术：细胞融合技术：细胞融合技术：脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命长命长命长命不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体短命短命短命短命分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体长命长命长命长命KhlerKhler和和和和Milstein,1975Milstein,19751984年年Nobel医医 学学 奖奖第42页，本讲稿共47页3.3.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 ：脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞/脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞筛选出筛选出筛选出筛选出不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活第43页，本讲稿共47页培养上清中培养上清中培养上清中培养上清中X X X X抗体的检测抗体的检测抗体的检测抗体的检测克隆化培养克隆化培养克隆化培养克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X X X X抗体的检测抗体的检测抗体的检测抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养规模化培养规模化培养规模化培养获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体动物免疫动物免疫动物免疫动物免疫 细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合混合细胞的混合细胞的混合细胞的混合细胞的HATHATHATHAT筛选筛选筛选筛选)分泌分泌分泌分泌X X X X抗体抗体抗体抗体B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞X X X X抗原抗原抗原抗原B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞瘤的突变株瘤的突变株瘤的突变株瘤的突变株培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡 无限生长细胞无限生长细胞无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌分泌分泌X X X X抗体抗体抗体抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/cBALB/c杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解第44页，本讲稿共47页杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤（1）抗原制备）抗原制备:对抗原的要求是抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。抗原。（2）免疫动物）免疫动物：选择与所用骨髓瘤与所用骨髓瘤细胞同源的健康小鼠，鼠胞同源的健康小鼠，鼠龄在在812周，雌雄不限。周，雌雄不限。为避免小鼠反避免小鼠反应不佳或免疫不佳或免疫过程中死亡，可同程中死亡，可同时免疫免疫34只小鼠。只小鼠。先给小鼠接种一个抗原，并在随后的几个星期内连续接种几次，但是几先给小鼠接种一个抗原，并在随后的几个星期内连续接种几次，但是几次免疫之间的时间间隔不能太短，以防动物死亡，次免疫之间的时间间隔不能太短，以防动物死亡，一般一般23周周.然后检然后检测小鼠体内是否已经引起了免疫反应。如果发生了免疫反应，就杀死小鼠，测小鼠体内是否已经引起了免疫反应。如果发生了免疫反应，就杀死小鼠，取出小鼠的脾脏，清洗干净，研磨碎，制成取出小鼠的脾脏，清洗干净，研磨碎，制成B细胞悬浮液。细胞悬浮液。（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备：采用眼球摘除放血法处死小鼠，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。（4）细胞融合）细胞融合：将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞 第45页，本讲稿共47页（5）杂交瘤细胞的选择培养）杂交瘤细胞的选择培养：一般采用一般采用HAT选择性培养基。在选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤鸟嘌呤-磷酸磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。而死亡。未融合的淋未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖培养基中存活和增殖（6）杂交瘤细胞的筛选）杂交瘤细胞的筛选：在在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。及时进行冻存。第46页，本讲稿共47页（7）杂交瘤细胞的克隆化）杂交瘤细胞的克隆化（即单克隆生长）（即单克隆生长）：大量制备重要采用动大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。物体内诱生法和体外培养法。（1）体内诱生法）体内诱生法 取取Balb/c小鼠，首先腹腔注射小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石液体石腊或降植烷进行预处理。腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。体。（2）体外培养法）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。高了抗体的生产量。（8）单克隆抗体的鉴定）单克隆抗体的鉴定第47页，本讲稿共47页