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生物分子学,第9章,基因工程第九章 基因工程 学习目标 驾驭：1基因工程的概念。 2基因工程的基本过程。 熟识：1基因工程常用工具酶 2基因工程载体必备的条件和常用载体 了解：1基因工程在科研和临床中的应用。 1973年，是Cohen等人首次将不同DNA分子在体外进行连接获得重组DNA分子，并在大肠杆菌中胜利表达，由此开创了基因工程。此后，基因工程作为分子生物学的一项重要技术得到了快速发展。基因工程(genetic engineering)又称为分子克隆技术或重组DNA技术，是将目的DNA与具有自我复制实力的载体DNA连接形成重组DNA分子，然后将其导入受体细胞中进行复制或表达相关基因产物的过程。利用基因工程可以得到大量的目的DNA分子或目的基因的表达产物，并对其产物进行分析。在遗传病、心血管病、肿瘤等多种疾病的探讨和治疗供应了新的方法和途径，它对生命科学的发展起到了不行估量的作用。 第一节 基因工程的工具酶 基因工程中须要对DNA分子进行切割、重新连接、修饰及合成等操作，这些过程中须要很多酶类来完成，主要有限制性核酸内切酶、外切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及反转录酶等。基因工程中常用的工具酶见表9-1。表9-1基因工程中常用的工具酶 工 具 酶 主 要 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异核苷酸序列，切割DNA分子 DNA连接酶 催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封闭或使两个DNA分子连接 DNA聚合酶I 具有53的聚合酶活性、53的核酸外切酶活性和35的核酸外切酶活性，用于合成双链DNA分子，制作DNA探针，DNA序列分析 BAL31核酸酶 具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性 DNase I 在适当的条件下，能在双链DNA上随机地产生单链切口。用于缺口平移标记DNA探针、DNaseI踪迹分析法鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点 碱性磷酸酶 切除核酸5末端磷酸基团，在重组DNA时防止线性化的载体分子发生自我连接 核酸外切酶III 从双链DNA的3羟基末端去除单核苷酸，使双链DNA分子产生单链区 T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，常用来标记核酸分子的5末端，或使寡核苷酸磷酸化 末端转移酶 催化5脱氧核苷三磷酸按53方向进行聚合，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3羟基末端，用于在3羟基末端进行同聚物加尾 反转录酶 催化以RNA为模板合成DNA的反应，可合成CDNA、替代DNA聚合酶I进行填补、标记或DNA序列分析 Taq DNA聚合酶 催化PCR反应 一、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子内部的特异DNA序列并在其内部或四周通过水解3，5-磷酸二酯键将DNA链打断的核酸内切酶。绝大多数的限制性核酸内切酶来源于细菌，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系（restriction modification systerm），主要用于限制外源DNA、爱护自身DNA。（一）命名原则及分类 限制酶的命名依据首次发觉该酶类的细菌的属名与种名相结合的原则，通常用三个斜体字母的缩略语来表示。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；其次、第三个字母取自该细菌的种名，用小写；若细菌有株系，则用第四个字母代表株；若同一菌株含有多种限制酶，则用罗马数字表示其发觉和分别的先后依次。例如： EcoR I ：E 代表Escherichia属 co代表coli种 R代表RY13株 I代表该菌株发觉分别出的第一种酶 限制酶依据结构及作用方式不同可分为三类：I型、II型及III型，反应均须要Mg2+参加。I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别序列的随意处切割DNA链。因其不能产生特异性的限制片段和明确的凝胶电泳条带。III型限制性内切酶也是一类兼有限制一修饰两种功能的酶。它们在识别序列之外旁边切开DNA链，并且要求DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割，这类酶很少能产生完全切割的片段。由于I型和III型酶的特异性不强，因此，都不具备好用价值，基因工程不运用。我们通常所说的限制酶是指II型限制性核酸内切酶，它能在其识别序列内部或旁边特异地切开DNA链，其切割位点的序列可知、固定，其产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此，只有II型限制性核酸内切酶在基因工程中得到广泛应用，是最重要的工具酶。（二）II型限制性核酸内切酶作用特点 1识别序列的碱基个数II型限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列为4bp、6bp、8bp。例如Not I的识别序列为GCGGCCGC； EcoR I的识别序列为GAATTC。假如DNA中的碱基序列是随机排列的，则一个识别4bp的限制酶出现识别并切割的位点的频率，可能是每隔256bp(44bp）就会出现一次。依此类推，识别的6bp或8bp出现的间隔分别是46bp和48bp。对一段特定的DNA而言，限制酶识别的序列越短，切割位点数越多，切割后产生的片段也越小；相反识别的序列越长，则切割位点数越少，切割后产生的片段越大。2识别的序列为回文结构 II型限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列具有回文结构(palindrome)，又称为二元旋转对称结构或反向重复序列，指在两条核苷酸链中，从53方向的核苷酸序列是一样的。如EcoR I的识别序列，在两条核苷酸链中，从53方向都是5-GAATTC-3。3切割产生粘性末端或平端不同的限制酶切割双链DNA的方式也不尽相同。大多数酶交织切开DNA，产生带有5或3单链突出的末端，称为粘性末端(sticky end)。如EcoRI切割DNA后产生5粘性末端： 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G 3-CTTAA AATTC-3 G-5 + 也有部分限制性核酸内切酶切开DNA后，产生5或3端平齐的末端，称为平端(blund end)或钝端。如Sam I切割后产生平端： 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 5-CCC 3-GGG GGG-3 CCC-5 + （三）异源同工酶和同尾酶 1异源同工酶 有些限制酶虽来源不同，但能识别和切割同一序列，称为异源同工酶（isoschizomers）或同裂酶。如Bst I和BamH I能识别同一序列并在相同位点切割 (GGATCC)。产生相同的粘性末端。2同尾酶有些限制酶虽识别序列不同，但切割DNA序列后产生相同的粘性末端，称为同尾酶（isoaudamers)，如BamH I(GGATCC)和Sau3AI(NGATCN）。产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end)。配伍末端相互可进行连接，但连接后的序列不能再被原先的酶识别切割。（四）影响限制性核酸内切酶作用的因素 影响限制性内切酶作用的因素包括DNA的纯度及结构、DNA的甲基化程度、缓冲液、反应温度、作用时间等。酶单位数是以切割线性DNA为标准规定的，消化其他类型DNA时应依据DNA分子大小、形态等适当增加或削减所需的酶量。1DNA的纯度和结构 DNA样品中残留蛋白质、RNA和有机溶剂等杂质或高分子量DNA、超螺旋DNA均会降低内切酶的消化效率。2DNA甲基化 限制性核酸内切酶识别和切割的DNA序列甲基化后不能被识别切割，DNA序列中甲基化的程度及位置均会影响限制性核酸内切酶的作用。3反应缓冲液 限制性核酸内切酶反应缓冲液的主要成分包括Tri-HCl、氯化镁、氯化钠或氯化钾、-巯基乙醇或二硫苏糖醇、牛血清白蛋白及甘油等。不同的限制性内切酶对缓冲液盐浓度的要求各不相同。一般配制低盐（10mmol/L NaCl)、中盐（50mmol/L NaCl）和高盐（100mmol/L NaCl）3种缓冲液，用于满意不同酶的消化反应。当用两种酶消化DNA时，若各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若须要的盐浓度不相同，则必需先用低盐浓度的限制性内切酶消化后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，接着消化。由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5（V/V）会抑制内切酶的作用，因此在20l反应体系中，甘油浓度应少于1l。4反应温度刚好间不同限制性内切酶的最适温度不同，大多数酶的最适反应温度为37，个别例外，如Sma I为25，Bcl I为50。反应时间可依据酶和底物的量加以调整，时间太长可能使酶产生非特异性切割，太短则消化不完全。5限制性核酸内切酶纯度和用量酶的纯度及酶的用量对酶切反应有肯定的影响。二、T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）是一单链多肽，分子量为68kD，可催化一个双链DNA的3羟基与另一双链DNA的5磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA片段连接起来。三、DNA聚合酶I DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是第一个从大肠杆菌中发觉的DNA聚合酶，由单条多肽链构成，分子量为109kD。该酶具有三种酶活性：53DNA聚合酶活性、53核酸外切酶活性和35核酸外切酶活性。可用于DNA探针缺口平移标记、3粘性末端的标记等。DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段又称klenow片段（klenow fragment），保留了53DNA聚合酶活性及35核酸外切酶活性。Klenow片段主要用于： 补齐双链DNA的3末端； 补齐的同时可对3末端进行标记； 合成cDNA的其次条链； DNA序列测定。四、反转录酶 反转录酶（reverse transcriptase）催化以RNA为模板合成cDNA的反应，合成方向为53。反转录酶缺乏35核酸外切酶活性，但具有RNaseH活性，可从5或3末端特异的降解RNA-DNA杂交分子的RNA链，是用于构建cDNA文库、反转录PCR等技术中的关键工具酶。五、末端转移酶 末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT），又称末端脱氧核苷酰转移酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶无需引物即能催化dNTP按53方向逐个加在DNA分子的3羟基末端。该酶是一种非特异性酶，4种dNTP中任何一种均可作为其底物，主要用于DNA 3末端的标记或同聚尾加尾，制备便于重组连接的人工粘性末端；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行基因克隆。六、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）可去除DNA或RNA链5末端的磷酸基团。在载体和目的DNA重组的过程中，用碱性磷酸酶水解载体5端磷酸基团，可防止其自身连接环化，提高重组效率。DNA和RNA片段进行5端标记前需用该酶处理。常用的碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）两种。CIP在1% SDS溶液中68加热15分钟可失活，因此较为常用。七、其他工具酶 基因工程中还常会用到其他工具酶，例如TaqDNA聚合酶及其他耐高温DNA聚合酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、T4多聚核苷酸激酶等。 其次节 基因工程的载体 目的DNA片段不具备自主复制实力，即使导入宿主细胞，也不能随宿主细胞的增殖而复制和表达，从而达不到使外源DNA片段扩增的目的。因此，目的DNA必需借助载体DNA分子才能进入宿主细胞进行复制和表达。载体（vector）就是能携带外源目的DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子，大多数载体为环状双链DNA，少数为线性。目的DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。 载体按功能分为克隆载体（cloning vector）和表达载体（expressing vector），前者用于克隆和扩增外源DNA片段；后者用于表达外源基因。有些载体兼备克隆和表达两种功能。志向载体必需具备的条件： 包含一个复制起始点，在宿主细胞内可独立自主进行复制； 易于从宿主细胞中分别提纯； 具备一个或多个筛选标记，利于筛选克隆的重组子； 包含多个限制酶的切点，即多克隆位点（multiplecloningsite，MCS)，便于目的基因的插入； 具有较高的遗传稳定性。以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有：质粒、噬菌体、粘粒和M13噬菌体。近年来发展了一系列新的载体系统，它们能在细菌中扩增，在真核细胞中表达。随着基因治疗探讨的深化，构建了一系列病毒载体系统。一、常用的克隆载体 （一）大肠杆菌克隆载体 以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有质粒、噬菌体和粘粒。1质粒 质粒（plasmid）是常用的克隆载体。是独立存在于细菌染色体之外，能自主复制的闭合环状双链DNA分子。自然质粒通常缺乏高质量的克隆载体所必需的元件，需通过人工构建才能应用于基因工程中。质粒一般具有以下特征： 分子相对较小，大小从2200kb不等，能在细菌内稳定存在； 具有松弛型复制子； 具有一个以上的遗传标记，便于对宿主细胞进行选择，例如抗生素的抗性基因Ampr、Tetr等； 具有多个限制性内切酶的切点，便于外源基因的插入； 有较高的拷贝数。(1) pBR322质粒 pBR322质粒是较早构建的一种质粒载体，分子相对较小，仅4363bp，具有氨苄青霉素抗性（Ampr）和四环素抗性（Tetr）两个基因，很多重要的单一限制酶位点密集于Ampr和Tetr区，便于外源DNA的插入和筛选，见图9-1。 图9-1 pBR322质粒物理图谱 （2）pUC系列质粒 pUC系列质粒是在pBR322质粒载体的基础上改造而成的，长度约为2.7kb，包含一个氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的片段，lacZ基因的片段编码-半乳糖苷酶N端的氨基酸序列（146个氨基酸残基），Puc质粒结构见图9-2。 图9-2 Puc18质粒物理图谱 （3）穿梭质粒 穿梭质粒(shuttle plasmid)是人工构建的具有两种不同的复制起点和筛选标记、能在两种不同种属的受体细胞中存活和复制的质粒。克隆在此类载体上的外源基因可以不必更换载体干脆从一种受体细胞转入另一种受体细胞中复制并遗传。例如大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒（如YEp13)、大肠杆菌一枯草杆菌穿梭质粒（如pBE2）、大肠杆菌一动物细胞穿梭质粒（如pBPV-BV1）、大肠杆菌一植物细胞穿梭质粒（如Ti质粒）等。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草杆菌、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。因此大多数真核载体都构建成穿梭质粒。大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒YEp13的结构中，包含pBR322的完整序列、2m质粒的复制起点和酵母选择基因LEU2等。 质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段，主要用做亚克隆载体。一般说来，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 2噬菌体载体 噬菌体（bacteriophage，phage）是一类感染细菌的病毒，常用作克隆载体的噬菌体主要有噬菌体和M13噬菌体两种。两者的基因结构与生物学性状各不同，用途也不同。（1) 噬菌体载体 野生型噬菌体DNA是一种双链线性DNA分子，全长48.5kb，两端各带有一条由12个碱基组成且互补的5单链粘性末端。噬菌体在大肠杆菌中繁殖所需的序列在左右两臂，中间大约40的区域不是病毒生活所必需，可以除去。噬菌体感染大肠杆菌后，线性DNA分子即借助两端的粘性末端互补配对形成环状分子，连接区域称为cos位点(cohesive-endsite)，是噬菌体包装的必需序列。只有当含有外源DNA的重组DNA大小是野生型DNA长度的75105时，才能在体外被包装成噬菌体颗粒，噬菌体载体的体外包装见图9-3。 图9-3 噬菌体载体的体外包装示意图 野生型噬菌体经过改造，已衍生出上百种克隆载体，可分为两类： 插入型载体。插入型载体（insertionvectors）一般只有一个限制性酶切位点可供外源DNA插入，只容许小于10kb的DNA插入，通常用于构建cDNA文库或小片段DNA的克隆。如gtl0和gtl1是目前应用较广的插入型载体。能克隆7kb以下的外源DNA片段。gtl0大小为43.3Kb，含有CI基因（阻遏蛋白基因），外源基因插入后CI基因失活，使大肠杆菌形成透亮噬菌斑，而未重组的gt10则不形成透亮斑点；gt ll大小为43.7Kb，含有-半乳糖苷酶基因的片段（lacZ基因），外源基因插入后使其失活，在含X-gal的培育基上产生白色噬菌斑，而未重组的gt11形成蓝色斑点，因此很简单区分重组子和非重组子。置换型载体。置换型载体（replacement vector），有多个限制性酶切位点，经酶切后，两个位点之间的kDNA区段是入噬菌体的非必需区，可被外源DNA插入取代，可承受较大（9 Kb 23Kb)的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆真核生物的染色体DNA，多用于真核生物基因组文库的构建。目前常用的有EMBL系列和Charon系列等。噬菌体置换型载体EMBL4结构见图9-4。 图9-4 EMBL4置换型载体 （2）M13噬菌体载体 载体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠肝菌，其基因组为单链闭环DNA分子，长度约为6.4kb。M13噬菌体感染大肠杆菌后，在细菌体内以单链DNA为正链复制出互补的负链DNA，形成双链环状DNA,称为复制型(RF)M13DNA。当感染细胞内累计有100个200个RF DNA时，由于特别蛋白质的参加，此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNA，并以出芽的形式释放出新的带有正链DNA的噬菌体颗粒。复制型M13DNA可以作为克隆载体。M13噬菌体的最大优点在于从细菌释放出的颗粒中所含的是单链DNA，只与被克隆的互补双链中的一条同源，因此可用该单链作模板进行DNA序列分析，或作为标记探针用于杂交分析，也可以作为体外诱变的模板。受Ml3噬菌体感染的细菌生长受到肯定的抑制，在细菌培育基上会形成浑浊的噬菌斑。 野生型的M13DNA无常用的限制酶酶切位点，因此须要构建。在其DNA的IV基因和II基因之间，插入一段lacZ基因，它包含lacZ调控序列及编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的DNA序列，在lacZ基因中还插入了多克隆位点。Mp系列克隆载体是M13的衍生物，常见的有M13mp18和M13mp19等，二者的区分仅在于lacZ基因内部多克隆位点的依次恰好相反。含有lacZ基因的载体在进行DNA重组后，可以利用是否产生蓝白色噬菌斑或菌落）进行筛选。3粘性质粒 粘性质粒(cosmid) 又称粘粒，是一种为克隆大片段DNA而设计构建的杂合载体。它由质粒DNA与DNA的cos位点序列共同构建而成，具有质粒与入噬菌体DNA载体的双重性质，为环状双链DNA载体。粘粒的特点表现在以下几个方面： 含有质粒的复制起始点、限制酶切点及抗药性标记。当重组的粘粒在体外包装成病毒颗粒并感染大肠杆菌后，可按质粒复制的方式进行扩增； 含有噬菌体DNA的粘性末端（cos位点序列），可克隆较长的外源DNA(长达40Kb50kb)，可在体外包装成噬菌体颗粒； 本身分子较小，只有几kb，因此没有插入外源DNA的非重组粘粒不能在体外包装，利于筛选。（二）酵母克隆载体 酵母载体大多数是由细菌质粒DNA与酵母DNA构造成的穿梭质粒。目前常用的酵母克隆载体有酵母整合质粒、酵母复制质粒、酵母附加质粒及酵母人工染色体等。1酵母整合质粒 酵母整合质粒（yeast integrative plasmid，YIp）是在大肠杆菌质粒pBR322的基础上插入了一个酵母标记基因（如URA3、LEU2等），不含酵母的复制起点。YIp不能像质粒一样复制扩增，一般只以单个拷贝形式存在于细胞中，能产生稳定的重组子，但转化率极低。2酵母复制质粒 酵母复制质粒（yeast replicating plasmid，YRp）由一段包括复制起始位点（ARS）及多个酵母基因（如TRP等）在内的酵母染色体DNA和pBR322组成，可以进行复制独立。YRp转化率极高，在细胞中有很高的拷贝数，但其重组子特别不稳定，由于安排不匀称，母细胞中聚集的大量重组分子，在子代中可能造成拷贝数削减或丢失。3酵母附加质粒 酵母附加质粒（yeast episomal plasmid，YEP）是含有2m质粒的载体。YEP可含完整的2m质粒，也可只含2m质粒的复制起点和标记基因，其转化频率、在细胞中的拷贝数及稳定性与YRp相像。4酵母人工染色体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色体DNA与细菌质粒pBR322改造而成的DNA分子，具备着丝粒（centromere，CEN）、两个端粒（telomere，TEL)、自主复制序列（ARS）、选择标记（如TRP1和URA3）、大肠杆菌复制起点、Ampr 基因及限制酶酶切位点等序列。YAC装载容量大，可插入0.5Mb2Mb的外源DNA片段，用于大片段DNA的克隆，可代替噬菌体载体和粘粒载体来构建文库，人类基因组安排即采纳该载体来构建物理图谱。pYAC3是在pBR322基础上插入酵母基因构建而成，长11.4kb。插入的酵母基因包含URA3、TRP1和SUP4标记基因以及一个复制起点。克隆时，外源DNA插入SUP4基因使其失活，重组YAC导入trpl-ura3双养分缺陷的受体酵母菌，在缺乏色氨酸和尿嘧啶的培育基上长出白色克隆，非重组子则长出红色克隆，很简单推断载体中是否插入了外源基因。（三）病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞 近年来，在人类遗传病和恶性肿瘤的基因治疗探讨中，经常采纳逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体，将外源基因导入受体细胞，以达到订正遗传缺陷或杀死肿瘤细胞的目的。多数病毒载体均己质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记、以及pBR322的复制起始点组成。二、常用的表达载体 表达载体是用来在宿主细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体DNA。该类载体不仅具有复制起点、选择标记及多克隆位点等一些克隆载体所具备的性质，还包含转录和翻译所必需的DNA序列，如启动子、转录终止序列和核糖体结合位点等。依据受体细胞不同，表达载体分为原核表达载体和真核表达载体两类。（一）原核表达载体 1原核表达载体结构 以典型的大肠杆菌表达载体为例，原核表达载体具有以下结构特点：含有一个复制起点、克隆位点和筛选标记基因；具有核糖体结合位点；具有强启动子和强终止子。大肠杆菌表达载体常用的启动子有tac启动子、lacUV5启动子、噬菌体PL启动子和T7噬菌体启动子等。大肠杆菌表达载体的结构模式见图9-5。 图9-5大肠杆菌表达载体的结构模式图 2原核表达载体分类 原核表达载体按功能分为三类： 融合蛋白表达载体：目的基因连接于载体启动子后原核结构基因的下游，与载体的结构基因共用同一启动子，使目的基因与载体结构基因以融合的形式表达。通常构建于质粒载体上的原核蛋白包括谷胱甘肽巯基转移酶（GST）和分泌蛋白A等。pGEX-4T-1是一种常见的融合表达质粒载体，含有lacI、Ampr和来自pBR322的复制起点ori，在tac启动子后有一段融合蛋白GST基因序列，紧接其后的是多克隆位点，便于外源目的基因插入。 非融合型表达载体：该载体表达出的外源蛋白N端不含任何原核生物肽段，即将外源基因插入载体的原核启动子和核糖体结合位点下游，使翻译起始位点ATG位于外源基因片段的5端，这样就可以在原核宿主中表达出非融合蛋白。如pKK223-3载体就是一种非融合型表达载体。 分泌型表达载体：该载体表达出的外源蛋白N端与原核的信号肽连接在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质或培育基中。 （二）真核表达载体 真核表达载体通常含有选择标记、复制起始位点、启动子、转录终止序列、poly（A）加尾信号及克隆位点。真核表达载体大多数为穿梭载体，有两套复制起点和选择标记，分别在原核和真核细胞中起作用。常见的真核表达载体有酵母表达载体和哺乳动物细胞表达载体。1酵母表达载体 酵母表达载体多数为穿梭质粒，在酵母和大肠杆菌中均能进行复制、扩增。通常含有复制起始序列、启动子、筛选标记、分泌信号、终止子、有丝分裂稳定区及外源基因克隆位点。酵母作为酵母表达载体的宿主有很多优越性： 作为单细胞生物，其操作和生产相对简洁，成本低廉。 具有蛋白质翻译后加工和修饰系统可将表达的外源蛋白分泌到培育基中，便于纯化。 具有MOX（Methanol Oxidase)、AOX（Alcohol Oxidase)及lac4等强启动子。2哺乳动物细胞表达载体 原核启动子在哺乳动物细胞中不能发挥作用，但有些动物病毒载体的启动子，如人类巨细胞病毒（CMV）启动子、Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复序列（RSV）中的启动子等宿主范围较广，在多种受体细胞中可能有肯定的活性。因此，目前构建的很多哺乳动物细胞基因表达载体主要来源于动物病毒的基因，如腺病毒载体、反转录病毒载体、空泡病毒载体（SV40）、牛乳头瘤病毒载体等。病毒载体能相对高效、平安、稳定地将外源基因携带进入宿主细胞并实现表达。人工构建哺乳动物细胞载体应具备以下条件： 含有原核复制起始位点及抗生素抗性基因。利于外源基因片段的克隆与筛选。 具备真核细胞筛选标记基因。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidinekinase，TK）、二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，DHFR)、氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphemcolacetyltransferase，CAT)、新霉素抗性基因（neomycinresistance，NEO）等。 含有转录终止信号和polyA加尾信号。 具有哺乳动物细胞启动子和增加子。 含有可选择的剪切信号。 含有一个以上的限制酶的单一酶切位点。便于真核基因的插入。第三节 基因工程的基本原理和步骤 基因工程的基本步骤主要包括： 目的基因的获得。 载体的选择与构建。目的基因与载体连接形成DNA重组体。 DNA重组体导入宿主细胞。 DNA重组体的筛选与鉴定。 DNA重组体的扩增及表达。基因工程的基本步骤见图9-6。 图9-6基因工程的基本步骤 一、目的基因的获得 1从基因组DNA文库获得 基因组文库(genomic library）是指含有一个机体细胞基因组DNA的全套重组DNA分子的集合。从基因组文库中筛选目的基因可以通过核酸分子杂交的方法进行，即用放射性核素标记已知序列的DNA片段，后者与基因组文库中的全部克隆进行杂交，经放射自显影筛选出阳性克隆，获得目的基因。 2从cDNA文库获得 cDNA文库（cDNAlibrary）是以提取的组织细胞总mRNA，经反转录酶催化合成的双链cDNA（complementaryDNA，cDNA）与适当载体连接后转入受体细胞构建而成的。从cDNA文库中获得目的基因的方法与从DNA文库中获得的方法相同。此外，从 cDNA文库中获得还可以利用特异性抗体或特异性结合蛋白筛选目的基因。3PCR法获得 利用PCR可干脆以基因组DNA或cDNA为模板高效快速地扩增出目的基因，但前提是必需知道目的基因5、3端的各一段核苷酸序列，以设计合成适当的引物，从而可以获得特定的目的基因。4化学人工合成法获得 假如目的基因的序列已知，或能依据其蛋白质产物的氨基酸序列推导出此基因的核苷酸序列，则可以利用DNA合成仪通过化学方法合成目的DNA。此法适用于合成较小的DNA片段（100bp左右），较长的链可分段合成，然后用连接酶按肯定依次加以连接。二、载体的选择与构建 目的基因必需由合适的载体携带才能进入宿主细胞进行复制和表达。选择合适的载体主要依据基因工程的目的、操作基因的性质和大小，同时还要考虑载体中是否有合适的限制性酶切位点。几种常用克隆载体的性质和用途见表9-2。表9-2 常用克隆载体的性质和用途 载体 插入目的DNA大小 受体细胞 质粒 <10kb 细菌、酵母 噬菌体 <20kb 细菌 粘粒 <50kb 细菌 BAC <400kb 细菌 YAC <3Mb 酵母 无论选用何种载体，首先都要获得载体分子，即分别纯化入噬菌体DNA或制备粘性质粒和其他有关质粒DNA。获得载体DNA后，采纳适当的限制性核酸内切酶将载体DNA进行切割。质粒、粘性质粒、M13噬菌体复制型DNA分子经酶切后得到单一的线性分子；噬菌体DNA则是获得左臂和右臂两个线性分子。获得线性DNA分子后，用碱性磷酸酶处理，去掉5端磷酸，以便于与目的基因片段进行连接。三、目的基因与载体连接 经过不同途径获得的目的基因与构建好的载体分别经限制性核酸内切酶消化后，由DNA连接酶催化两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子。体外连接的方式主要有以下四种： （一）粘性末端连接 目的DNA和载体DNA由同一种限制酶切割后产生相同的粘性末端，或由不同的限制酶切割形成的互补黏性末端（即配伍末端），当两者一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后由DNA连接酶连接末端的缺口，成为环状重组DNA分子，此种方法最适合DNA片段连接。由一种限制酶处理过的载体因两端的碱基序列互补，可发生自身环化，形成空白载体，从而降低重组效率，为目的基因的筛选带来困难。避开的方法之一是用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，可防止其环化。（二）人工接头连接 人工接头（linker）是指人工设计合成的含有一个或多个限制酶识别位点的一段双链脱氧核苷酸片段。对于平末端的DNA可先与人工接头连接，产生新的限制性酶切位点，经切割后，可按粘性末端连接方式进行连接。（三）平末端连接 DNA经限制酶切割后产生平末端，或是粘性末端经特别酶处理，将突出的末端削平或补齐，变为平端，均可在T4 DNA连接酶催化下连接。平端连接效率远低于粘性末端连接，且不能避开载体DNA的自身环化，目的基因的插入载体还会出现正反两种方向的可能性，但是，这种连接方法适合于任何DNA片段的连接。为提高连接效率，在连接这样的DNA片段时，可适当提高连接反应中ATP及T4 DNA连接酶的浓度。（四）同聚物加尾连接 加入同聚物（homopolymer)尾是处理不易连接的DNA片段的另一种有效方法，在基因克隆中应用非常广泛。目的DNA经核酸外切酶消化，或用能产生3粘性末端的限制酶（如Pst I）消化，产生具有3羟基的单链末端，暴露出的3羟基末端在末端转移酶的催化下，将某种单一脱氧核苷酸底物逐一加到3羟基末端，形成相应的脱氧核苷酸同聚物尾（如多聚G)。载体DNA则可加上与目的DNA同聚物尾互补的脱氧核苷酸同聚物尾（如多聚C）。将两者混合后，两种DNA分子通过互补的同聚物尾互补配对形成氢键，末端间的空隙在导入宿主菌后可由DNA聚合酶I自行修复连接。四、重组DNA导入受体细胞 重组DNA分子必需导入宿主细胞，才能进行复制、表达、扩增。宿主细胞又称受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等，其中以大肠杆菌最为常用。真核细胞包括酵母、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。将重组DNA导入宿主细胞的方式有转化、感染和转染。转化(transformation)是将质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入受体细胞，使其获得新的表型的过程，常用宿主菌是大肠杆菌。转染(transfection)指将表达载体导入真核细胞的过程。感染是以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染实力的噬菌体或病毒颗粒，然后感染适当的宿主细胞，并将重组DNA导入宿主细胞。作为基因工程的宿主细胞应具备以下特征： 平安性高，有感染寄生缺陷。如原核细胞常用从大肠杆菌K12改造的平安宿主菌，在肠道内无存活率或存活率极低。 易于转化。 为限制修饰系统缺陷型。重组DNA导入宿主细胞（大肠杆菌）后可能因宿主限制酶的消化而遭破坏，因此须选用R-(restriction negative)菌株。 重组缺陷型。为了避开重组DNA自发地与宿主染色体DNA发生重组，应选择Rec-（recombination negative)菌株。 遗传表型具有互补功能。为便于转化细胞的筛选，尽量选择目的基因功能缺陷的宿主细胞。（一） 转化法 氯化钙转化法将处于对数生长期的大肠杆菌悬浮于冰冷的氯化钙低渗溶液中，细胞发生膨胀，细胞膜磷脂层形成液晶结构，并解离细胞外膜与内膜之间的部分核酸酶，促使细胞成为具有摄取外源DNA实力的细胞，即感受态细胞(competent cell)。Ca2+能与DNA分子结合成抗DNA酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附于细胞膜表面。经42热休克处理1分钟，细胞膜液晶结构发生变更，通透性增加，形成间隙，外源DNA随即进入细胞内。（二）转染法 转染是由转化和感染两个单词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。常用的方法有电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等。进入宿主细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在宿主细胞染色体外存在和表达。1脂质体转染法 阳离子脂质体(cationicliposome)是由中性磷脂和阳离子脂质组成的一种磷脂双分子层膜性结构。利用脂质体将外源基因导入到真核细胞是一种常用的简洁而快速的基因导入方法。其原理是阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包袱在脂质体中间。这种脂质双层复合物可干脆加到培育的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞质中。进入细胞的基因可在细胞中酶的作用下进行表达，但不能整合。脂质体转染法对宿主细胞无损伤，且转移效率高。这种温柔的基因转移方法适用于将各种类型核酸分子导入培育的细胞内。一种新型脂质体Lipofection即是由阳离子脂质（DOTMA）和中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）合成的。其作用机制与传统脂质体不同，并非将核酸包入脂质体囊内，而是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的DNA自发形成DNA一脂质体复合物，净电荷为正的复合物又很简单吸附到带负电荷的细胞膜表面，与细胞融合，通过细胞内吞作用进入胞内。此法适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培育细胞，且转染时不需加入血清和抗生素。可用于瞬时转染和稳定转染，转染效率高、稳定性好，近几年被广泛用于将DNA、RNA和蛋白质导入活细胞。2DNA-磷酸钙转染法 将待转化的DNA与氯化钙、磷酸缓冲液混合，形成包含DNA的微小磷酸钙颗粒，这些磷酸钙一DNA复合物粘附到细胞膜表面，细胞通过胞饮作用摄入外源DNA。此法能用于任何DNA导入哺乳类动物进行短暂性表达或长期转化的探讨，但转化效率较低。3电穿孔法 电穿孔法（electroporation）是通过短暂的高压脉冲电场使细胞膜产生瞬时的可逆性微孔通道，从而将重组DNA分子导入细胞内的方法。此法的转化效率受细胞状态、电压（0.2-2kV)、电容（25-1000F）、DNA浓度及脉冲时间（0.5-5毫秒）等因素影响。多适用于悬浮培育细胞，也可用于大肠杆菌的转化。由于操作的稳定性较好，在基因工程中应用很普遍。4显微注射法 在制备转基因动物时，可将外源基因通过毛细玻璃管在显微镜下干脆注射到受