核酸的提取及相关讲稿.ppt

关于核酸的提取及相关第一页，讲稿共八十九页哦I.I.质粒质粒DNADNA的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化第二页，讲稿共八十九页哦一、质粒的基本性质一、质粒的基本性质 质质粒粒是是一一种种染染色色体体外外的的稳稳定定遗遗传传因因子子，大大小小从从1-200kb不不等等，为为双双链链、共共价价闭闭合合环环状状DNA分分子子（covalentlyclosedcircularDNA,简简称称cccDNA），并并以以超超螺螺旋旋状状态态存存在在于于宿宿主主细细胞胞中中。质质粒粒主主要要发发现现于于细细菌菌、放放线线菌菌和和真真菌菌细细胞胞中中，它它具具有有自自主主的的复复制制和和转转录录系系统统，但但质质粒粒的的复复制制和和转转录录需需要要宿宿主主细细胞胞编编码码的的某某些些酶酶和和蛋蛋白白质质。此此外外，质质粒粒还还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。第三页，讲稿共八十九页哦质粒在细胞内的复制一般有二种：质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型紧密控制型（stringentcontrol）和和松弛控制型（松弛控制型（relaxedcontrol）。）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在许多拷贝，一般在20个以上。在细胞培养过程中，个以上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至多个扩增至1000-3000个。个。第四页，讲稿共八十九页哦质粒的不相容性（质粒的不相容性（incompatibility）利利用用同同一一复复制制系系统统的的不不同同质质粒粒不不能能在在同同一一宿宿主主细细胞胞中中共共同同存存在在，当当两两种种质质粒粒同同时时进进入入同同一一细细胞胞时时，它它们们在在复复制制及及随随后后分分配配到到子子细细胞胞过过程程中中相相互互竞竞争争，只只有有一一种种质质粒粒占占优优势势。这这样样，过过几几代代后后，占占小小数数的的质质粒粒将将丢丢失失，在在细细胞胞后后代代中中只只有有二二种种质质粒粒中中的的一一种种。这这种种现现象象称称为为质质粒粒的的不不相相容容性性（incompatibility）。但但利利用用不不同同复复制制系系统统的的不不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。第五页，讲稿共八十九页哦二、质粒二、质粒DNADNA的制备基本原理的制备基本原理(碱法）碱法）从从细细胞胞中中分分离离质质粒粒DNA DNA 的的方方法法都都包包括括3 3个个基基本本步步骤骤：培培养养细细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA.DNA.采采用用溶溶菌菌酶酶可可以以破破坏坏菌菌体体细细胞胞壁壁，SDSSDS和和Triton Triton X-100X-100可可使使细细胞膜裂解。胞膜裂解。处处理理后后细细菌菌染染色色体体DNADNA会会缠缠绕绕附附着着在在细细胞胞碎碎片片上上，同同时时由由于于细细菌菌染染色色体体DNADNA比比质质粒粒大大得得多多，易易受受机机械械力力和和核核酸酸酶酶等等的的作作用而被切断成不同大小的线性片段。用而被切断成不同大小的线性片段。当当用用强强热热或或酸酸、碱碱处处理理时时，细细菌菌的的线线形形染染色色体体DNADNA变变性性，而而cccDNAcccDNA的二条链不会相互分开。的二条链不会相互分开。当当外外界界条条件件恢恢复复正正常常时时，线线状状染染色色体体DNADNA片片段段难难以以复复性性，而而与与变变性性的的蛋蛋白白质质和和细细胞胞碎碎片片缠缠绕绕在在一一起起，而而质质粒粒DNADNA双双链链又又恢恢复复原原状状，重重新新形形成成天天然然的的超超螺螺旋旋分分子子，并并以以溶溶解解状状态态存存在在于液相中。于液相中。通过离心可获得质粒通过离心可获得质粒DNADNA。第六页，讲稿共八十九页哦三、试剂三、试剂1)LB液液体体培培养养基基:蛋蛋白白胨胨（tryptone）10g,酵酵母母提提取取物物（yeastextract）5g,NaCl10g,用用NaOH调至调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌。高压下蒸汽灭菌20分钟。分钟。2)LB固体培养基固体培养基：每升液体培养基加：每升液体培养基加12g琼脂粉，高压下蒸汽灭菌琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。分钟。3)氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）母液）母液：配成：配成50mg/ml水溶液，水溶液，-20下保存备用。下保存备用。4)溶溶 液液I：50mmol/L葡葡 萄萄 糖糖、25mmol/LTrisCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌15分钟分钟,储存于储存于4oC冰箱。冰箱。5)溶液溶液II：0.2mol/LNaOH(临用前用临用前用10mol/LNaOH母液稀释母液稀释)，1%SDS.6)溶液溶液III:5mol/LKAC60ml,冰醋酸冰醋酸11.5ml,水水28.5ml.7)RNaseA母母液液：将将RNaseA酶酶粉粉溶溶于于10mmol/LTrisCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl,终终浓度为浓度为10mg/ml。100加热加热15分钟，冷却后分装。分钟，冷却后分装。8)饱饱和和酚酚：市市售售酚酚需需重重蒸蒸。重重蒸蒸后后加加0.1%8-羟羟基基喹喹啉啉，并并用用等等体体积积的的0.5mol/LTrisCl(pH8.0)和和0.1mol/LTrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提，使缓冲液反复抽提，使pH达到达到7.6以上。以上。9)氯仿：氯仿：按氯仿按氯仿/异戊醇异戊醇=24：1混合。混合。10)酚酚/氯仿：氯仿：将上述饱和酚和氯仿按将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。混合。11)TE缓缓冲冲液液：10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).高高压压蒸蒸气气灭灭菌菌15分钟分钟,储存于储存于4冰箱。冰箱。第七页，讲稿共八十九页哦四、操四、操作作步步骤骤1 1细细菌菌的的培培养养和和收收集集：将将含含有有质质粒粒pBSpBS的的DH5DH5 菌菌株株接接种种在在LBLB固固体体培培养养基基（含含5050 g/ml g/ml AmpAmp）中中，3737培培养养12-24小小时时。用用无无菌菌牙牙签签挑挑取取单单菌菌落落接接种种到到5ml 5ml LBLB液液体体培培养养基基（含（含 5050 g/ml Ampg/ml Amp）中，）中，3737培养约培养约1212小时至对数生长后期。小时至对数生长后期。2 2质粒质粒DNADNA的少量快速提取的少量快速提取-碱裂解法碱裂解法 1).1).取取1.5ml1.5ml培养液倒入培养液倒入1.5ml ependorf 1.5ml ependorf 管中，管中，4 4下下12000g12000g离心离心3030秒。秒。2).2).弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。3).3).菌体沉淀重悬浮于菌体沉淀重悬浮于100100 l l 溶液溶液I I中（中（激烈震荡激烈震荡，充分混匀），室，充分混匀），室 温下放置温下放置5-105-10分钟。分钟。4).4).加入新配制的溶液加入新配制的溶液II 200II 200 l l，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒倒ependorfependorf管数次，以混匀内容物（管数次，以混匀内容物（千万不要震荡千万不要震荡）中，冰浴中）中，冰浴中 放置放置5 5分钟。分钟。5).5).加入加入150150 l l预冷的溶液预冷的溶液IIIIII，盖紧管口，并倒置离心管，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒温和颠倒 ependorfependorf管数次，以混匀内容物，冰浴中放置管数次，以混匀内容物，冰浴中放置5-105-10分钟。分钟。4 4下下 12000g12000g离心离心5-105-10分钟分钟,取取上清上清。第八页，讲稿共八十九页哦6).将将上上清清液液移移入入干干净净ependorf管管中中，加加入入等等体体积积的的酚酚/氯氯仿仿(1:1)，震荡混匀，震荡混匀，4下下12000g离心离心5分钟。分钟。7).将将上上清清液液移移入入干干净净ependorf管管中中，加加入入等等体体积积的的氯氯仿，震荡混匀，仿，震荡混匀，4下下12000g离心离心5分钟。分钟。8).将将水水相相移移入入干干净净ependorf管管中中，加加入入2倍倍体体积积的的无无水水乙乙醇醇，震震荡荡混混匀匀后后置置于于-20冰冰箱箱中中20分分钟钟。然然后后在在4下下12000g离心离心10分钟。分钟。9).弃弃上上清清液液，将将管管口口敞敞开开并并倒倒置置于于卫卫生生纸纸上上，使使液液体体流流尽尽。加加入入1ml70%乙乙醇醇洗洗涤涤沉沉淀淀。4下下12000g离离心心5-10分钟。分钟。10).吸吸去去上上清清液液，将将管管倒倒置置于于卫卫生生纸纸上上，使使液液体体流流尽尽，室室温干燥或真空干燥温干燥或真空干燥10分钟分钟.11).将将沉沉淀淀溶溶于于20 l TE缓缓冲冲液液（pH8.0,含含20 g/mlRNaseA）中，储于）中，储于-20C冰箱冰箱.第九页，讲稿共八十九页哦附附:日常型质粒日常型质粒DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒（硅膜吸附）硅膜吸附）原理：原理：带负电荷的带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。阳离子和力。阳离子Na发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，Na+打破水中的打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，DNA与与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。分子。第十页，讲稿共八十九页哦该试剂盒沿用传统的该试剂盒沿用传统的SDS碱裂解法，结合碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质的方法达到快速纯化质粒粒DNA的目的。适合于从的目的。适合于从4mlLB细菌培养物中提细菌培养物中提取取520ug纯净的质粒纯净的质粒DNA，用于测序、体外转录，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。物学实验。第十一页，讲稿共八十九页哦第十二页，讲稿共八十九页哦操作步骤操作步骤 第一次使用时，将试剂盒携带的第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAlRNaseAl全部加入到全部加入到S1S1溶液中，混合均匀，溶液中，混合均匀，44保存。保存。1 1取取3ml3ml在在LBLB培养基中培养过夜的菌液培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少养基，菌液体积应减半或更少)，12000rpm12000rpm离心离心20s20s，弃尽上清；，弃尽上清；2 2用用0.25ml0.25ml已加入已加入RNaseAlRNaseAl的的S1S1溶液溶液悬浮细菌沉淀，悬悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；浮需均匀，不应留有小的菌块；3 3加加0.25ml 0.25ml S2S2溶液溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀使，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min5 min；4 4加入加入0.5ml 40.5ml 4预冷的预冷的S3S3溶液溶液，温和并充分地上下，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置置2min2min。最高速度。最高速度(12000rpm)(12000rpm)离心离心5 min5 min；第十三页，讲稿共八十九页哦操作步骤操作步骤(续续)5吸取步骤吸取步骤4中的离心上清并转移到中的离心上清并转移到DNA制备管制备管(置于置于2ml离心管离心管中中)，3600rpm离心离心lmin。如制备管中有液体残留，适当提高离。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心心速度，再离心1min，弃滤液；，弃滤液；6将将制备管制备管置回离心管，加置回离心管，加0.5mlWl溶液溶液，3600rpm离心离心30s，弃滤液；弃滤液；7将制备管置回离心管，加将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液溶液，3600rpm离心离心30s；以；以同样的方法再用同样的方法再用0.7mlW2溶液洗涤一次。弃滤液；溶液洗涤一次。弃滤液；8将制备管移入离心管中，将制备管移入离心管中，12000rpm离心离心1min；9将制备管移入新的将制备管移入新的1.5ml离心管中，在离心管中，在DNA制备膜正中央加制备膜正中央加60l水或洗脱液水或洗脱液，室温静置，室温静置lmin。12000rpm离心离心lmin洗脱洗脱DNA。第十四页，讲稿共八十九页哦质粒DNA电源图第十五页，讲稿共八十九页哦磁珠法提取磁珠法提取DNA原理原理19941994年年T TL LHawkinsHawkins等发现羧基高分子表面在一定浓度等发现羧基高分子表面在一定浓度PEGPEGNaClNaCl条件下具有吸附核酸的能力，而在水或条件下具有吸附核酸的能力，而在水或TETE溶液中核酸又可以解吸溶液中核酸又可以解吸附。附。因此，在磁珠表面连接可特异地与因此，在磁珠表面连接可特异地与DNADNA发生作用的功能基团，使其发生作用的功能基团，使其具有可逆吸附具有可逆吸附DNADNA的特性。通常采用带有氨基、巯基、环氧基等的特性。通常采用带有氨基、巯基、环氧基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。高盐基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附，而蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理，吸附，而蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理，这样就建立了一种以磁性微珠为载体的这样就建立了一种以磁性微珠为载体的DNADNA纯化方法。纯化方法。相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺寸小、偶联容相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺寸小、偶联容量大、悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反应高效快量大、悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反应高效快速进行。速进行。第十六页，讲稿共八十九页哦 该核酸提取法对该核酸提取法对DNA结构没有损伤，生结构没有损伤，生物相容性高，物相容性高，DNA可直接洗脱应用，纯度及可直接洗脱应用，纯度及纯化效率等方面都较高。纯化效率等方面都较高。第十七页，讲稿共八十九页哦II、基因组、基因组DNA的提取的提取第十八页，讲稿共八十九页哦一、概述一、概述 染色体染色体DNA通常用于构建基因组文库和通常用于构建基因组文库和Southern杂交等，同时杂交等，同时在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。1、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色体、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色体DNA的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的4倍）。倍）。当用当用Cosmid构建文库时，片段长度应大于构建文库时，片段长度应大于200kb;用噬菌体构建文库用噬菌体构建文库时应大于时应大于80kb。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复抽。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成提和乙醇沉淀等步骤都会造成DNA断裂。我们应尽可能采用温和断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段。的方法和手段。2、Southern杂交：用于杂交：用于Southern杂交的染色体杂交的染色体DNA片段长度要求片段长度要求可适当降低。可适当降低。3、PCRAFLPRFLP等：等：DNA片段长度要求可适当降低。片段长度要求可适当降低。第十九页，讲稿共八十九页哦一、概述一、概述 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的可用的DNA大分子。大分子。不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取缓不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体DNA提取所提取所用的提取缓冲液为：用的提取缓冲液为：18.6g葡萄糖、葡萄糖、6.9g二乙基二硫代二乙基二硫代碳酸钠（碳酸钠（Sarkosyl）、）、6.0gPVP、240ul巯基乙醇、加水巯基乙醇、加水至至300ml第二十页，讲稿共八十九页哦二、植物基因组二、植物基因组DNA提取提取(水稻和其它禾本科植物)1、试剂试剂 A.提取缓冲液：100mmol/L TrisCl（pH8.0）、20mmol/L EDTA、500mmol/L NaCl、1.5%SDS。B.氯仿/戊醇/乙醇溶液:80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 C.异丙醇 D.TE:10mol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0).高压蒸气灭菌15分钟,储存于4 冰箱。E.RNase A：10mg/ml F.3mol/L NaAC第二十一页，讲稿共八十九页哦2、实验步骤、实验步骤A.在在50ml离心管中加入离心管中加入20ml提取缓冲液提取缓冲液，60水浴预热。水浴预热。B.水稻幼苗或叶子水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加，剪碎，在研钵中加液氮磨液氮磨成粉状后立即成粉状后立即倒入预热的含倒入预热的含提取缓冲液提取缓冲液的离心管中，剧烈摇动混匀，的离心管中，剧烈摇动混匀，60水水浴保温浴保温30-60分钟（时间长，分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。产量高），不时摇动。C.加入加入20ml氯仿氯仿/戊醇戊醇/乙醇溶液乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置肤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。新混匀）。D.室温下室温下5000rpm离心离心5分钟。分钟。E.仔细移取上清液至另一仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积离心管，加入一倍体积异丙醇异丙醇，混匀，混匀，室温下放置片刻即出现絮状室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。沉淀。F.F.用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。转转入含入含1mlTE的的1.5mleppendorf管中，管中，DNA很快溶解于很快溶解于TE。G.如如DNA不形成絮状沉淀，则可用不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心离心5分钟，再将沉淀分钟，再将沉淀移入移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在，可在60水水浴放置浴放置15分钟以上，以帮助溶解。分钟以上，以帮助溶解。第二十二页，讲稿共八十九页哦2 2、实验步骤、实验步骤(续）续）H.将将DNADNA溶液溶液3000rpm离心离心5 5分钟，上清液倒入干净的分钟，上清液倒入干净的5ml5ml离心管。离心管。I.I.加入加入5ulRNaseA（10ug/ul10ug/ul），），3710分钟，除去分钟，除去RNARNA（RNARNA对对DNADNA的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。J.J.加入加入1/101/10体积的体积的3mol/L 3mol/L NaACNaAC及及2x2x体积的冰乙醇体积的冰乙醇，混匀，混匀，-2020放置放置2020分钟左右，使分钟左右，使DNADNA形成絮状沉淀。形成絮状沉淀。K.K.用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。L.L.将将DNADNA重新溶解于重新溶解于1mlTE中，中，-20贮存。贮存。M.M.取取2ulDNA样品在样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测胶上电泳，检测DNADNA的分子大小。的分子大小。同时可取同时可取15ul稀释稀释2020倍，测定倍，测定OD260/OD280，检测，检测DNADNA含量及质含量及质量。量。第二十三页，讲稿共八十九页哦3、DNA纯度与浓度测定纯度与浓度测定A、DNA纯度纯度：DNA的的OD260/OD280一般为一般为1.8左右。左右。OD260/OD280 1.8：说明较纯；：说明较纯；OD260/OD280 1.8：说明可能有：说明可能有RNA污染；污染；OD260/OD280 1.8：说明可能有蛋白质污染。：说明可能有蛋白质污染。B、DNA浓度浓度：当：当OD260为为1时，时，dsDNA含量为含量为50ug/ml,ssDNA或或RNA含量为含量为40g/ml；单链寡核苷酸为；单链寡核苷酸为20ug/ml.dsDNA（g/ml）=50OD260稀释倍数稀释倍数第二十四页，讲稿共八十九页哦附附:动动/植物基因组植物基因组DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒1 1、基本原理：、基本原理：该试剂盒采用公司自身研该试剂盒采用公司自身研制的相分离技术和制的相分离技术和DNADNA制备膜制备膜选择性吸附选择性吸附DNADNA 的原理从的原理从1-1-10mg10mg新鲜动物组织或新鲜动物组织或2-20mg2-20mg新新鲜植物组织中提取至多鲜植物组织中提取至多20ug20ug纯纯净的染色体净的染色体DNA.DNA.第二十五页，讲稿共八十九页哦2、实验步骤、实验步骤A.样品收集：样品收集：100mg新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，加新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入65水浴水浴至样品粉末刚开始融化。至样品粉末刚开始融化。B.加入加入700ulG-A溶液溶液和和1.2ulRNaseA1贮存液贮存液，用力研磨，用力研磨30秒。秒。C.转移转移650ul研磨好的匀浆至研磨好的匀浆至2ml离心管中，如体积不到离心管中，如体积不到650ul,加加bufferG-A溶液至溶液至650ul,65下保温下保温15min。D.加加400ulG-B溶液溶液和和1mlDV溶液溶液(4预冷），用力混匀，预冷），用力混匀，12000g离心离心2min.E.去上相液体，保留间相和下相溶液。加入去上相液体，保留间相和下相溶液。加入1mlDV溶液溶液(4预冷），预冷），用力混匀，用力混匀，12000g离心离心2min.F.去上相液体，将下相溶液转移至去上相液体，将下相溶液转移至微量滤器微量滤器(置于置于2ml离心管中）。离心管中）。12000g离心离心30秒。秒。第二十六页，讲稿共八十九页哦2、实验步骤、实验步骤G.弃上相，在过滤液中加入弃上相，在过滤液中加入400ulDV溶液溶液,混合均匀。混合均匀。H.将将制备管制备管置于置于2ml离心管中，加入步骤离心管中，加入步骤G的样品。的样品。12000g离离心心30秒。秒。I.弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml离心管中离心管中,加入加入500ulWl溶液溶液，12000g离心离心30秒。秒。J.弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml离心管中离心管中,加入加入700ulW2溶液溶液，12000g离心离心30秒。秒。K.弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml离心管中离心管中,加入加入500ulW2溶液，溶液，12000g离心离心1min。L.将制备管移入新的将制备管移入新的1.5ml离心管中，在离心管中，在DNA制备膜正中央加制备膜正中央加100-200l水水或或洗脱液洗脱液，室温静置，室温静置lmin。最高速度离心。最高速度离心lmin洗脱洗脱DNA。第二十七页，讲稿共八十九页哦三、细菌基因组三、细菌基因组DNA提取提取1、试剂试剂A.10%SDSB.蛋白酶K(20mg/ml)C.氯仿：异戊醇（24：1）;D.苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）E.70%乙醇F.TE,G.5mol/L NaCl.H.RNase A：10mg/mlI.CTAB/NaCl 溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，缓慢加入10 g CTAB,加水至100ml.J.(NaCl:Mr.58;0.8Mol/L)第二十八页，讲稿共八十九页哦十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。在在高离子强度高离子强度的溶液里的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖(除酸性多聚糖)形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌的某些株)中制备纯化DNA。CTAB在制备基因组在制备基因组DNA的基本沉淀程序的基本沉淀程序：这种去污剂加入调节至高离子强度(0.7 mol/L NaCl)的细菌或细胞裂解液中。经过连续的酚和氯仿抽提去除CTAB黏多糖蛋白质复合物，用异丙醇无水乙醇沉淀上清即可获得基因组DNA。第二十九页，讲稿共八十九页哦CTAB结构式第三十页，讲稿共八十九页哦2、实验步骤：、实验步骤：A.5 ml细菌培养过夜，12000rpm离心3分钟，去上清液。B.加567ul TE溶液悬浮沉淀，并加30ul 10%SDS,3ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀，37水浴保温1小时。C.加100ul 的5mol/L NaCl,混匀。D.加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65水浴保温10min.E.用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心3分钟。F.仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置10min,即出现絮状DNA沉淀。G.用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20。H.取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。第三十一页，讲稿共八十九页哦附注A.如需降解RNA,则在步骤G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37保温30分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。B.用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心10分钟。C.上清液至另一离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。D.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。E.将DNA重新溶解于1mlTE中，-20贮存。第三十二页，讲稿共八十九页哦附附:细菌基因组细菌基因组DNA小量制备试剂盒小量制备试剂盒实验步骤实验步骤：A.样品收集：1ml 细菌培养液5000rpm离心3分钟，用0.8ml细菌原生质体制备缓冲液悬浮沉淀，加20ul溶菌酶贮存液溶菌酶贮存液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25M EDTA,pH8.0,混合均匀，冰上放置5min。加0.3ml洗脱液，37保温5min.5000rpm离心5min.B.去上清，加0.1mlS-G溶液溶液，彻底悬浮沉淀，冰浴5min.C.加0.45ml50预热的G-A溶液溶液，用1ml枪头快速吸注10次；若太粘稠，则在45下保温5min,再用1ml枪头快速吸注10次。冰浴5min.D.加0.15mlG-C溶液溶液，混匀，12000rpm离心1min.E.将样品加于微量滤器微量滤器（置于2ml离心管中），12000rpm离心1min.第三十三页，讲稿共八十九页哦实验步骤（续）实验步骤（续）F.吸取步骤E中的混合液，转移到DNA制备管制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1 min，弃滤液；G.将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液溶液，3600rpm离心3 0s，弃滤液；H.将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液溶液，3600rpm离心30s；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤液；I.将制备管置于离心管中，12000rpm离心1min.J.将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在DNA制备膜制备膜正中央加60l水或洗脱液，室温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。第三十四页，讲稿共八十九页哦细菌基因组DNA电源图第三十五页，讲稿共八十九页哦真核细胞基因组真核细胞基因组DNA电源图电源图第三十六页，讲稿共八十九页哦III、总、总RNA的制备的制备第三十七页，讲稿共八十九页哦一、概述一、概述 中心法则中心法则:DNAmRNA蛋白质蛋白质真核生物真核生物mRNA的特点的特点:真核生物的基因中有许多内含子真核生物的基因中有许多内含子,需要通过需要通过RNA的拼接加工的拼接加工,才能成为成熟的才能成为成熟的mRNA.因此真核因此真核生物中提取的生物中提取的mRNA,经反转录合成经反转录合成cDNA,进而克隆基因已进而克隆基因已成为分子生物学最重要的方法之一成为分子生物学最重要的方法之一.通常一个典型哺乳动物细胞约含通常一个典型哺乳动物细胞约含10-5ugRNA,但其中大部分但其中大部分为为rRNA（28S,18S及及5S）和各种低分子量的）和各种低分子量的RNA(tRNA,小核小核RNA等等),只有只有1-5%为为mRNA。这些。这些mRNA的的大小和序列不一大小和序列不一,但但其其3端有一个端有一个poly(A)的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽。的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽。第三十八页，讲稿共八十九页哦实验器皿处理实验器皿处理 mRNA的分子结构容易受到的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止止RNA酶的污染并设法抑制其活性，这是酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。实验成败的关键。人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤烘烤2小时以上。小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的的焦碳酸二乙焦碳酸二乙酯（酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。水溶液处理，再用蒸馏水冲净。为了避免为了避免mRNA或或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。皿一律需经硅烷化处理。第三十九页，讲稿共八十九页哦RNA酶抑制剂酶抑制剂A.焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）:强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。但DEPC能与胺与巯基反应，因而含Tris溶液溶液和DTT的试剂的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制后、然后高压灭菌高压灭菌。DEPC与氨水溶液混合会产生致与氨水溶液混合会产生致癌物！癌物！B.异硫氰酸胍（异硫氰酸胍（Guanidiniumisothiocyanate）:为目前一种最有效的RNA酶抑制剂。它不但具有败坏细胞结构、核酸从核蛋白质中解离，同时也使RNA酶失活。因此在制备RNA时，缓冲液中常含有异硫氰酸胍。C.其它：其它：钒氧核苷酸复合物（Vanadyl-ribonucloside complex）RNA酶蛋白抑制制（RNasin）SDS,尿素等第四十页，讲稿共八十九页哦二、试验方法二、试验方法 细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。第四十一页，讲稿共八十九页哦酚酚/SDS法制备总法制备总RNA1基本原理基本原理：第一步用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，第二步用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA和其它不纯物。2 2、试剂、试剂A.匀浆缓冲液：0.18mol/L Tris,0.09mol/L LiCl,4.5mmol/L EDTA,1%SDS,pH8.2）B.TLE：0.2mol/L Tris,0.1mol/L LiCl,5mmol/L EDTA,pH8.2C.经平衡的酚D.LiCl E.3mol/L NaACF.无水乙醇第四十二页，讲稿共八十九页哦3 3、实验步骤、实验步骤A.植物组织在液氮中磨成粉末，转入含植物组织在液氮中磨成粉末，转入含150ml匀浆缓冲匀浆缓冲液和液和50ml经经TLE平衡的酚的平衡的酚的500ml烧杯中烧杯中.B.匀浆匀浆2min，加，加50ml氯仿，温和混匀后，氯仿，温和混匀后，50放置放置20min。C.4下下10000rpm离心离心20分钟分钟.水相部分加水相部分加50ml经经TLE平衡平衡的酚的酚,混匀后加混匀后加50ml氯仿氯仿,混匀混匀D.4下下10000rpm离心离心15分钟分钟,水相部分用加经水相部分用加经TLE平衡的平衡的酚抽提直至无界面（一般酚抽提直至无界面（一般3次）。水相部分氯仿抽提一次次）。水相部分氯仿抽提一次第四十三页，讲稿共八十九页哦3 3、实验步骤、实验步骤(续续)E.水相部分加水相部分加LiCl至至2mol/L,4下沉淀过夜。下沉淀过夜。F.4下下10000rpm离心离心20分钟，用分钟，用2mol/LLiCl冲洗冲洗沉淀沉淀G.用用5ml水溶解，加水溶解，加LiCl至至2mol/L，4下沉淀下沉淀2小时以上。小时以上。H.4下下10000rpm离心离心20分钟，用分钟，用2mol/LLiCl冲洗沉淀冲洗沉淀I.用用2ml水溶解，加水溶解，加200ul3mol/LNaAC和和5.5ml无水无水乙醇，乙醇，-20下沉淀过夜下沉淀过夜J.4下下10000rpm离心离心15分钟，用分钟，用1ml水溶解。水溶解。第四十四页，讲稿共八十九页哦异硫氰酸胍异硫氰酸胍/酚法制备总酚法制备总RNA1.基本基本原理原理异硫氰酸胍异硫氰酸胍(GIT)与与巯基乙醇共同作用抑制巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；的活性；GIT与与十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，来，RNA则溶于上清中。该法所提则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转