质粒种类与应用幻灯片.ppt

质粒种类与应用质粒种类与应用质粒种类与应用质粒种类与应用第1页，共138页，编辑于2022年，星期三 基因载体是一类能自我复制的基因载体是一类能自我复制的DNADNA分子，其中的一段分子，其中的一段DNADNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的目的)DNA)DNA而而将目的将目的DNADNA带入宿主细胞。带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等第2页，共138页，编辑于2022年，星期三第3页，共138页，编辑于2022年，星期三 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。第4页，共138页，编辑于2022年，星期三基因载体应具备的条件：基因载体应具备的条件：（1 1 1 1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1 1 1 1个；个；个；个；（2 2 2 2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3 3 3 3）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；（4 4 4 4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。第5页，共138页，编辑于2022年，星期三多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记A Ammp ppolylinker基因载体基因载体第6页，共138页，编辑于2022年，星期三载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第7页，共138页，编辑于2022年，星期三载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较具有较具有较高的外源高的外源高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 第8页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒(plasmid)Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNA分子。分子。PlasmidchromosomePlasmidchromosome 第9页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的型的型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即即即cccDNAcccDNA质粒质粒质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：的分子量范围：的分子量范围：1-300 1-300 kbkb第10页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1-3 1-3 拷贝拷贝拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10-60 10-60 拷贝拷贝拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid第11页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向复制方向复制方向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533第12页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制复制启动控制复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合的结合的结合PcopPcopcopcopP/OrepP/OreprepreporioriCopCopRepRep第13页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容性的质，不相容性的质，不相容性的质，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成粒组成粒组成粒组成不相容性群不相容性群不相容性群不相容性群第14页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相容性：质粒的不相容性：质粒的不相容性：分子机制分子机制分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内细胞内细胞内细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势第15页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的可转移性质粒的可转移性质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等质粒等质粒等质粒等如如如如ColCol、RR的其它成员的其它成员的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒在接合型质粒在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由转移，这个过程由转移，这个过程由 bom bom 和和和和mob mob 基因决定基因决定基因决定基因决定20060421第16页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义第17页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的构建质粒的构建质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。型质粒为基础进行人工构建。型质粒为基础进行人工构建。型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101pSC101 8.8 kb 8.8 kb 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 5 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE1 6.5 kb 6.5 kb 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 20-30 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1E1RSF2124RSF2124 ColE1 ColE1衍生质粒衍生质粒衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 ApAprr第18页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒的分类质粒的分类质粒的分类质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数1000-3000 1000-3000 扩增基因扩增基因扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自来自来自pSC101 pSC101 拷贝数小于拷贝数小于拷贝数小于拷贝数小于1010 表达某些毒性基因表达某些毒性基因表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinkerpolylinker整合质粒整合质粒整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆便于基因克隆便于基因克隆表达质粒表达质粒表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选第19页，共138页，编辑于2022年，星期三 第一阶段（第一阶段（19771977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,pSC101,colE1,pCR,pBR313colE1,pCR,pBR313和和pBR322pBR322。第二阶段：第二阶段：增大载体容量增大载体容量（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立多克隆位点区多克隆位点区和新的和新的遗遗传标记传标记基因。如基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mpM13mp系列载系列载体，含体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。发展概况发展概况第20页，共138页，编辑于2022年，星期三第21页，共138页，编辑于2022年，星期三 pBR322pBR322为为为为4.36kb4.36kb4.36kb4.36kb的的的的环环环环状状状状双双双双链链链链DNADNADNADNA，其其其其碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列已已已已经经经经全全全全部部部部清清清清楚楚楚楚。是是是是最最最最早早早早应应应应用用用用于于于于基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的载载载载体体体体之之之之一一一一。把把把把pBR322pBR322pBR322pBR322用用限限制制性性内内切切酶酶切切去去某某片片段段，换换上合用的上合用的表达组件表达组件表达组件表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。，就可以构建成工作所需的新载体。许许许许多多多多实实实实用用用用的的的的质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体都都都都是是是是在在在在pBR322pBR322pBR322pBR322的的的的基基基基础础础础上上上上改改改改建建建建而而而而成成成成。可可可可见见见见其其其其原原原原型型型型质质质质粒在使用上有优点。粒在使用上有优点。粒在使用上有优点。粒在使用上有优点。pBR322pBR322第22页，共138页，编辑于2022年，星期三有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切单一切口的位点也多达数十个，口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。能切开并插入目的基因的优越条件。此外，此外，pBR322DNApBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准分子质量标准。第23页，共138页，编辑于2022年，星期三重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322：氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50-100/50-100/cellcell用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆 第24页，共138页，编辑于2022年，星期三抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板第25页，共138页，编辑于2022年，星期三第26页，共138页，编辑于2022年，星期三第27页，共138页，编辑于2022年，星期三pUCpUC质粒系列质粒系列 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.第28页，共138页，编辑于2022年，星期三476bp476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基因的基因的 5-5-序列，表达序列，表达半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 片段。片段。LacZLacZ的上游包括乳糖操纵的上游包括乳糖操纵子上的启动子子上的启动子PlacPlac和操纵和操纵基因基因O O。lacZlacZ之内是之内是M13M13的多功能的多功能连接器。连接器。第29页，共138页，编辑于2022年，星期三三个显著特点：三个显著特点：（1 1）分子量更小分子量更小分子量更小分子量更小，仅为，仅为，仅为，仅为2.7KB，容纳外源，容纳外源，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；具有量增大；具有量增大；具有量增大；具有更高的拷贝更高的拷贝更高的拷贝更高的拷贝数数数数（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因LacZ，可利用可利用可利用可利用 -互补原理进行互补原理进行互补原理进行互补原理进行蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。（3 3）多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（MCSMCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。由人工合成的多个单一酶切位点构成。由人工合成的多个单一酶切位点构成。由人工合成的多个单一酶切位点构成。其其MCS区与区与区与区与M13mp噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使pUCpUC上克隆的目的基因上克隆的目的基因上克隆的目的基因上克隆的目的基因直接转移到直接转移到直接转移到直接转移到M13mpM13mp载体，进行载体，进行载体，进行载体，进行DNADNA测序测序测序测序和和和和体外突变体外突变体外突变体外突变等研究。等研究。等研究。等研究。第30页，共138页，编辑于2022年，星期三重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18/19/19：拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000-3000/2000-3000/cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ第31页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18/19/19：正选择标记正选择标记正选择标记正选择标记 lacZ lacZ 的显色原理的显色原理的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSb bb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段肽段肽段a a ab b b5-5-溴溴溴溴-4-4-氯氯氯氯-3-3-吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基-b b b b-D-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷X-galX-gal第32页，共138页，编辑于2022年，星期三pKOpKO系列系列组成：以组成：以半乳糖激酶（半乳糖激酶（GalkGalk）基因取代基因取代pBR322pBR322的的EcoEcoRI-RI-PvuPvuIIII位点包括位点包括terterr r，.表达产物催化表达产物催化 Gal+ATP Gal-1-P+ADPGal+ATP Gal-1-P+ADP以以1414C C标记的半乳糖作底物标记的半乳糖作底物,检测生成的检测生成的*Gal-1-PGal-1-P的放射性。的放射性。第33页，共138页，编辑于2022年，星期三 在在GalkGalk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即糖激酶活性，即1414C-Gal-l-PC-Gal-l-P的放射性，可的放射性，可定量估算启动子定量估算启动子功能的强弱功能的强弱。如在如在GalkGalk基因前插入目的基因，与无插入的空载基因前插入目的基因，与无插入的空载pKOpKO比较，比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。第34页，共138页，编辑于2022年，星期三重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：注意：注意：T7T7和和和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的编码的编码的RNARNA聚合聚合聚合聚合2743 bp2743 bpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrpGEM-3EpGEM-3EPPSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶，如：聚合酶，如：聚合酶，如：聚合酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等等等第35页，共138页，编辑于2022年，星期三 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 蓝白斑试验（蓝白斑试验（IPTG-Xgal IPTG-Xgal 试验试验）第36页，共138页，编辑于2022年，星期三诱导物 Z Y XZ Y X P PO O Z Y X P PO O乳糖第37页，共138页，编辑于2022年，星期三标志补救（标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段lacZ第38页，共138页，编辑于2022年，星期三X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal第39页，共138页，编辑于2022年，星期三（LacZLacZ基因基因 N N端端序列）序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 C C端序列端序列LacZLacZ酶酶第40页，共138页，编辑于2022年，星期三基因克隆时的定向插入基因克隆时的定向插入 插入序列两边的酶切口不同插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿了在其下游目的基因插入后，沿5 533方向正确转录，这种构方向正确转录，这种构建方式称为定向插入建方式称为定向插入。第41页，共138页，编辑于2022年，星期三EcoRIHindIIIOriOri复制起点复制起点LacZAPRpUC19第42页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNADNA：氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法碱溶法碱溶法碱溶法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间第43页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加CsClCsCl和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNAproteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs第44页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化碱溶法：碱溶法：碱溶法：碱溶法：用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加NaOHNaOH和和和和SDSSDS的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体色体色体DNADNA及大部分蛋白质及大部分蛋白质及大部分蛋白质及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNADNA用无用无用无用无DNaseDNase的的的的RNaseRNase去除残余的去除残余的去除残余的去除残余的RNARNA cccDNAcccDNAL-DNAL-DNAocDNAocDNAD-DNAD-DNAT-DNAT-DNA第45页，共138页，编辑于2022年，星期三质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法：用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA和和和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴4040秒钟秒钟秒钟秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA第46页，共138页，编辑于2022年，星期三噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNADNA能被开发成为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第47页，共138页，编辑于2022年，星期三 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体是是是是比比比比细细细细菌菌菌菌还还还还小小小小得得得得多多多多的的的的微微微微生生生生物物物物，和和和和病病病病毒毒毒毒侵侵侵侵犯犯犯犯真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞一一一一样样样样，噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体侵侵侵侵犯犯犯犯细细细细菌菌菌菌，也也也也可可可可以以以以认认认认为为为为它它它它是是是是细细细