生物制药酶类药物课件.ppt

关于生物制药酶类药物第1页，此课件共72页哦第一节第一节 药用酶类的概述药用酶类的概述第2页，此课件共72页哦关于酶，你已经知道了哪些知识？还想知道哪些知识？第3页，此课件共72页哦酶的分类酶的分类第4页，此课件共72页哦“绿色健康，绿色健康，“酶酶”力无限力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域 第5页，此课件共72页哦淀粉酶类与淀粉糖业淀粉酶类与淀粉糖业第6页，此课件共72页哦果汁生产与果胶酶乳制品与凝乳酶第7页，此课件共72页哦酶蛋白成为药物应具备的条件酶蛋白成为药物应具备的条件在生理在生理pHpH下下,具有最高活性和稳定性具有最高活性和稳定性对基质具有较高亲和力对基质具有较高亲和力(低低KmKm值值)血清中半衰期较长血清中半衰期较长纯度高纯度高免疫原性低或无免疫原性免疫原性低或无免疫原性不需要外源辅助因子不需要外源辅助因子第8页，此课件共72页哦第9页，此课件共72页哦第10页，此课件共72页哦酶酶类药类药物在疾病治物在疾病治疗疗方面的方面的应应用用酶酶 名名来来 源源用用 途途淀粉淀粉酶酶胰胰脏脏、麦芽、微生物、麦芽、微生物治治疗疗消化不良，食欲不振消化不良，食欲不振蛋白蛋白酶酶胰胰脏脏、胃、植物、微生物、胃、植物、微生物治治疗疗消化不良，食欲不振，消炎，消消化不良，食欲不振，消炎，消肿肿，创创愈，降愈，降压压脂肪脂肪酶酶胰胰脏脏、微生物、微生物治治疗疗消化不良，食欲不振消化不良，食欲不振纤维纤维素素酶酶霉菌霉菌治治疗疗消化不良，食欲不振消化不良，食欲不振溶菌溶菌酶酶蛋清、蛋清、细细菌菌治治疗疗各种各种细细菌性和病毒性疾病菌性和病毒性疾病尿激尿激酶酶人尿人尿治治疗疗心肌梗塞，心肌梗塞，结结膜下出血，黄斑部出血膜下出血，黄斑部出血链链激激酶酶链链球菌球菌治治疗疗血栓性静脉炎，咳痰，血血栓性静脉炎，咳痰，血肿肿，下出血，骨折，下出血，骨折青霉素青霉素酶酶蜡状芽蜡状芽孢孢杆菌杆菌治治疗疗青霉素引起的青霉素引起的变态变态反反应应L-L-天冬天冬酰酰胺胺酶酶大大肠肠杆菌杆菌治治疗疗白血病白血病超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶微生物，植物，微生物，植物，动动物物预预防防辐辐射射损伤损伤，治，治疗红疗红斑狼斑狼疮疮，皮肌炎，皮肌炎，结肠结肠炎炎凝血凝血酶酶动动物，蛇，物，蛇，细细菌，酵母等菌，酵母等治治疗疗各种出血病各种出血病胶原胶原酶酶细细菌菌分解胶原，消炎，化分解胶原，消炎，化脓脓，脱痂，治，脱痂，治疗溃疡疗溃疡右旋糖右旋糖酐酐酶酶微生物微生物预预防防龋齿龋齿 胆碱胆碱酯酯酶酶细细菌菌治治疗疗皮肤病，支气管炎，气喘皮肤病，支气管炎，气喘溶溶纤纤酶酶蚯蚓蚯蚓溶血栓溶血栓弹弹性蛋白性蛋白酶酶胰胰脏脏治治疗动疗动脉硬化，降血脂脉硬化，降血脂核糖核酸核糖核酸酶酶胰胰脏脏抗感染，祛痰，治肝癌抗感染，祛痰，治肝癌尿酸尿酸酶酶牛牛肾肾治治疗疗痛痛风风第11页，此课件共72页哦第12页，此课件共72页哦第13页，此课件共72页哦第14页，此课件共72页哦栓栓溶溶酶酶类类与与心心血血管管疾疾病病第15页，此课件共72页哦凝凝血血酶酶第16页，此课件共72页哦健美生消化酶健美生消化酶帮助肠胃蠕动帮助肠胃蠕动【产品规格产品规格】90片瓶片瓶【食用方法食用方法】成人每日成人每日3片，随主餐服用片，随主餐服用【成分成分(每片含每片含)】1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠毫克、菠萝蛋白酶萝蛋白酶30毫克；毫克；2)消化脂肪：脂肪酶消化脂肪：脂肪酶30毫克；毫克；3)消化碳水化合物消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶淀粉：淀粉酶50毫克；毫克；4)消化乳制品：乳糖酶消化乳制品：乳糖酶30毫克；毫克；5)消化纤维：纤维素酶消化纤维：纤维素酶15毫克。毫克。另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃薄荷叶和茴香能缓解反胃薄荷叶和茴香【适用人群适用人群】消化不良者消化不良者肠胃疾病患者肠胃疾病患者大病初愈者大病初愈者消化酶类消化酶类第17页，此课件共72页哦第二节第二节 酶类药物的制造过程酶类药物的制造过程一、原料的选择一、原料的选择1.不同酶的用料选择不同酶的用料选择 乙酰化酶（鸽肝）、凝血酶乙酰化酶（鸽肝）、凝血酶(牛血）牛血）、透明质酸酶（羊睾丸）、溶菌酶（鸡蛋、透明质酸酶（羊睾丸）、溶菌酶（鸡蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝）清），超氧化物歧化酶（血、肝）第18页，此课件共72页哦2.注意不同生长发育情况及营养状况注意不同生长发育情况及营养状况3.原料来源丰富原料来源丰富4.从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手5.如用动物组织作原料，应在此动物宰如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后立即取材。杀后立即取材。第19页，此课件共72页哦二、微生物酶制剂高产菌株的选育二、微生物酶制剂高产菌株的选育菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅可以提高酶制剂产量和发酵原料的利菌种不仅可以提高酶制剂产量和发酵原料的利用率，而且还与增加品种，缩短生产周期，改用率，而且还与增加品种，缩短生产周期，改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。进发酵和提炼工艺条件等密切相关。优良菌种获得的三种途径：优良菌种获得的三种途径：（1）从自然界分离筛选）从自然界分离筛选;（2）用物理或化学的方法处理，诱变）用物理或化学的方法处理，诱变;（3）用基因重组与细胞融合技术。）用基因重组与细胞融合技术。第20页，此课件共72页哦三、微生物酶制剂生产的发酵技术三、微生物酶制剂生产的发酵技术（一）培养基（一）培养基1.碳源（甘薯、玉米、麸皮、米糠）碳源（甘薯、玉米、麸皮、米糠）2.氮源氮源（豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸（豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸铵、尿素）铵、尿素）3.无机盐无机盐4.生长因子和产酶促进剂生长因子和产酶促进剂第21页，此课件共72页哦（二）培养方法（二）培养方法1.固体培养法固体培养法 固体培养法也称麸曲培养法，该法是利用麸皮或固体培养法也称麸曲培养法，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度半固态物料作为培养基。加水拌成含水适度半固态物料作为培养基。2.液体培养法液体培养法 液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气方法的不同，又分为液体表面培养和液体产酶。根据通气方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。第22页，此课件共72页哦3.影响酶产生的一些因素影响酶产生的一些因素 除培养基，发酵工艺参数对产酶的除培养基，发酵工艺参数对产酶的影响也十分明显。影响也十分明显。(1)温度温度 (2)pH (3)通气通气 (4)搅拌搅拌第23页，此课件共72页哦(5)泡沫泡沫 发酵过程中，由于发酵液受到强烈的发酵过程中，由于发酵液受到强烈的通气搅拌，培养基中某些成分的变化及代通气搅拌，培养基中某些成分的变化及代谢中产生气体，会形成较多的泡沫，而且谢中产生气体，会形成较多的泡沫，而且气泡不易消失，是由于培养基中蛋白质分气泡不易消失，是由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故。泡沫层之故。消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸类，消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸类，胺类，酰胺类，磷酸酯类，金属皂类，聚胺类，酰胺类，磷酸酯类，金属皂类，聚硅氧烷等。硅氧烷等。第24页，此课件共72页哦(6)添加诱导剂和抑制剂添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶 抑制剂（表面活性剂）抑制剂（表面活性剂）第25页，此课件共72页哦四、酶类药物的提取和纯化四、酶类药物的提取和纯化 原料选择原料选择生物材料的预处理生物材料的预处理提取提取浓缩浓缩纯化纯化结晶结晶第26页，此课件共72页哦1.动物材料的预处理：动物材料的预处理：（1）机械法：）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法。有有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法。有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其他处理法。些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其他处理法。（2）冻融：）冻融：冷到冷到-10左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。（3）丙酮粉：）丙酮粉：组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。材料的预处理材料的预处理第27页，此课件共72页哦2.微生物材料的预处理微生物材料的预处理 胞外酶胞外酶:除去菌体后再直接从发酵液除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。中吸附提取酶。胞内酶胞内酶:将菌体细胞破壁，制成无细将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬浮液后再行提取。胞的悬浮液后再行提取。第28页，此课件共72页哦1.干燥法干燥法:干燥后菌体产生自溶干燥后菌体产生自溶（1）空气干燥）空气干燥:适用于热稳定的酶适用于热稳定的酶（2）真空干燥）真空干燥:适于细菌适于细菌（3）冷冻干燥）冷冻干燥:适用于较敏感的酶适用于较敏感的酶2.机械法机械法（1）研磨法）研磨法（2）组织匀浆法）组织匀浆法（3）超声波法）超声波法（4）高压匀浆法）高压匀浆法3.酶法处理酶法处理第29页，此课件共72页哦(二二)酶的提取酶的提取1.水溶液法水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。等，都可以用水溶液抽提。许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。第30页，此课件共72页哦2.有机溶剂法有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质牢固结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有以下特点丁醇具有以下特点：（：（1）亲脂性强，特别是）亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；（亲磷脂的能力；（2)兼具亲水性，在兼具亲水性，在0在水中的在水中的溶解度为溶解度为10.5%；（；（3）在脂与水分子间能起类似）在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。去垢剂的桥梁作用。3.表面活性剂法表面活性剂法第31页，此课件共72页哦(三三)酶制剂的工业提取法酶制剂的工业提取法1.发酵液的预处理及过滤发酵液的预处理及过滤 絮凝剂絮凝剂2.酶液的脱色酶液的脱色 0.11.5%活性炭活性炭3.盐析法盐析法4.有机溶剂法有机溶剂法5.喷雾干燥直接制备粉末酶制剂喷雾干燥直接制备粉末酶制剂第32页，此课件共72页哦酶的分离提纯三个基本环节：酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。第三制剂，即将酶制成各种剂型。在酶的分离纯化过程中每步都须做三件事：在酶的分离纯化过程中每步都须做三件事：第一，测定酶活力第一，测定酶活力(IU/m1)；第二，测定蛋白质含量第二，测定蛋白质含量(mg/m1)；第三，测量体积第三，测量体积(m1)。第33页，此课件共72页哦酶酶是是生生物物活活性性物物质质，操操作作条条件件要要温温和和，一一般般在在0 055间进行。间进行。初分：用分离蛋白质的方法，如盐析、等电点沉初分：用分离蛋白质的方法，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法可从酶淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法可从酶粗提液中初步分离酶。粗提液中初步分离酶。细分：再采用吸附层析、离子交换层析、凝胶细分：再采用吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱法过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱法等层析技术或各种制备电泳技术进一步纯化酶，等层析技术或各种制备电泳技术进一步纯化酶，以得到纯的酶制品以得到纯的酶制品结晶结晶:酶的结晶过程进行得很慢，需要数天或数酶的结晶过程进行得很慢，需要数天或数星期。星期。第34页，此课件共72页哦凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化酶的提纯常包括两方面的工作酶的提纯常包括两方面的工作酶的提纯常包括两方面的工作酶的提纯常包括两方面的工作:(1)(1)浓浓缩缩：把把酶酶制制剂剂从从很很大大体体积积浓浓缩缩到到比比较较小小的体积，的体积，(2)去杂蛋白：把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他去杂蛋白：把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他去杂蛋白：把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他去杂蛋白：把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。大分子物质分离出去。大分子物质分离出去。大分子物质分离出去。(四四)酶的纯化酶的纯化第35页，此课件共72页哦一般原则：一般原则：防止强酸、强碱防止强酸、强碱,要求加入的化学试剂不使酶要求加入的化学试剂不使酶变性；变性；在低温下操作，全部操作在低温在低温下操作，全部操作在低温04；在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量少量-巯基乙醇；巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈激烈”的手段。的手段。第36页，此课件共72页哦(一一)杂质的除去杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白，多糖，酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白，多糖，脂类和核酸等，需要除去。脂类和核酸等，需要除去。（1）pH和加热沉淀法和加热沉淀法 利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白，也可以利用不同蛋白和等电点除去某些杂蛋白，也可以利用不同蛋白质对热稳定性的差异。（质对热稳定性的差异。（SOD酶）酶）（2）蛋白质表面变性法）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可以除去杂利用蛋白质表面变性性质的差别，也可以除去杂蛋白。蛋白。制备过氧化氢酶，加入氯仿除杂蛋白。制备过氧化氢酶，加入氯仿除杂蛋白。第37页，此课件共72页哦(3)选择性变性法选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。(4)核酸沉淀剂法核酸沉淀剂法 在微生物制备酶时，常含有较多核酸，可用核在微生物制备酶时，常含有较多核酸，可用核酸酶降解，离心分离，用核酸沉淀剂如三甲基十六酸酶降解，离心分离，用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵，硫酸链霉素等。烷基溴化铵，硫酸链霉素等。(5)将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白。将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白。近来发现，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，近来发现，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大大提高，这样可以用加热法除去杂蛋白。稳定性大大提高，这样可以用加热法除去杂蛋白。第38页，此课件共72页哦基本操作程序：基本操作程序：分离：分离：分离：分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，沉淀法，超离心等）。沉淀法分离（盐析法，沉淀法，超离心等）。第39页，此课件共72页哦酶分离方法有：酶分离方法有：分子大小分子大小:如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。等。溶解度大小溶解度大小:如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。选择性沉淀法、等电点沉淀法等。所带正负电荷所带正负电荷:如离子交换分离法、电泳分离法、聚如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。焦层析法等。稳定性差异稳定性差异:如选择性热变性法、表面变性法等如选择性热变性法、表面变性法等亲和作用的差异亲和作用的差异:如亲和层析法等如亲和层析法等.第40页，此课件共72页哦纯化：纯化：采用离子交换采用离子交换层析，凝胶过滤，层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。谱和超滤等方法。第41页，此课件共72页哦1.凝胶过滤法凝胶过滤法(分子筛分子筛)原理原理 将样品混合物通过一定孔径的凝胶将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质介质,由于流经路径的差异由于流经路径的差异,使不同使不同分子质量的组分分离；大分子物质分子质量的组分分离；大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小分子物质进入凝胶颗粒的内部再小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。出来，走得慢。第42页，此课件共72页哦第43页，此课件共72页哦2.离子交换法离子交换法原理原理 利用溶液中各种带电粒子与离子利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质交换剂之间结合力的差异进行物质分离。分离。DEAE是一种阴离子交换剂，是一种阴离子交换剂，是一种阴离子交换剂，是一种阴离子交换剂，将样品的将样品的将样品的将样品的pHpH值调至等电点以上，使样值调至等电点以上，使样值调至等电点以上，使样值调至等电点以上，使样品带负电荷，采用盐溶液洗脱，通过高品带负电荷，采用盐溶液洗脱，通过高品带负电荷，采用盐溶液洗脱，通过高品带负电荷，采用盐溶液洗脱，通过高浓度的带同种电荷的离子浓度的带同种电荷的离子浓度的带同种电荷的离子浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被置换被分离的组分分离的组分T离子强度离子强度蛋白浓度蛋白浓度T第44页，此课件共72页哦+-带负电荷带负电荷 的被吸附上的被吸附上带负电荷少带负电荷少的先被置换的先被置换带负电荷多带负电荷多的后被置换的后被置换第45页，此课件共72页哦 NaCl NaCl TrisTris连续梯度洗脱连续梯度洗脱:梯度混合仪梯度混合仪梯度混合仪梯度混合仪第46页，此课件共72页哦3.亲和层析法亲和层析法原理原理原理原理 亲和吸附剂一般是由固相载体和能与目的酶专一可逆结亲和吸附剂一般是由固相载体和能与目的酶专一可逆结亲和吸附剂一般是由固相载体和能与目的酶专一可逆结亲和吸附剂一般是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的将亲和吸附剂填充层析柱，合的配体共价结合而成的将亲和吸附剂填充层析柱，合的配体共价结合而成的将亲和吸附剂填充层析柱，合的配体共价结合而成的将亲和吸附剂填充层析柱，让酶溶液流过层析柱，则目的酶能迅速而又选择件地吸让酶溶液流过层析柱，则目的酶能迅速而又选择件地吸让酶溶液流过层析柱，则目的酶能迅速而又选择件地吸让酶溶液流过层析柱，则目的酶能迅速而又选择件地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗脱，除去附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗脱，除去附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗脱，除去附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗脱，除去些些些些非专非专非专非专性的杂质后再用浓度高的或亲和力强的配体溶性的杂质后再用浓度高的或亲和力强的配体溶性的杂质后再用浓度高的或亲和力强的配体溶性的杂质后再用浓度高的或亲和力强的配体溶液边行亲和洗脱，酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。液边行亲和洗脱，酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。液边行亲和洗脱，酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。液边行亲和洗脱，酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。洗脱方法洗脱方法洗脱方法洗脱方法 改变温度的洗脱改变温度的洗脱改变温度的洗脱改变温度的洗脱 改变改变改变改变pHpH、离子强度及溶剂系统组成进行洗脱。、离子强度及溶剂系统组成进行洗脱。、离子强度及溶剂系统组成进行洗脱。、离子强度及溶剂系统组成进行洗脱。第47页，此课件共72页哦亲亲合合层层析析原原理理图图解解洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液支持物支持物支持物支持物被分离物的抗体被分离物的抗体被分离物的抗体被分离物的抗体其它物质其它物质其它物质其它物质被分离物被分离物被分离物被分离物第48页，此课件共72页哦表表 些互为配基的物质。些互为配基的物质。第49页，此课件共72页哦第50页，此课件共72页哦 2.酶的浓缩酶的浓缩:（1）工业上：）工业上：超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩、超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩、离子交换法、离子交换法、（2）实验室：）实验室：除上述方法外，对少量样品可用下列方法除上述方法外，对少量样品可用下列方法 1.用用G-15或或G-25浓缩浓缩 2.用聚乙二醇用聚乙二醇(PEG)浓缩浓缩 3.凝胶吸水凝胶吸水第51页，此课件共72页哦（二）脱盐和浓缩（二）脱盐和浓缩1.脱盐脱盐（1）透析）透析 玻璃纸袋玻璃纸袋（2）凝胶过滤）凝胶过滤 Sephadex G10第52页，此课件共72页哦(3)复合结晶法复合结晶法 有时可以利用某些酶与有机化合物或有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或成盐的性质来结晶。金属离子形成复合物或成盐的性质来结晶。(4)透析平衡透析平衡 利用透析平衡进行结晶也是常用方法利用透析平衡进行结晶也是常用方法之一。之一。(5)等电点法等电点法第53页，此课件共72页哦(三三)酶的结晶酶的结晶 特征：特征：有序性，对称排列，周期性的重复结构有序性，对称排列，周期性的重复结构 为空间结构研究提供为空间结构研究提供x-衍射样品衍射样品既是纯化的结果又是纯化的手段既是纯化的结果又是纯化的手段第54页，此课件共72页哦把酶提纯到一定纯度以后，可使其结晶。把酶提纯到一定纯度以后，可使其结晶。蛋白质分子多数处于含水的环境中，蛋白质分蛋白质分子多数处于含水的环境中，蛋白质分子与水分子结晶形成稳定的水合物。当蛋白质子与水分子结晶形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的时候，溶液中没有足够可以与的浓度非常高的时候，溶液中没有足够可以与蛋白质结合的水分子用于形成水合物，在蛋白蛋白质结合的水分子用于形成水合物，在蛋白质分子之间也没有足够的水分子可以将它们充质分子之间也没有足够的水分子可以将它们充分隔开，于是蛋白质就以无定形沉淀或结晶的分隔开，于是蛋白质就以无定形沉淀或结晶的形式从溶液中析出。形式从溶液中析出。第55页，此课件共72页哦2.2.结晶的条件选择结晶的条件选择酶的纯度酶的纯度酶的浓度酶的浓度金属离子金属离子pH温度、时间温度、时间晶种晶种第56页，此课件共72页哦酶蛋白结晶的基本条件酶蛋白结晶的基本条件:(1)酶的纯度酶的纯度 酶只有达到相当纯度后才能结晶。酶的纯度越高，结酶只有达到相当纯度后才能结晶。酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的结晶可能性也越大。晶越容易，长成大的结晶可能性也越大。(2)酶的浓度酶的浓度 结晶母液尽可能保持高的浓度。酶的浓度越高越有结晶母液尽可能保持高的浓度。酶的浓度越高越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形成结晶的机利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形成结晶的机会也越大。会也越大。第57页，此课件共72页哦(3)温度温度(4)时间时间(5)pH 有时相差有时相差0.2pH，只能达到沉淀，而不能达到晶，只能达到沉淀，而不能达到晶体。体。(6)金属离子金属离子 许多金属离子能引起或有助于酶的结晶。许多金属离子能引起或有助于酶的结晶。(7)晶种晶种(8)结晶器皿处理。结晶器皿处理。第58页，此课件共72页哦酶的结晶方法酶的结晶方法(1)盐析法盐析法 在适当的在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定性，、温度等条件下，保持酶的稳定性，慢慢改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸慢慢改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸铵，柠檬酸钠，乙酸铵，硫酸镁等。利用硫酸铵结铵，柠檬酸钠，乙酸铵，硫酸镁等。利用硫酸铵结晶时一般是把盐加入到一个比较浓的酶溶液中，并晶时一般是把盐加入到一个比较浓的酶溶液中，并使溶液微呈浑浊为止。然后放置，并且非常缓慢地使溶液微呈浑浊为止。然后放置，并且非常缓慢地增加盐浓度。操作要在低温下进行，缓冲液增加盐浓度。操作要在低温下进行，缓冲液pH要接要接近酶的等电点。近酶的等电点。第59页，此课件共72页哦(2)有机溶剂法有机溶剂法 酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。结酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。结晶用溶剂有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，异丙醇，二恶晶用溶剂有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，异丙醇，二恶烷，二甲亚砜，二氧杂环已烷。烷，二甲亚砜，二氧杂环已烷。(3)复合结晶法复合结晶法(4)透析平衡法透析平衡法(5)等电点法等电点法第60页，此课件共72页哦酶的制剂形式：酶的制剂形式：结晶：结晶：固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）燥）液体：低温（液体：低温（0-4，-20）提高酶蛋白的浓度提高酶蛋白的浓度 加入稳定剂加入稳定剂 固定化固定化第61页，此课件共72页哦 保存：保存：通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉，低温下可较长时期保存。酶粉，低温下可较长时期保存。也可将酶溶液制成也可将酶溶液制成2525甘油或甘油或5050甘油分别贮于甘油分别贮于2525或或5050冰箱中保存。冰箱中保存。注意：酶溶液浓度越低越易变性，因此切记不能保存注意：酶溶液浓度越低越易变性，因此切记不能保存酶的稀溶液。酶的稀溶液。第62页，此课件共72页哦 酶的分离纯化工作中的注意事项酶的分离纯化工作中的注意事项1.1.防止酶蛋白变性防止酶蛋白变性2.2.防止辅因子丢失防止辅因子丢失3.3.防止酶被蛋白防止酶被蛋白 水解酶降解水解酶降解第63页，此课件共72页哦采取的措施采取的措施:1.1.避免泡沫的生成避免泡沫的生成2.2.加入金属鏊合剂加入金属鏊合剂EDTAEDTA3.3.加入巯基试剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇加入巯基试剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)(DTT)等等4.4.加入蛋白酶抑制剂加入蛋白酶抑制剂 第64页，此课件共72页哦衡量分离提纯方法优劣的指标衡量分离提纯方法优劣的指标:总活力的回收总活力的回收(表示提纯过程中酶的损失情况表示提纯过程中酶的损失情况).比活力提高的倍数比活力提高的倍数(表示提纯方法的有效程度表示提纯方法的有效程度)。第65页，此课件共72页哦总活力总活力=活力单位数活力单位数/ml/ml酶液酶液总体积总体积(m1)(m1)比比活活力力=活活力力单单位位数数/mg/mg蛋蛋白白(氮氮)=)=总总活活力力单单位位数数/总蛋白总蛋白(氮氮)mg)mg纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力回回收收率率(产产 率率)=)=每每 次次 总总 活活 力力/第第一一次次总总活活力力100%100%第66页，此课件共72页哦二、酶活性测定二、酶活性测定（一）、酶活性（一）、酶活性1 1.酶活性或酶活力酶活性或酶活力(Enzyme activity)：在最适条在最适条件下件下(25 C,最适底物浓度和最适最适底物浓度和最适pH），酶催化一），酶催化一定化学反应的能力，以酶促反应速度表示。定化学反应的能力，以酶促反应速度表示。第67页，此课件共72页哦 酶活性单位表示方法：酶活性单位表示方法：酶活国际单位（酶活国际单位（酶活国际单位（酶活国际单位（IU)：在在在在2525C C最适条件下最适条件下最适条件下最适条件下（最适（最适（最适（最适pHpH，最适，最适，最适，最适底物浓度）底物浓度）底物浓度）底物浓度），每分钟转化，每分钟转化1mol mol 底物为产物的酶量。底物为产物的酶量。底物为产物的酶量。底物为产物的酶量。IU=1 mol/min.Katal Katal（简称简称Kat）：在）：在）：在）：在2525C C最适条件下，每秒钟转化最适条件下，每秒钟转化最适条件下，每秒钟转化最适条件下，每秒钟转化1 1mol mol 底物为产物的酶量。底物为产物的酶量。底物为产物的酶量。底物为产物的酶量。1Kat=1mol/s.Kat=1mol/s.IU与与Kat的换算的换算 1IU16.6710-9Kat 1Kat6107IU 1Kat109 nKat第68页，此课件共72页哦注意：注意：如果底物（如果底物（S S）有一个以上可被作用的化学键，则一有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示个酶单位表示1 1分钟使分钟使1 1molmol有关基团转化的酶量。如有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2 2molmol底物底物转化的酶量称为一个酶单位。转化的酶量称为一个酶单位。在在“U U”和和“katkat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。第69页，此课件共72页哦2.酶的比活性（酶的比活性（specific activity）：）：指每指每mg蛋白所含的酶活性单位或每蛋白所含的酶活性单位或每kg蛋白中所含蛋白中所含的的Kat数。比活性是表示酶制剂纯度的一个指标，数。比活性是表示酶制剂纯度的一个指标，对同一酶来说，比活性愈大，表示酶的纯度愈高。对同一酶来说，比活性愈大，表示酶的纯度愈高。回收率回收率=某纯化操作后的总活性某纯化操作后的总活性/某纯化操作前的总某纯化操作前的总活性活性 总活性总活性=比活性比活性总体积（总重量）总体积（总重量）比活性比活性=总活性单位总活性单位 总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)mg蛋白蛋白第70页，此课件共72页哦 （二）、测定酶活性的方法（二）、测定酶活性的方法l初速度法：在一个反应体系中，加入一定量初速度法：在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量。学反应量。l平均速度法：在一定条件下，加入一定量底平均速度法：在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间。成该反应（底物反应完）所需的时间。l动态连续测定法：在反应体系中，加入酶，动态连续测定法：在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。消耗或产物的生成。第71页，此课件共72页哦感谢大家观看第72页，此课件共72页哦