子宫内膜癌中高分化二期B CASPASE-3与子宫内膜癌细胞(HEC-1B)凋亡的研究.docx

子宫内膜癌中高分化二期B CASPASE-3与子宫内膜癌细胞(HEC-1B)凋亡的研究 摘 要 目的：探讨Caspase-3对体外培育的人子宫内膜癌细胞（HEC-1B）凋亡的诱导作用。方法：选择人子宫内膜癌细胞（HEC-1B），分空白比照组、阴性比照组、试验组，试验组予不同浓度（10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L）的地塞米松,阴性比照组为有细胞无药物的培育液，空白比照组中是无细胞无药物的培育液，处理24小时、48小时、72小时后用Western blot方法检测凋亡过程中Caspase-3表达的改变。结果：在凋亡过程中，Caspase-3的表达随地塞米松处理时间的延长而降低，与地塞米松的处理浓度好像无关（P0.05）。结论：地塞米松体外能诱导HEC-1B细胞发生凋亡，其机制可能与Caspase-3的表达下调有关。 关键词 子宫内膜癌 细胞凋亡 地塞米松 Caspase-3 A Research on the Apoptosis of Endometrial Cancer Cells （HEC-1B） and Caspase-3 由于细胞凋亡异样在很多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，人们希望通过探讨细胞凋亡机制，了解细胞凋亡与肿瘤细胞死亡的关系，在恶性肿瘤治疗学中取得新的突破。因此，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%30%1，多见于老年妇女。依据美国癌症协会的资料，2005年新发病例为40 880例，同时有7310例患者死于本病23。在我国虽然没有详尽的统计数字，但本病的发生有逐年上升的趋势。 资料与方法 试验材料：细胞株来源：HEC-1B细胞为人子宫内膜腺癌细胞株，购自北京细胞中心。主要试剂及设备：DMEM培育基（Gibico公司），10%小牛血清（天津血研所），胰蛋白酶（Sigma公司），地塞米松（Sigma公司），Caspase3单克隆抗体（北京中山公司），二抗即羊抗兔IgG（北京中山公司），硝酸纤维素膜，CO2孵箱（TEHER），全自动酶标仪（SUNRISE公司），电泳仪。 方法：细胞培育及处理：人子宫内膜腺癌细胞株（HEC-1B）贴壁培育于含青、链霉素的DMEM培育基中，内有10%小牛血清，置37、5% CO2饱和湿度的无菌培育箱中培育，用0.25%胰蛋白酶消化传代，以磷酸盐缓冲液（PBS）进行漂洗，每周传代12次，收集细胞，进行分组，试验组分别加入10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的地塞米松的培育液，阴性比照组加入有细胞无药物的培育液，空白比照组中只加无细胞无药物的培育液。Western blot：收集阴性比照组及试验组各个浓度地塞米松处理24小时、48小时、72小时的对数生长期HEC-1B细胞接种于培育瓶中，经过PBS洗涤，抽取细胞裂解液以收集蛋白样品，进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳，当电压达65V时改为稳压电泳，在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。将蛋白质转到硝酸纤维素膜后，马上把蛋白膜放置到预先打算好的Western洗涤液中，漂洗12分钟，以洗去膜上的转膜液，低温（4）封闭膜过夜。用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。将膜依次滴加Caspase-3单抗、二抗，孵育后以TBS-T洗3次，进行ECL显影，设b-actin为内参，用蛋白条带的平均光强度值A/比照组的A值×100%表示其表达量。 统计学处理：应用SPSS11.0软件进行数据处理，采纳方差分析，P0.05有统计学意义。 结 果 分别用不同浓度的地塞米松处理HEC-1B细胞24小时、48小时、72小时后，用Western blot方法检测Caspase-3的改变。试验表明Caspase-3的表达随Dex的处理时间的延长而降低（P0.05），与Dex处理浓度的凹凸好像无关（P0.05）。 如图13：浓度（mol/L）阴性，10-10、10-9、10-8、10-7、10-6。 Caspase-3的蛋白表达量，见表1，图4。 图1 不同浓度Dex作用24小时后Caspase-3的改变 图2 不同浓度Dex作用48小时后Caspase-3的改变 图3不同浓度Dex作用72小时后Caspase-3的改变 讨 论 肿瘤与细胞凋亡的关系是学者们关注的热点，但有关子宫内膜癌发生的分子机制仍不明确。探讨显示肿瘤的发生不但与细胞增殖、分化异样有关，而且细胞凋亡机制也参加其中。随着凋亡与肿瘤发生关系的深化探讨，已有证据表明细胞凋亡受阻是肿瘤发病的重要机制之一。因此，诱导、促进肿瘤细胞的凋亡可能成为治疗肿瘤重要的策略之一。诱导细胞凋亡的因素许多，其中与治疗相关的因素有化疗药物、放射线、细胞因子、中药等。近年来，随着糖皮质激素（生理性凋亡诱导因子）诱导白血病细胞凋亡胜利及临床应用，激素成为肿瘤治疗的新热点4。 本试验应用western blot的方法检测发觉Caspase-3的表达随Dex的处理时间的延长而降低，这是因为Caspase-3被激活后，裂解为相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡，其自身含量下降，结果与国内、外的探讨基本相像，即Caspase-3的下调可能是诱导人子宫内膜癌细胞发生凋亡的重要条件5。 在本试验中亦发觉Caspase-3的表达改变与处理因素即Dex的不同浓度好像无关，P0.05无统计学意义，其机理尚待探讨。 参考文献 1 American Cancer Society.Detailed guide:Endometrial cancer:What are the risk factors for endometrial cancer？Atlanta,Ga American Cancer Society,2005. 2 Pisano C,Greggi S,Tambaro K,et al.Activity of chemotherapy in mucinous epithelial ovarian cancer.A retrospective studyJ.Anticancer kes,2005,25（5）:3501-3505. 3 Ohgoh M,Kimura M,Ogura H.et al.Apoptosic cell death of cultured cerebral cortical neurons induced by withdrawal of astroghal trophic supportJ.Exp.Neurol,1998,149:51-63. 4 Sato M,Matsuki Y,Oguma T,et al.Inhibition of glucocorticoid-induced apoptosis by the expression of antisense gene of mitochondrial ATPase subunit 6（1）J.Lett,2000,478（1-2）:34-38. 5 姜泊,主编.细胞凋亡基础与临床M.北京:人民军医出版社,1997:119. 图4 不同浓度 Dex作用24小时、48小时、72小时后Caspase-3的改变 表1 不同浓度Dex作用24小时、48小时、72小时后Caspase-3蛋白表达量的改变（%，n3，X±S）