脾虚证荷瘤小鼠模型的建立-严重肝郁脾虚的症状.docx
脾虚证荷瘤小鼠模型的建立|严重肝郁脾虚的症状 摘 要：目的：利用泻下加劳倦过度方式结合皮下接种H-22肝癌细胞的模式造成脾虚型荷瘤小鼠模型。方法：16只昆明小鼠随机分为比照组和模型组,每组8只，10天后取食量、体重、肛温、腹泻、肛门污秽、拉尾排便次数、悬空拉尾反抗时间及一般状况（拱背、毛色枯槁及脱毛、倦卧嗜睡等），作小鼠脾虚征象详情记录。取血测定血清D-木糖醇、血清胃泌素、处死剖取胸腺、脾脏称重，计算胸腺指数和脾脏指数,评价模型的建立和病理生理特点。结果：造模后，造模小鼠腋下均长出肿瘤结节，并且出现明显食少、稀便、肛门污秽、神软萎靡、喜聚堆倦伏、毛色枯槁、拱背竖毛、活动缓慢、反应迟钝等脾虚证状，以第6天最显著。结论：泻下加劳倦过度方式结合皮下接种H-22肝癌细胞的模式在小鼠体内可以胜利建立病证结合的脾虚证荷瘤模型。 关键词：疾病模型；病证结合；肿瘤；小鼠 中图分类号：R332 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0767-03 Abstract:Objective:With the method which is combined with purgation and excessive fatigue and the mode of hypodermic inoculation of H22 hepatic carcinoma cells to establish the tumor-bearing mice models with Spleen Deficiency.Method:A total of 16 mice were randomly divided into the control group and the model group, with eight in each group.10 days later, conditions of appetite，weight，rectal temperature，diarrhea，excrement around the anus，times of defecation when pulling the tails，time length of resistance when pulling the tails hang in the air and general conditions（arch back，withered and yellow coats，unhairing，lassitude and drowsiness and so on ）were recorded in detail as the symptoms of spleen deficiency. 3Get blood for the Determination of serum D-xylitol and gastrin（GAS）.And the mice were sacrificed, weigh the mice"s thymuses and spleens and calculate the thymus index and spleen index, evaluate the establishment of the model and Pathophysiologic Characteristics. Results :4It showed that after establishing the models, each mouse in model group grows tumor nodules in axillary region. And accompanied with apparent spleen-deficiency symptoms such as poor appetite, loose stool, excrement around the anus, lassitude ,tend to rest in groups, withered and yellow coats, arch its back and piloerection, slow-moving, bad-response, especially marked at the sixth day.Conclusion: 5the method combined with purgation and excessive fatigue and the mode of hypodermic inoculation of H22 hepatic carcinoma cells can set up tumor-bearing spleen deficient mice models with combination of disease and syndrome. Key words:disease modelcombination of disease and syndrome tumormice 动物移植性肿瘤模型是目前中医药抗肿瘤疗效探讨的重要方法之一。小鼠肝癌（H22）模型做为一种重要的肿瘤移植性模型，近年来被大量应用于肿瘤基础探讨及药物筛选,成为探讨中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型，国内外广为采纳而且获得了较好的结果1。依据病证结合的理念,建立肿瘤的病症结合的疾病模型目前尚处于探究阶段。本探讨通过泻下加劳倦过度方式结合皮下接种H-22肝癌细胞的模式,建立小鼠脾虚型荷瘤模型,从动物一般状况、悬空拉尾反抗时间、血清D-木糖醇、血清胃泌素、胸腺指数和脾脏指数等多角度论证模型的特征。 1 材料和方法 1.1 试剂 胃泌素放射免疫分析药盒，为北京原子高科探讨所产品，批号：050120；0.9%生理盐水注射液，为浙江省医药股份公司新昌制药厂产品，批号：20041201；5%葡萄糖注射液，为杭州民生制药厂产品，批号：10501273；间苯三酚试剂，60ml×3瓶，为南京建成生物工程探讨所产品；13.3mmol/L（2g/L）D-木糖标准品储备液2ml×1支，为南京建成生物工程探讨所产品；标准品稀释10ml×1支，为南京建成生物工程探讨所产品。 1.2 动物与分组 57周龄昆明种小鼠（雄），体重（23±2）g，清洁级，均由浙江中医药高校医学试验动物中心代购。小鼠群养，每笼5只，试验期间自由饮食，标准饲料由浙江中医药高校医学试验动物中心供应。试验室室温1822，相对湿度70%。小鼠肝癌细胞株H-22，购自中国科学院上海细胞生物学探讨所。 1.3 动物模型的制作 1.3.1 细胞培育和传代 培育条件：10%小牛血清RPMI-1640培育液、5%CO2恒温孵育箱、温度为36.5，湿度为100%。从细胞库中取出原代H-22细胞株，37下融解，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入5mL培育液，混合后1000r/min离心,5min后弃上清液，所余肿瘤细胞用RMPI-1640培育液（含15%灭活小牛血清）稀释后，接种于培育瓶，在37、5%二氧化碳、饱和湿度培育箱内进行培育，细胞呈半贴壁生长，细胞呈指数生长。一部分调整浓度为5×106/mL，台盼蓝染色活细胞计数>99%，打算试验用；另一部分接着换液传代培育。 1.3.2 脾虚模型动物模型的建立2 脾虚模型采纳泻下加劳倦过度方式，详细方式为昆明每天小鼠游泳25 min，以身体下沉为度，每日1次，且施100%番泻叶煎剂每日0.5mL/只灌胃，共6天造成脾虚模型。 1.3.3 腹水瘤模型的建立与传代 收集体外培育的对数生长期的H-22肝癌细胞，制成细胞混悬液，调整细胞数为 1×107/L,将H-22肝癌细胞悬液接种到5只昆明鼠（18-22g）腹腔内供传代用，每只昆明鼠接种0.2mL。7天至10天左右,将全身状况良好的H-22荷瘤鼠处死，无菌条件下取出腹水，以生理盐水制备癌细胞悬液，稀释成13的瘤细胞悬液，将烧杯置于冰块上，调成瘤细胞悬液浓度为1×107个瘤细胞/mL，将烧杯置于冰块上。选取中医证候造模已完成的昆明小鼠，用1 mL注射器抽吸瘤细胞悬液，每次抽吸前将瘤细胞悬液混匀，用酒精棉球消毒小鼠右侧腋窝皮肤后，每只小鼠皮下接种瘤细胞悬液0.2 mL。 1.4 指标检测与方法 1.4.1 一般状况 小鼠造模后隔日称重。造模后第1天起先给药。刚好记录小鼠活动、体态、毛色、饮食、排便以及其他改变。隔日视察各组小鼠体重改变。 1.4.2 对肿瘤生长的影响 视察造模组小鼠接种部位皮下结节状况；造模组分别于试验第14天（即末次给药后24小时）脱颈椎处死，用眼科组织剪和组织镊完整剥离腋窝皮下肿瘤，用电子天平称量瘤重。 1.4.3 对脾脏指数的影响 各组小鼠于试验第14天称重。脱颈椎处死小鼠后，解剖取脾脏，用电子天平称重，计算脾脏指数，依据公式：脾脏指数脾脏重量/体重。 1.4.4 每日定时定量赐予标准颗粒饲料，至次日收集剩余食量，称重并计算每日进食量，计算方法：每日赐予量1次日剩余食量；每3天记录1次体重、肛温、腹泻、肛门污秽状况、拉尾排便次数、拱背、毛色枯槁、嗜睡疲乏、乏力（悬空拉尾反抗时间）等状况作为小鼠脾虚征象详情记录。 1.4.5 于试验的第14天秤重，眼眶球后取血12mL，静置2h，以3000r/min离心10min。取血清0.51mL，送检作胃泌素和D木糖浓度测定。 1.4.6 血清胃泌素测定方法 采纳放射免疫方法，（步骤操作按药盒说明）。 1.4.7 血清D木糖浓度测定方法 采纳间苯三酚法，（步骤操作按药盒说明）。 1.5 统计学方法 全部数据输入计算机，用SPSS 13.0统计软件分析处理。 统计描述：计量资料数据用均数±标准差（±s）表示。 统计推断：多组间均数的比较用方差分析；均以P
