大鼠肝脏解剖图.docx

大鼠肝脏解剖图 摘 要：目的：探讨临床有效的调脂、抗动脉粥样硬化中药复方（院内协定方）对试验性高脂大鼠肝脏SR-BI表达的影响，以进一步阐明其防治动脉粥样硬化的机理。方法：将48只雄性Wistar（清洁级）大鼠随机分成正常组、模型组、比照组、治疗组，除正常组外均造成高脂血症模型。治疗组赐予具有祛痰化瘀功效的中药复方治疗，比照组赐予阿托伐他汀钙治疗，给药4周，检测各组大鼠血清胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇，肝细胞高密度脂蛋白受体SR-BI mRNA及蛋白表达。结果：中药复方可以降低大鼠血清胆固醇及低密度脂蛋白水平，其效果与比照组相近；可以上升高密度脂蛋白水平，疗效优于比照组；药物治疗组均可降低大鼠肝组织SR-BI mRNA和蛋白表达。结论：中药复方对高脂大鼠的血脂水平具有调整作用，可以对高密度脂蛋白受体SR-BI进行有效调控，此种调控可能是其抑制动脉粥样硬化发生的机理之一。 关键词：动脉粥样硬化;祛痰化瘀;血脂;SR-BI 中图分类号：R285.5文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)11-2317-04 The Impact ofChinese Herbal Formula to the Expression of High-density Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) Receptor SR-BI of High-fat Rats Liver Tissue CHEN Min, SU Lin (The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shengyang 110032, Liaoning, China) Abstract:Objective:Discusse the impact ofChinese herbal formula (a formula of the hospital )which has the effect of regulating lipid and anti-atherosclerosis to the expression of HDL-C receptor SR-BI of high-fat rats"liver tissue.And elucidate the mechanism of this formula how to prevent atherosclerosis.Methods:We divide 48 Wister rats (Clean-class) to four groups:normal group，model group，control group and treatment group by random,and cause hyperlipidemia model to all rats expect rats of normal group. Treatment group is treated by Chinese herbal formula which has the effect of Qutan Huayu, control group is treated by Atorvastatin Calcium.After 4 weeks treatment,analysis totalcholesterol(TC)，triglyceride(TG)， HDL-C，low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)， high density lipoprotein -receptor SR-BI mRNA and the ptotein that high density lipoprotein -receptor SR-BI mRNA expresses.Results:Chinese herbal formula can reduces TC and LDL-C of rats blood-serum,and the effect is samilar to the control group;can rise HDL-C,and the effect is better than the control group; both Chinese herbal formula and Atorvastatin Calcium can reduce high density lipoprotein-receptor SR-BI mRNA and the ptotein it expresses.Conclusion: Chinese herbal formula can regulates lipid of High-f at rats,can regulates high density lipoprotein-receptor and the protein it expresses,and this kind of effect may be one of the mechanism why Chinese herbal formula can inhibites atherosclerosis. Key words：Atherosclerosis; Qutan Huayu; lipid; SR-BI FQ(5。25，X-W 多项探讨表明，动脉粥样硬化与血浆高密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关，作为高密度脂蛋白受体，SR-BI可调整高密度脂蛋白代谢，排出过多的胆固醇，抗动脉粥样硬化。笔者在临床中应用多年的中药复方具有健脾祛痰化瘀之效，可以调整血脂水平，改善由动脉粥样硬化引起的冠心病，本试验通过探讨其对高脂大鼠肝脏SR-BI表达的影响，来进一步探讨其防治动脉粥样硬化发生的机理。 1 试验材料 1.1试验动物健康雄性Wistar大鼠48只，体重（180±20）g，由辽宁中医药高校试验动物中心供应，合格证号SCXK（辽）2004-0018。 1.2药物及制备 祛痰化瘀方药物组成：丹参30g,赤芍20g，胆南星15g，生山楂20g，川芎20g，石菖蒲10g，绞股蓝15g，黄芪25g等。 饮片购于辽宁中医药高校附属医院，鉴定符合处方要求。水煎浓缩成13浓度，即每毫升含3g生药，4冷藏备用。 阿托伐他汀钙(立普妥)胶囊为辉瑞制药有限公司生产（中国，大连），批号J20030048，每片含20mg，成人用量10mg/d，配成10%混悬液，即每毫升水含药物0.1mg，4冷藏备用。 1.3 试剂及仪器 胆固醇（批号 F20070131）：国药集团化学试剂沈阳有限公司；丙基硫氧嘧啶（国药准字H32020795）：南通精华制药有限公司；血清总胆固醇（批号070381）、甘油三酯（批号071391）、高密度脂蛋白（批号070188）、低密度脂蛋白（批号070141）：中生北控生物科技股份有限公司；Trizol（批号317052）:北京天来生物医学科技有限公司；RT-PCR试剂盒（批号200742689）: 大连宝生生物有限公司；HDL-R抗体:武汉博士德生物有限公司。CL-7200全自动生化分析仪:日本岛津公司制造；PCR仪：德国Whatman.Biometra； DY89-型电动玻璃匀浆机：宁波新芝科器探讨所；Chemi Imager 5500凝胶图像采集。 2 试验方法 2.1 动物分组和造模 大鼠随机分正常组、高脂血症模型空白组（模型组）、比照组、祛痰化瘀组(治疗组)，每组10只。正常组喂饲一般饲料(面粉20%、米粉 2%、玉米20%、麸皮25%、豆料20%、骨粉2%、鱼粉2%),其余3组每天喂饲高脂饲料(2胆固醇、05胆酸盐、5蔗糖、8猪油、02 丙基硫氧嘧啶和823一般饲料),均由沈阳市于洪区利民试验动物饲料厂供应。共饲养4周。 2.2 给药方法 参照中药药理试验方法学人和动物按体表面积换算方法，大鼠用药量为成人（60kg体重）常量的6倍。治疗组以每天22g生药kg灌胃给药；比照组以每天0.8mg阿托伐他汀灌胃给药；正常组及模型组给等体积生理盐水灌胃。 2.3 取材与切片制备 给药4周后，禁食12h，自由饮水，早晨8时，20乌拉坦(0.5mL/100g体重)麻醉，腹主动脉取血10mL， 3000r/min离心15min，取上清移入EP管-20冰箱保存。取部分肝左叶放于EP管中，加入1mL Trizol液中保存备用。另取肝右叶组织放入EP管-20冰箱保存备用。 2.4检测指标 2.4.1 血脂 采纳酶比色法。 2.4.2 RT-PCR检测肝细胞清道夫受体SR-BI mRNA表达 经提取总RNA,并以紫外分光光度计分别检测260nm、280nm处吸光度，测定OD260nm、280nm比值在1.62.0之间。由肝脏提取的总RNA反转录为cDNA：按以下条件组成反转录反应液（共10L）：MgCl2：2L；10×RNA PCR Buffer：1L；RNase Free dH2O：3.75L；dNTP Mixture(各10mM)：1L；RNase Inhibitor：0.25L；AMV Reverse Transcriptase*1：0.5L；Random 9 mers：0.5L；试验样品RNA：1L。按以下条件进行反转录反应：3010min，4230min,995min,55min。 PCR反应：PCR扩增SR-BI片断(210bp)，以-actin(532bp)做内参。SR-BI引物(上游, 5-CTC ATC AAG CAG CAG GTG CTC A-3;下游, 5-GAG GAT TCG GGT GTC ATG AA-3) 引物长42个bp，扩增cDNA全长308bp, 内参-actin (上游, 5-AAC ACC CCA GCC ATG TAC G-3;下游, 5-ATG TCA CGC ACG ATT TCC C-3) 引物长42个bp，扩增cDNA全长367bp（由大连宝生生物有限公司合成）。按以下组成配制PCR反应液（共40L）：5×RNA PCR Buffer：10L；灭菌蒸馏水：28.75L；TaKaRa Taq：0.25L；上游特异性PCR引物：0.5L；下游特异性PCR引物：0.5L。反应条件：94预变性2min起先循环，94 40s55 40s72延长1min，共30 Cycles。最终72充分延长，5min。电泳及成像：反应产物放在一起走2%琼脂糖电泳（133v 57MV 40min）,溴已锭浸泡10min，凝胶仪成像并分析。以上反应重复3次，取得一样性结果。 2.4.3Western-Bloting检测肝细胞高密度脂蛋白受体SR-BI的蛋白表达 分别以裂解缓冲液提取胞浆蛋白，膜蛋白提取液提取膜蛋白，利用差速离心法提取细胞核后以核裂解液提取核蛋白。分光光度计定量样品蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：分别灌分别胶、浓缩胶,加各组样品50g，湿式电泳槽电泳（120V，1h）。转印：将电泳产物转印至硝酸纤维素膜（电压50V，电流100mA，2h）。加封闭液12h。靶蛋白与第一抗体反应及其次抗体反应：SR-BI用含BSA的T-Tween-20(TTBS)以1300稀释，4孵育过夜，TTBS洗涤。HRP标记兔抗山羊IgG，以12000稀释，室温孵育2h，取出后TTBS洗涤。显色与分析：将膜放于发光试剂1mi，暗盒中曝光1min，显影5min，定影5min。凝胶图像采集系统分析结果。 2.5统计学处理 采纳SPSS10.0统计软件，进行单因素方差分析,两两比较用t检验，结果表示为±s。 3结 果 3.1 祛痰化瘀方对高脂大鼠血脂的的影响 3.1.1 祛痰化瘀方对高脂大鼠的血清TCTG的影响 见表1。 从表1可看出，模型组大鼠血清TC,TG水平明显高于正常组(P0.05 )。结果说明，祛痰化瘀方具有显著降低血清TC、TG作用，其作用与比照组相当。 3.1.2 祛痰化瘀方对高脂大鼠血清LDL-C HDL-C的影响 见表2。 从表2可看出，模型组大鼠血清LDL-c含量上升，与正常组比较有特别显著性差异(P0.05)。结果说明，祛痰化瘀方具有显著降低血清TC、TG作用，其作用与比照组相当。模型组大鼠血清HDL-C含量降低，与正常组有特别显著的差异(P0.05)。 3.2祛痰化瘀方对高脂大鼠肝脏组织HDL-C受体的表达影响 3.2.1RT-PCR检测各组对高脂血症大鼠肝脏组织的SR-B I受体mRNA表达影响 见图1。 如图1所示：正常组在在422bp处出现较强的扩增条带，在308bp处出现条带较暗，提示该正常组肝脏SR-BI mRNA的表达很少，模型组在308bp、367bp处出现比较强的扩增条带,提示该组中高密度脂蛋白受体SR-B I mRNA的表达水平较高。各治疗组在308bp处出现的条带较模型组暗，表明各治疗组SR-B I mRNA的表达很少。 3.2.2 Western blot检测各组对高脂血症大鼠肝脏组织SR-B I受体蛋白的表达影响 见图2、表4。 图2 Western blot检测各组对高脂血症大鼠肝脏组织SR-B I受体蛋白的表达 如图2所示：正常组大鼠肝脏组织SR-B I表达较低，模型组肝脏组织SR-B I表达明显增高，而各治疗大鼠肝脏组织SR-B I表达较模型组明显降低。 4讨 论 流行病学探讨证明，血浆高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cho-Iesterol,HDL-C)水平与AS的发生呈负相关关系。临床探讨(FramingHeart Study)证明血浆HDL-C的水平降低使冠心病(CAD)的危急性增加，越来越多的探讨均证明了HDL-C的抗AS作用1-3。 1996年，Acton等克隆了SR-BI cDNA，并通过对转染SR-BI的中华仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary, CHO)细胞的探讨发觉了B类清道夫受体I (scavenger receptor class B type I,SR-BI)即为高密度脂蛋白受体，是第一个分子明确的细胞表面HDL受体，后被公认为细胞表面HDL受体。 SR-BI是一种脂肪酞糖蛋白，它存在于多种组织，在成年的小鼠4、大鼠5、奶牛和人6-7的肝脏和肾上腺皮质、睾丸、卵巢等产类固醇组织中高水平表达;在人单核细胞8、人和小鼠巨噬细胞、胚胎发育阶段的滋养层和卵黄囊脏层内皮细胞、培育的乳腺细胞9中少量表达;另外在人和小鼠动脉粥样硬化病变组织、内皮细胞、平滑肌细胞10及泡沫细胞中也检测出了SR-BI。 20年前探讨发觉HDL胆固醇转运与LDL胆固醇介导的细胞作用不同,HDL胆固醇转运的过程被称为“选择性脂质摄取”11-12，因为HDL与细胞结合后，只有HDL中的一些成分进人细胞，主要是HDL-C(以胆固醇醋形式)被有效地转运而且失去脂质的HDL颗粒分解后可再进人循环。自从1996年发觉SR-BI受体后，人们对该受体的生理作用进行了一系列探讨，在啮齿动物中SR-BI可以调整HDL代谢、胆固醇转运至肝脏和产类固醇组织、促进胆道胆固醇排出。假如肝脏过度表达SR-BI常伴随血浆HDL-C水平下降及胆道胆固醇增加，但不伴有胆酸或磷脂增加。SR-BI的生理作用是通过介导HDL选择性脂质摄取、细胞胆固醇外流实现的。肝脏是机体排出多余胆固醇的重要器官，HDL可以从外周组织摄取过剩的游离胆固醇，因为这些组织没有降解或排出胆固醇的实力，这些游离胆固醇在卵磷脂胆固醇醋酸转移酶及胆固醇醋转运蛋白的作用下，转化为胆固醇醋后干脆(在HDL,中)或间接(转化为其他脂蛋白成分)转移至肝脏，这一过程被称为RCT13-16。肝脏的SR-BI可使胆固醇醋通过选择性摄取进人肝细胞，在肝细胞内胆固醇被分泌人胆道转化为胆酸排出体外，或者再组装成脂蛋白进人血浆17。胆道分泌胆固醇是机体排出多余胆固醇的主要途径，其中，RCT是这一途径的主要过程，SR-BI事实上参加了RCT的最初与终末阶段，通过这一过程解除过多的胆固醇，防止动脉壁胆固醇蓄积，从而起到抗动脉粥样硬化作用。 然而一项他汀类药物临床试验的结果令人困惑，Torcetrapib试验的结果显示，显著上升HDL-C（72.1%），主要终点事务（冠心病死亡、非致死性心梗、卒中、需住院治疗的不稳定心绞痛）风险未降反增18。上升HDL-C是否获益？被Medscape网站列入2007年Top 10 CME话题(Raising High-Density Lipoprotein Cholesterol:What Are We Learning Form the Torcetrapib Experience)。因此令人反思而提出HDL-C的“质”比“量”更重要。导致HDL-C功能变更的因素可能包括慢性系统性炎症如冠心病、糖尿病、自体免疫性疾病等，使HDL-C颗粒构成发生变更，从而失去抗动脉粥样硬化作用，如使HDL-C上的apoA-1含量削减，结构功能受损，影响胆固醇逆转运，HDL-C内的抗氧化酶（如对氧磷酸）含量削减，同时形成氧化性磷脂19。 本试验采纳的中药复方具有健脾祛痰化瘀的功效，是在临床应用多年，具有调脂、防治动脉粥样硬化作用的有效处方。结果表明，中药复方可以降低由高脂饲料导致的胆固醇、低密度脂蛋白的上升，其效果与比照组阿托伐他汀相近；中药复方可以上升高密度脂蛋白，效果优于比照组阿托伐他汀。本试验分别采纳RT-PCT检测SR-BI mRNA的表达、Western blot印迹法检测SR-BI蛋白质的表达。结果显示，与正常组比较，模型组肝组织SR-BI mRNA和蛋白质表达上升。药物治疗组肝组织SR-BI mRNA和蛋白质表达均有明显降低。结果表明，祛痰化瘀方对HDL的受体SR-BI进行有效调控可能是其防治As发生的机理之一。本试验检测了大鼠HDL-C、HDL的受体SR-BI，对于HDL-C的质量有待于在今后的试验中进一步检测。 参考文献 1 Gordon DJ，Rifkind BM. High-density lipoprotein:the clinical implications of recent studiesJ. N Engl J Med，1989,321:1311-1316. 2 Bater PJ，Rye KA.High density lipoproteins and coronary heart diseaseJ.Atherosclerosis，1996，121:1-12. 3Stein 0，Stein Y. Atheroprotective mechanisms of HDLJ.Atherosclerosis，1999，144:285-301. 4Acton S，Rigotti A，Landschulz KT. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptorJ. Science，1996，271:518-520. 5 Landschulz KT，Pathak RK，Rigotti A，et al. Regulation of scavenger re-ceptor，class B，type I，a high density lipoprotein receptor,in liver and steroidogenic tissues of the ratJ. J Clin Invest，1997,98:984-995. 6 Murao K，Terpstra V，Green SR，et al. Characterization of CLA-1，a hu man homologue of rodent scavenger receptor BI，as a receptor for high den city lipoprotein and apoptotic thymocytesJ. J Biol Chem，1997，272:17551-17557. 7 Gao G，Garcia CK，Wyne KL，et al. Structure and Iocalization of human gene encoding SR-BI/ CLA-1， evidence for transcriptional control by steroidogenic factorsJ. J Biol Chem，1997，272:33068-3076. 8 Hirano K，Yamashita S，Nakagawa Y，et al. Expression of human scaven ger receptor class B type I in cultured human monocytederived macropha ges and atherosclerotic lesionsJ. Circ Res，1999,85:1-116. 9 Xu S，Laccotripe M，Huang X，et al. Apolipoproteins of HDL can directly mediate binding to the scavenger receptor SR- BI，an HDL receptor that mediates selective lipid uptakeJ. J Lipid Res，1997,38:1289-1298. 10 Yeh YC，Hwang GY，Liu IP，et al. Identification and expression of scavenger receptor SR-BI in endothelial cells and smooth muscle cells of rat aorta in vitro and in vivoJ. Atherosclerosis，2002，161:95-103. 11 Leitersdorf E，Stein 0，Eisenberg S，et al. Uptake of rat plasma HDL sub fractions labeled withH.chlesteryl linoeyl ether or with I125 by culturedtat hepatocytes and adrenal cellsJ. Biochem Biophysi Acta，1984，796:72，43，29. 12 Reaven E，Chen YI，Spicher M，et al. Morphological evidence that highdensity lipoproteins are not internalized by steroid producing cells during insitu organ perfusionJ. J Clin Invest, 1984，74:1384-1397. 13 Johnson WJ，Mahlberg FH，Rothblat GH，et al. Cholesterol transport between cells and high density lipoproteinsJ. Biochim Biophys Acta，1991,1085:273-298. 14 Fielding CJ，Fienlding PE.Molecular physiology of reverse cholesteroltransportJ. J Lipid Res，1995，36:211-228. 15 Oram JF, Yokoyama S. Apolipoprotein-mediated removal of cellular choIesterol and phospholipidsJ. J Lipid Res，1996，37:2473-2491. 16 Tall AR. Plasma cholesteryl ester transfer proteinJ. J Lipid Res，1993，34: 1255-1274. 17 Cohen DE. Hepatocellular transport and secretion of biliary lipidsJ.CurrOpin Lipidol，1999,10:295. 18 Barter,PJ. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary eventsJ. N Engl J Med, 2007,357:2109. 19Ansell BJ. Inflammatory/Antiinflammatory Properties of High-Density Lipoprotein Distinguish Patients From Control Subjects Better Than High-Density Lipoprotein Cholesterol Levels and Are Favorably Affected by Simvastatin TreatmentJ.Circulation, 2003,108:2751-2756.