叶绿素荧光分析技术与应用精.ppt

叶绿素荧光分析技术与应用第1页，本讲稿共111页激发能激发能光化学反应光化学反应形成同化力形成同化力热耗散热耗散荧光荧光荧光的发生荧光的发生CO2CO2固定固定光呼吸光呼吸Mehler Mehler 反应反应N N代谢代谢荧光是研究光能分配的探针荧光是研究光能分配的探针第2页，本讲稿共111页第3页，本讲稿共111页将绿色植物或含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎将绿色植物或含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别，或用近红外光预照射，或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别，或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号，这过程称为植物体内叶绿素号，这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。由于这个现象最早是由素荧光动力学。由于这个现象最早是由Kautsky发现的，因此有发现的，因此有时也被称为时也被称为Kautsky效应。现已探明，在室温条件下，绿色植物效应。现已探明，在室温条件下，绿色植物发出的这种荧光信号，绝大部分是来自叶绿体光系统发出的这种荧光信号，绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的的天线色素蛋白复合体中的叶绿素天线色素蛋白复合体中的叶绿素a分子，荧光发射波长范围约在分子，荧光发射波长范围约在650780nm，荧光发射峰在，荧光发射峰在685nm和和735nm，其荧光激发光谱，其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似，荧光激发峰在与叶绿体的吸收光谱近似，荧光激发峰在438nm与与480nm左右。左右。第4页，本讲稿共111页叶绿素荧光诱导动力学是指经过暗适应的绿色植物材料当转到光下时，叶绿素荧光诱导动力学是指经过暗适应的绿色植物材料当转到光下时，其体内叶绿素荧光强度会有规律的随时间变化。根据现在国际上的统其体内叶绿素荧光强度会有规律的随时间变化。根据现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线一命名，可把荧光诱导曲线(图图1)划分为：划分为：O(原点原点)I(偏转偏转)D(小坑小坑)或或pl(台阶台阶)P(最高峰最高峰)S(半稳态半稳态)M(次峰次峰)T(终点终点)这几个相这几个相(phase)。有时在。有时在O和和I之间还可辨认出一个扔点称为之间还可辨认出一个扔点称为J相。其中相。其中OP相相为荧光快速上升阶段为荧光快速上升阶段(12s)，从，从PT为荧光慢速下降为荧光慢速下降(猝灭猝灭)阶段阶段(45s），在此阶段，往往出现复杂的情况，有时没有），在此阶段，往往出现复杂的情况，有时没有M峰，有时出现几峰，有时出现几个渐次降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境个渐次降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境胁迫的叶片胁迫的叶片M峰消失，而生理状态良好的叶片往往在峰消失，而生理状态良好的叶片往往在P峰之后有几个峰峰之后有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程。速的调节过程。叶绿素荧光诱导动力学叶绿素荧光诱导动力学第5页，本讲稿共111页OIDPSMT曲线曲线第6页，本讲稿共111页经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，体内叶绿素分子可在经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，体内叶绿素分子可在纳秒纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光，此瞬时的荧光诱导相位称为初级时间内发出一定强度的荧光，此瞬时的荧光诱导相位称为初相或相或“O”相，此时的荧光称为固定荧光相，此时的荧光称为固定荧光(F。)，然后荧光强度增加的速，然后荧光强度增加的速度减慢，因而在度减慢，因而在Fo处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，称处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，称为为“I”相和相和“D”相，数秒后荧光强度可达最高点，称为相，数秒后荧光强度可达最高点，称为“P”峰。若所峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，P峰即趋于或等峰即趋于或等于最大荧光于最大荧光(Fm)。荧光强度超过。荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为可变荧光那一部分的荧光称为可变荧光(Fv)。在在P峰之后，植物荧光通常经峰之后，植物荧光通常经12次阻尼振荡次阻尼振荡(称较大峰称较大峰“M1”和和“M 2”)，才降到接近，才降到接近Fo的稳定的的稳定的“T”相终水平。荧光强度下降的过程现称为荧相终水平。荧光强度下降的过程现称为荧光猝灭。根据植物材料和暗适应时间的不同，上述荧光诱导动力学过程光猝灭。根据植物材料和暗适应时间的不同，上述荧光诱导动力学过程要延续要延续36分钟左右。分钟左右。第7页，本讲稿共111页第8页，本讲稿共111页叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法。非叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法。非调制式荧光计的结构比较简单，它仅需要一个强连续光源，此光源既调制式荧光计的结构比较简单，它仅需要一个强连续光源，此光源既作为激发光，又作为测量光，但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升作为激发光，又作为测量光，但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升前沿中的拐点，要求整个系统的时间分辨率达到毫秒前沿中的拐点，要求整个系统的时间分辨率达到毫秒(ms)级。在光源级。在光源与样品之间，通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门。现与样品之间，通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门。现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的，由于发光二极管光在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的，由于发光二极管光源的上升前沿较快，这样就可省去电子快门。光电转换接收器可用光源的上升前沿较快，这样就可省去电子快门。光电转换接收器可用光电倍增管或光电三极管，它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长电倍增管或光电三极管，它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片，以完全范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片，以完全滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、记忆示波器或带有滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、记忆示波器或带有A/D转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序，以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步触发装置或同步程序，以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步。为了减少样品对荧光的重复吸收，通常是把接受器与入射的激同步。为了减少样品对荧光的重复吸收，通常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧。发光安排在样品的同一侧。叶绿素荧光动力学的测量方法叶绿素荧光动力学的测量方法第9页，本讲稿共111页第10页，本讲稿共111页TechnicalSpecificationsItems supplied:Control unit,remote sending unit,10 dark adaption leaf clips,4 AA batteries,carryingcase,serialcable,downloading software and instruction manual.Measured parameters:Fo,Fm,Fv,Fv/Fm,Ft,T 1/2Excitation source:Solid state 685nm source.Adjustable intensity:500-3000molmsDetectors and filters:A PIN photodiode with an IR filterTest duration:Adjustable from 2-240 seconds.Sampling rate:40Kpoints per second for fast kinetics for one second;switching to 500 points per second for two second sand then switching to 10 points per second for the remainder of the test.Digital output:RS 232 port.Storage capacity:128 kB RAM with battery backup.Supports up to 2,000 data sets.User unterface:Display-Backlit LCD 16 character x 4lines;Keypad-4 x 4 matrix keypad.Power supply:4 1.5 V AA batteries.Battery life:Up to 15 hours of continuous operation.第11页，本讲稿共111页调制式动力学荧光计至少应具有两束光：调制的弱测量光和连续的强米调制式动力学荧光计至少应具有两束光：调制的弱测量光和连续的强米化光。为了使测量光本身完全不被接收器直接检出，测量光中和接收器化光。为了使测量光本身完全不被接收器直接检出，测量光中和接收器前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分。光化光对接收器信号的前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分。光化光对接收器信号的干扰，可用折光转盘来解决。为了能够精确地测定干扰，可用折光转盘来解决。为了能够精确地测定F。值，经验证明测量。值，经验证明测量光到达样品表面时的强度要小于光到达样品表面时的强度要小于10ergscm-2 s-1。由于该强度在室温下。由于该强度在室温下不足以引起还原态不足以引起还原态QA的积累，因而荧光强度将始终保持在较低的、恒定的的积累，因而荧光强度将始终保持在较低的、恒定的Fo水平上。此时若在照有测量光的样品上再叠加一束饱和光化光，植物荧光水平上。此时若在照有测量光的样品上再叠加一束饱和光化光，植物荧光才迅速上升，并达到才迅速上升，并达到P峰，这就是峰，这就是Fv部分，此后荧光猝灭过程与前述非调制部分，此后荧光猝灭过程与前述非调制荧光猝灭过程相似。应该着重指出的是，由于调制式动力学荧光计采用了选荧光猝灭过程相似。应该着重指出的是，由于调制式动力学荧光计采用了选频或锁相放大技术，使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物频或锁相放大技术，使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物荧光调制信号，而对其他背景光的干扰不放感。荧光调制信号，而对其他背景光的干扰不放感。第12页，本讲稿共111页第13页，本讲稿共111页TechnicalSpecificationsItems supplied:Control unit,remote sensing unit,one open frame and five dark adapted leaf clips,12V 1.2Ah battery,battery charger,carrying case,serialcable,interface software and instruction manual.Measured parameters:Fo,Fm,Fv,Fv/Fm,Fs,Fms,Ft,Y,ETR,Optional clip PAR and leaf temperature.Excitation sources:Saturation pulse:35Watt halogen lamp with 690nm short band pass filter.Maximum intensity 15,000 molms Modulated light:660nm LED with 690 nm short band pass filter.Optional modulated light:450nm LED source.Intensity adjustable from 0 to 0.4molmsDetector and filters:A PIN photodiode with a 700-750 nm bandpass filter.Detection method:A modulated spectrum synchronous carrier lockin amplifier.Sampling rate:Auto switching from 10 to 1,000 points per second depending on test phase.Test duration:A djustable from 2 seconds to 45 minutes.Storage capacity:Up to 2,500 data sets and 6 traces totaling 45 minutes of recordings at 10 points per second第14页，本讲稿共111页体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点：一是它可将植物发出的荧光区分体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点：一是它可将植物发出的荧光区分为性质上完全不同的两个部分为性质上完全不同的两个部分固定荧光固定荧光(F。)部分和可变荧光部分和可变荧光(Fv)部分。部分。固定荧光固定荧光(F。)代表不参与代表不参与PSII光化学反应的光能辐射部分；可变荧光光化学反应的光能辐射部分；可变荧光(Fv)代表可参与代表可参与PSII光化学反应的光能辐射部分。因而根据可变荧光光化学反应的光能辐射部分。因而根据可变荧光(Fv)在总的在总的最大荧光最大荧光(Fm=Fv十十F。)中所占的比例（中所占的比例（FvFm)，即可简便地得出植物，即可简便地得出植物PSII原初光能转换效率，另一个特点是，荧光动力学是测定植物从暗中转到光下，原初光能转换效率，另一个特点是，荧光动力学是测定植物从暗中转到光下，其光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态，直到全部正常运转状态其光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态，直到全部正常运转状态过程中的荧光动态变化，因而它包含着十分丰富的光合信息，这远不是一般过程中的荧光动态变化，因而它包含着十分丰富的光合信息，这远不是一般静态焚光测量所能比拟的。静态焚光测量所能比拟的。第15页，本讲稿共111页在体内叶绿素荧光动力学测定中，当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发在体内叶绿素荧光动力学测定中，当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发光强恒定时，光强恒定时，PS II原初电子受体原初电子受体QA的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的主要因素。当植物经一段时间暗适应，或用优先为光系统主要因素。当植物经一段时间暗适应，或用优先为光系统I(PSl)所利用的长波光所利用的长波光照射后，其体内照射后，其体内PSII的的QA和随后的电子受体和随后的电子受体QB和和PQ库等均完全失去电子而被库等均完全失去电子而被氧化，这时氧化，这时PS II反应中心可接受光电子，即处于反应中心可接受光电子，即处于“开放开放”状态，这时荧光强度状态，这时荧光强度最弱，即为最弱，即为F。，或处于。，或处于“O”初始相；当植物被饱和光激发，使初始相；当植物被饱和光激发，使PSII电子受体电子受体QA、QB和和PQ库等完全被还原时，库等完全被还原时，PSII反应中心不再接受光电子，即处反应中心不再接受光电子，即处于于“关闭关闭”状态，这时荧光强度最强，即为状态，这时荧光强度最强，即为Fm，或处于，或处于“P”峰相。峰相。植物经短暂照光达到植物经短暂照光达到“P”峰后，由于一些光合酶系逐渐被活化，使峰后，由于一些光合酶系逐渐被活化，使PSI开始运转，而将开始运转，而将PSII还原侧的还原态电子受体还原侧的还原态电子受体QA-、QB-和和PQH2等等再氧化，从而引起荧光强度的猝灭，这称为再氧化，从而引起荧光强度的猝灭，这称为qQ猝灭；植物在光的持续照射猝灭；植物在光的持续照射下，紧接着下，紧接着qQ猝灭的增加，在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形猝灭的增加，在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜高能态。试验证明，它们也可造成荧光猝灭，这种猝灭称为能量成膜高能态。试验证明，它们也可造成荧光猝灭，这种猝灭称为能量猝灭，或猝灭，或qE淬灭。淬灭。第16页，本讲稿共111页qQ和和qE灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分。灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分。qQ猝灭因为猝灭因为是由是由QA-等再氧化所造成，因而它与光合电子传递、光合放氧等过程直接相关；等再氧化所造成，因而它与光合电子传递、光合放氧等过程直接相关；而而qE猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引起，因而它只与猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引起，因而它只与ATP的形成、积累的形成、积累以及与光合膜的状态有关，而与光合电子传递和光合气体交换无直接的联系。以及与光合膜的状态有关，而与光合电子传递和光合气体交换无直接的联系。以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为Q分析，它对于正确理分析，它对于正确理解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他光合解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他光合参数，特别是与气体交换的关系，是十分重要的，它消除了过去看起参数，特别是与气体交换的关系，是十分重要的，它消除了过去看起来似乎是相互矛盾的一些试验结果，从而为叶绿素荧光动力学在理论来似乎是相互矛盾的一些试验结果，从而为叶绿素荧光动力学在理论上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清了障碍，这是近年来上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清了障碍，这是近年来荧光动力学在理论研究方面的重要新进展。荧光动力学在理论研究方面的重要新进展。第17页，本讲稿共111页根据上述根据上述Q分析理论，西德分析理论，西德Schreiber博土近年来设计了一种新型的脉博土近年来设计了一种新型的脉冲调制荧光计，该仪器在过去一般调制荧光计的基础上，又增加一束冲调制荧光计，该仪器在过去一般调制荧光计的基础上，又增加一束强饱和闪光强饱和闪光(2000Wcm-2)，它以约，它以约5秒一次的频率，与一般段调制荧光计秒一次的频率，与一般段调制荧光计原有的强连续光化光一起，共同照射激发植物样品，以瞬时完全消除原有的强连续光化光一起，共同照射激发植物样品，以瞬时完全消除qQ猝灭，猝灭，结果在原来荧光动力学的曲线上，便形成许多叠加的锯齿状荧光脉冲，这样从结果在原来荧光动力学的曲线上，便形成许多叠加的锯齿状荧光脉冲，这样从原有的荧光动力学曲线和锯齿状荧光脉冲包络线中，就可计算出原有的荧光动力学曲线和锯齿状荧光脉冲包络线中，就可计算出qQ和和qE两个成两个成分。此外，该仪器还具有不怕其他强光源干扰的优点，甚至可拿到光下现场操分。此外，该仪器还具有不怕其他强光源干扰的优点，甚至可拿到光下现场操作。此类荧光计的代表性产品是西德作。此类荧光计的代表性产品是西德Walz公司生产的叶绿素荧光测定系统公司生产的叶绿素荧光测定系统(PAM)。第18页，本讲稿共111页(1)compact basic device(2)external rechargeable battery(3)battery charger(4)PC-HP-200(5)special fiberoptics(6)leaf-clip holder permits simultaneous PAR and C measurements(7)external halogen lamp(8).dark leaf clip(9)distance leaf-clip(10)separate micro quantum/temperature sensor(11)compact tripod,used to mount basic device,leaf-clip holder and external halogen lamp(12).transport case 第19页，本讲稿共111页Measuring light source:Red LED,650 nm,standard intensity 0.1 mol ms PAR;modulation frequency 0.6 or 20 kHz;Auto 20 kHz functionActinic light sources:Red LED-array,665 nm,max.600 mol ms PAR and far-red LED,730 nm,max.15 W mHalogen lamp:8 V/20 W,blue-enriched,710 nm);selective window amplifier(patented)Measured parameters:Fo,Fm,Fm,F,Fo,Fv/Fm(max.Yield),F/Fm(Yield),qP,qN,NPQ,PAR and C(using Leaf-Clip Holder 2030-B or Micro Quantum/Temp.-Sensor 2060-M),ETR(i.e.PAR x F/Fm)User interface:IBM/IBM-compatible PC(80286 upwards)or HP-200/P Palmtop PC;connection via RS 232,19200 baud;keyboard operation;monitor screen displayData acquisition:Via PC using DA-2000 softwareData output:Display and printout via PC;analog output 0 to 2.5 VPower supply:Internal rechargeable battery 12 V/1.2 Ah,providing power for up to 500 yield measurements;external 12 V battery;Battery Charger 2020-LDimensions:20 cm x 10.5 cm x 8.5 cm(L x W x H)Weight:2 kg(incl.battery)第20页，本讲稿共111页 以反应常数表示三种反应的速度以反应常数表示三种反应的速度kP 光化学反应光化学反应 photo-reactionkF 发射荧光发射荧光 fluorescencekD 热耗散热耗散 Energy dissipation荧光产额可表示为：荧光产额可表示为：F=kF/(kF+kP+kD)F=kF/(kF+kP+kD)。光合光合量子产额可表示为：量子产额可表示为：P=kP/(kF+kP+kD)P=kP/(kF+kP+kD)热耗散产额热耗散产额可表示为：可表示为：D=kD/(kF+kP+kD)D=kD/(kF+kP+kD)PSIIPSII作用中心完全开放时，作用中心完全开放时，kP kP最大，最大，kF kF最低，此时的荧光称为初始荧光最低，此时的荧光称为初始荧光Fo;Fo;PSIIPSII作用中心完全关闭时，作用中心完全关闭时，kP=0 kP=0，kF kF最大，此时的荧光称为初始荧光最大，此时的荧光称为初始荧光Fm;Fm;Fm Fm 与与 Fo Fo之差（之差（Fm-Fo=Fv)Fm-Fo=Fv)是因为光化学反应进行而猝灭的荧光，称为可变荧光是因为光化学反应进行而猝灭的荧光，称为可变荧光Fv.Fv.显然，光化学反应的最大潜能可表示为：显然，光化学反应的最大潜能可表示为：P=(P=(Fm-Fm-Fo)/Fo)/Fm=(Fm-Fo)/Fm=Fv/FmFm=(Fm-Fo)/Fm=Fv/Fm Fv/Fm Fv/Fm 是反映光合效率的重要指标是反映光合效率的重要指标 分析：分析：Fm Fm 下降、下降、Fv/FmFv/Fm下降、下降、Fo Fo上升的原因上升的原因叶绿素荧光动力学的生物学意义叶绿素荧光动力学的生物学意义第21页，本讲稿共111页 荧光参数的意义荧光参数的意义Fv/Fm 最大光化学效率最大光化学效率PSII=PSII=(FmFs)/Fm PS实际光化学效率实际光化学效率Fv/Fm PS最大天线转化效率最大天线转化效率P=PSII PSII PFD 光化学反应速度光化学反应速度NPQFm/Fm1 非光化学猝灭非光化学猝灭qp=(FmF)/(FmF0)光化学猝灭系数光化学猝灭系数qN=(FmF0)/(FmF0)非光化学猝灭系数非光化学猝灭系数D=1Fv/Fm 吸收光能通过热耗散消耗的部分吸收光能通过热耗散消耗的部分第22页，本讲稿共111页Fo：固定荧光，初始荧光固定荧光，初始荧光(minimal fluorescence)。也称基础荧光，。也称基础荧光，0水平荧光，是光系统水平荧光，是光系统II(PSII)反应中心处于完全开放时的荧光反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关。产量，它与叶片叶绿素浓度有关。Fm：最大荧光产量：最大荧光产量(maximal fluorescence)，是，是PSII反应中心处于反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映通过完全关闭时的荧光产量。可反映通过PSII的电子传递情况。的电子传递情况。通常叶片经暗适应通常叶片经暗适应20min后测得。后测得。F：任意时间实际荧光产量任意时间实际荧光产量(actual flourescence at any time）第23页，本讲稿共111页Fa：稳态荧光产量稳态荧光产量(fluorescence in stable state)。Fm/Fo:用来反应用来反应PSII的电子传递情况。的电子传递情况。FvFm-Fo:为可变荧光为可变荧光(variable fluorescence),反映了反映了QA的还原情况。的还原情况。Fv/Fm:PSII最大光化学量子产量最大光化学量子产量(optimal/maximal photochemical efficiency of PSII in the dark)或或(optimal/maximal quantum yield of PSII)，反映，反映PSII反应中心内禀光能转换效率反应中心内禀光能转换效率(intrinsic PSII efficiency)或称最大或称最大PSII的光能转换效率的光能转换效率(optimal/maximal PSII efficiency)，叶暗适应，叶暗适应20min后测得。非胁迫条件下该参数的变化极后测得。非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。第24页，本讲稿共111页 Pv/Fm：PSII有效光化学量子产量有效光化学量子产量(photochemical efficiency of PSII in the dark)，它反映开放的，它反映开放的PSII反应中心原初光能捕获效反应中心原初光能捕获效率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。(FmF)/Fm或或F/Fm：PSII实际光化学量子产量实际光化学量子产量(actual photochemical efficiency of PSII in the light)，它反映，它反映PSII反反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，叶片应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。不经过暗适应在光下直接测得。荧光猝灭分两种：光化学猝灭和非光化学猝灭。光化学猝灭：以光化学猝灭系荧光猝灭分两种：光化学猝灭和非光化学猝灭。光化学猝灭：以光化学猝灭系数代表：数代表：qP(FmF)/(FmFo)；非光化学猝灭，有两种表示；非光化学猝灭，有两种表示方法，方法，NPQFmFm1或或qN1(FmFo)/(FmFo)1Fv/Fv。第25页，本讲稿共111页表观光合电子传递速率：表观光合电子传递速率：(FmF)FmPFD，或，或F/FmPFD0.50.84，其中系数，其中系数0.5是因为一个电子传递需要吸收是因为一个电子传递需要吸收2个量子，而且光合作用包括两个光系统，而系数个量子，而且光合作用包括两个光系统，而系数0.84表示在入射表示在入射的光量子中被吸收的占的光量子中被吸收的占84，PFD是光子通量密度；相应表观热是光子通量密度；相应表观热耗散速率以耗散速率以(1Fv/Fm)PFD表示。表示。Fmr：可恢复的最大荧光产量，是在荧光：可恢复的最大荧光产量，是在荧光P峰和峰和M峰后，当开放的峰后，当开放的PSII最最大荧光产量平稳时，关闭作用光得到大荧光产量平稳时，关闭作用光得到Fo后，把饱和光的闪光间隔后，把饱和光的闪光间隔期延长到期延长到180s/次，得到一组逐渐增大次，得到一组逐渐增大(对数增长对数增长)的最大荧光产量，的最大荧光产量，将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在Y轴轴的截距即为的截距即为Fmr。以。以(FmFmr)/Fmr可以反映不可逆的非光化学淬可以反映不可逆的非光化学淬灭产率，即发生光抑制的可能程度。灭产率，即发生光抑制的可能程度。第26页，本讲稿共111页Fv/Fo和和Fv/Fm分别代表分别代表PSII的潜在活性和的潜在活性和PSII原初光能转化效率。光抑原初光能转化效率。光抑制条件下制条件下Fv的降低主要是由于的降低主要是由于Fm的降低，不是的降低，不是Fo增加的结增加的结果。非光化学能量耗散易造成果。非光化学能量耗散易造成Fo的降低，而光合机构被破坏又使其升高，的降低，而光合机构被破坏又使其升高，所以该参数的变化趋势可以反映引起这种变化的内在机制。所以该参数的变化趋势可以反映引起这种变化的内在机制。光化学猝灭反映的是光化学猝灭反映的是PSII天线色素吸收的光能用于光化学电子传送的份额，要天线色素吸收的光能用于光化学电子传送的份额，要保持高的光化学猝灭就要使保持高的光化学猝灭就要使PSII反应中心处于反应中心处于“开放开放”状态，所以光化学猝灭状态，所以光化学猝灭又在一定程度上反映了又在一定程度上反映了PSII反应中心的开放程度。光化学猝灭反映了反应中心的开放程度。光化学猝灭反映了PSII原初电原初电子受体子受体QA的还原状态，它由的还原状态，它由QA重新氧化形成。光化学猝灭系数重新氧化形成。光化学猝灭系数qP愈大，愈大，QA重重新氧化形成新氧化形成QA的量愈大，即的量愈大，即PSII的电子传递活性愈大。对小麦的研究表明，水的电子传递活性愈大。对小麦的研究表明，水分胁迫使得分胁迫使得qP变小，证明从变小，证明从PSII氧化侧向氧化侧向PSII反应中心的电子流动受到抑制。反应中心的电子流动受到抑制。非光化学猝灭反映的是非光化学猝灭反映的是PSII天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分。当热的形式耗散掉的光能部分。当PSII反应中心天线色素吸收了过量的光能时，反应中心天线色素吸收了过量的光能时，如不能及时地耗散将对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学猝灭是一种如不能及时地耗散将对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学猝灭是一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用。自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用。第27页，本讲稿共111页目前我国对农作物抗逆性包括抗寒性和抗热性的检测和鉴定，基本是靠各地田目前我国对农作物抗逆性包括抗寒性和抗热性的检测和鉴定，基本是靠各地田间多年观察和对比的资科中得出来的，这种田间鉴定方法周期长、工作繁重，间多年观察和对比的资科中得出来的，这种田间鉴定方法周期长、工作繁重，而且由于田间栽培和气象条件的经常变化，给鉴定结果带来误差和工作困难，而且由于田间栽培和气象条件的经常变化，给鉴定结果带来误差和工作困难，因此在生产和研究上都迫切需要一种能快速、简便和科学地检测和鉴定植物抗因此在生产和研究上都迫切需要一种能快速、简便和科学地检测和鉴定植物抗逆性包括抗寒性和抗热性的技术。逆性包括抗寒性和抗热性的技术。八十年代初以来，人们在逐渐弄清植物体内叶绿素荧光动力学与光合作用关八十年代初以来，人们在逐渐弄清植物体内叶绿素荧光动力学与光合作用关系的基础上，发现它对外界各种胁迫因子均十分敏感，因而有可能将它作为系的基础上，发现它对外界各种胁迫因子均十分敏感，因而有可能将它作为植物理想的各种抗逆性的指标和技术。目前国外有关研究论文越来越多，其植物理想的各种抗逆性的指标和技术。目前国外有关研究论文越来越多，其中以用荧光动力学鉴定植物抗寒性方面的研究开展得最早，也较为深入。中以用荧光动力学鉴定植物抗寒性方面的研究开展得最早，也较为深入。叶绿素荧光动力学的应用叶绿素荧光动力学的应用1.在鉴定植物抗寒性和抗热性中的应用在鉴定植物抗寒性和抗热性中的应用第28页，本讲稿共111页澳大利亚澳大利亚Smillie等首先将检测植物抗寒性的荧光动力学方法规范化。他们先等首先将检测植物抗寒性的荧光动力学方法规范化。他们先将待测植物的叶片置于将待测植物的叶片置于0下，经不同时间预处理后，仍在下，经不同时间预处理后，仍在0下快速检测其下快速检测其荧光动力学。发现样品荧光最大上升速率荧光动力学。发现样品荧光最大上升速率(RF)(实际为可变荧光最大上升速实际为可变荧光最大上升速率率)下降为未经下降为未经0处理的对照叶片处理的对照叶片RF的的50%时所需的时所需的0处理时间处理时间(C0T0)，作，作为该植物或品种的抗寒性的相对量度。为该植物或品种的抗寒性的相对量度。第29页，本讲稿共111页抗寒性的参数抗寒性的参数(C0T0)可在不同次试验和可在不同次试验和不问植物之间进行比较。用此方法对黄瓜、不问植物之间进行比较。用此方法对黄瓜、玉米、大豆、番石榴、芒果和葡萄等的抗寒玉米、大豆、番石榴、芒果和葡萄等的抗寒性进行了比较，均获满意结果。不足之处是性进行了比较，均获满意结果。不足之处是该方法仅局限于对低沉敏感和中等抗冷的植该方法仅局限于对低沉敏感和中等抗冷的植物，而对许多能忍受物，而对许多能忍受0以下的抗冻植物则不以下的抗冻植物则不太适用。太适用。第30页，本讲稿共111页随着低温处理时间的延长，最不抗冷的随着低温处理时间的延长，最不抗冷的889005品种经品种经24小时小时0处理后，其处理后，其M峰最先消峰最先消失，荧光猝灭也最早趋干失，荧光猝灭也最早趋干0。而最抗冷的。而最抗冷的8415品种，则要经品种，则要经72小时小时0处理，其处理，其M峰才逐峰才逐渐消失，而其荧光猝灭的完全抑制，则要渐消失，而其荧光猝灭的完全抑制，则要90小时。说明光合作用暗反应，特别是小时。说明光合作用暗反应，特别是PSII还原还原侧的电子流受到抑制。此外，对低温敏感的品种，其侧的电子流受到抑制。此外，对低温敏感的品种，其P峰和峰和Fv随着低温处理时间的延长而随着低温处理时间的延长而更迅速地减少，这说明其更迅速地减少，这说明其PSII和放氧侧更易受到低温的损伤。除了和放氧侧更易受到低温的损伤。除了RF外，叶绿素荧光动力外，叶绿素荧光动力学的其他一些参数学的其他一些参数(如如M峰、峰、P峰、峰、Fv及荧光猝灭等及荧光猝灭等)，均可综合作为鉴定植物，均可综合作为鉴定植物(品种品种)抗冷性的抗冷性的指标。指标。水稻抗寒性鉴定水稻抗寒性鉴定林世青等用调制式林世青等用调制式荧光计研究和检测荧光计研究和检测几种不同水稻品种几种不同水稻品种的抗冷性与叶绿素的抗冷性与叶绿素荧光动力学的关系。荧光动力学的关系。先将被试水稻幼苗先将被试水稻幼苗放在放在0暗中处理不暗中处理不同时间同时间(2490小时小时)，观察不同品种荧