机体免疫功能的检测技术讲稿.ppt

关于机体免疫功能的检测技术第一页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测 第四节第四节 细胞因子及其受体的细胞因子及其受体的检测技术检测技术 第八章机体免疫功能的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术 第二页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法四、细胞表面标志分离法 五、其他细胞的分离和收集五、其他细胞的分离和收集第三页，讲稿共六十六页哦 根据不同细胞存在的密度差异即比重不同而分类。人外周血细胞的密度为：红细胞 1.093，粒细胞 1.092，单个核细胞1.0751.090，血小板 1.0301.035。1自然沉降分离法 2密度梯度离心法一、细胞密度差异分离法第四页，讲稿共六十六页哦上 层：淡黄色血浆底 层：红细胞灰白层：白细胞1自然沉降分离法第五页，讲稿共六十六页哦（1）Ficoll密度梯度离心法（2）Percoll密度梯度离心法2密度梯度离心法第六页，讲稿共六十六页哦（1）Ficoll密度梯度离心法 即聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation)Ficoll分层液的密度为：1.0770.001 用于从外周血中分离单个核细胞第七页，讲稿共六十六页哦用Ficoll分离外周血单个核细胞95%2000rpm2000rpm20 min20 min血浆血浆单个核细胞单个核细胞淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液红细胞红细胞粒细胞粒细胞第八页，讲稿共六十六页哦第九页，讲稿共六十六页哦（2）Percoll密度梯度离心法 Percoll即聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶混悬液的商品名，为一种无细胞毒无刺激的新型连续密度梯度分层液。Percoll原液密度1.135 用于从单个核细胞中分离单核细胞、淋巴细胞第十页，讲稿共六十六页哦用Percoll分离单核细胞和淋巴细胞75%98%第十一页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法四、细胞表面标志分离法 五、其他细胞的分离和收集五、其他细胞的分离和收集第十二页，讲稿共六十六页哦 单核/巨噬细胞具有较强的粘附能力，在37和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的表面，据此可建立许多从单个核细胞悬液中去除单核/巨噬细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞。1细胞粘附力差异分离法 2细胞吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法第十三页，讲稿共六十六页哦 单核/巨噬细胞具有较强的粘附能力，在37和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的表面，据此可从单个核细胞悬液中去除单核/巨噬细胞，获得高纯度的淋巴细胞。细胞也有一定的粘附能力，能粘附于尼龙纤维表面，可以将细胞与细胞分开。1细胞粘附力差异分离法第十四页，讲稿共六十六页哦（1）粘附贴壁法：单个核细胞放在玻璃或塑料平皿中于37温 箱静置1h，收集游离的淋巴细胞。（2）吸附柱过滤法：单个核细胞加入玻璃纤维或葡聚糖凝胶 （Sephadex-G10），收集未吸附的淋巴细胞。淋巴细胞放入尼龙纤维，可以吸附B细胞，游离细胞为T细胞。第十五页，讲稿共六十六页哦磁铁吸引法：单核/巨噬细胞具有吞噬特性，可加入直径为3um的羰基铁颗粒或乳胶颗粒，待单核/巨噬细胞充分吞噬颗粒后，再用磁场吸附或通过密度梯度离心，获得较纯的淋巴细胞。2细胞吞噬能力差异分离法第十六页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法四、细胞表面标志分离法 五、其他细胞的分离和收集五、其他细胞的分离和收集第十七页，讲稿共六十六页哦三、细胞渗透压敏感差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法 红细胞对低渗的敏感性要高于白细胞，故可用不损伤白细胞的温和低渗液处理以除去红细胞。1.低渗裂解法：蒸馏水 2.氯化铵处理法：0.83%氯化铵第十八页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法四、细胞表面标志分离法 五、其他细胞的分离和收集五、其他细胞的分离和收集第十九页，讲稿共六十六页哦四、四、细胞表面标志分离法细胞表面标志分离法 1.E-玫瑰花环沉降法 2.亲和分离法 3.补体介导的特异性细胞毒分离法 4.免疫磁珠分离法 5.流式细胞仪分离法第二十页，讲稿共六十六页哦1.E-玫瑰花环沉降法第二十一页，讲稿共六十六页哦2.亲和分离法第二十二页，讲稿共六十六页哦3.补体介导的特异性细胞毒分离法 是在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。这是一种负选性分离法，简称细胞毒法。第二十三页，讲稿共六十六页哦4.免疫磁珠分离法 在磁珠表面包被了特异性抗体的免疫磁珠（immunomagnetic microbeads，IMB），可与目标细胞表面的抗原结合而与特定细胞粘附，在磁场中可以分离IMB结合细胞与IMB非结合细胞。本方法快速、特异、高效，分离效果可与FACS法媲美，对仪器的要求却低得多。第二十四页，讲稿共六十六页哦5.流式细胞仪分离法第二十五页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法四、细胞表面标志分离法 五、其他细胞的分离和收集五、其他细胞的分离和收集第二十六页，讲稿共六十六页哦五、其他细胞的分离和收集 1.吞噬细胞的分离和收集 2.NK细胞和LAK前体细胞的分离第二十七页，讲稿共六十六页哦1.吞噬细胞的分离和收集（1）人：组织液 （斑蝥敷贴法）（2）小动物：腹腔巨噬细胞第二十八页，讲稿共六十六页哦2.NK细胞和LAK前体细胞的分离单核细胞去除法:粘附法B淋巴细胞去除法:尼仑棉纤维T淋巴细胞去除法:E-玫瑰花环沉降法第二十九页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测 第四节第四节 细胞因子及其受体的细胞因子及其受体的检测技术检测技术 第八章机体免疫功能的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术 第三十页，讲稿共六十六页哦第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、外周血B细胞数目的检测三、外周血B细胞功能的检测第三十一页，讲稿共六十六页哦一、免疫球蛋白的定量检测 1.单向免疫扩散试验 2.免疫比浊法 3.ELISA第三十二页，讲稿共六十六页哦单相免疫扩散试验第三十三页，讲稿共六十六页哦第三十四页，讲稿共六十六页哦第三十五页，讲稿共六十六页哦第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、外周血B细胞数目的检测三、外周血B细胞功能的检测第三十六页，讲稿共六十六页哦二、外周血B细胞数目的检测 1.免疫荧光技术 2.花环试验 3.流式细胞术第三十七页，讲稿共六十六页哦第三十八页，讲稿共六十六页哦 B细胞EA、EAC花环试验 第三十九页，讲稿共六十六页哦第四十页，讲稿共六十六页哦第四十一页，讲稿共六十六页哦第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、外周血B细胞数目的检测三、外周血B细胞功能的检测第四十二页，讲稿共六十六页哦三、外周血B细胞功能的检测 1.B细胞增殖试验 2.溶血空斑试验 3.ELISPOT第四十三页，讲稿共六十六页哦1.B1.B细胞增殖试验细胞增殖试验非特异性刺激物（美洲商陆）特异性刺激物（抗原）3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法第四十四页，讲稿共六十六页哦溶血空斑试验第四十五页，讲稿共六十六页哦第四十六页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测 第四节第四节 细胞因子及其受体的细胞因子及其受体的检测技术检测技术 第八章机体免疫功能的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术 第四十七页，讲稿共六十六页哦第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测第四十八页，讲稿共六十六页哦一、一、T T细胞亚群和数目的检测细胞亚群和数目的检测 1.免疫荧光技术 2.花环试验 3.流式细胞术第四十九页，讲稿共六十六页哦第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测第五十页，讲稿共六十六页哦二、二、T T细胞功能的检测细胞功能的检测 1.体外功能实验 2.体内功能实验第五十一页，讲稿共六十六页哦1.1.体外功能实验体外功能实验（1）T细胞增殖试验（2）细胞毒试验（3）ELISPOT第五十二页，讲稿共六十六页哦（1 1）T T细胞增殖试验细胞增殖试验非特异性刺激物（PHA、ConA、PWM）特异性刺激物（抗原）3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法第五十三页，讲稿共六十六页哦（2 2）细胞毒试验）细胞毒试验第五十四页，讲稿共六十六页哦（2 2）细胞毒试验）细胞毒试验第五十五页，讲稿共六十六页哦第五十六页，讲稿共六十六页哦2.2.体内功能实验体内功能实验第五十七页，讲稿共六十六页哦第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测第五十八页，讲稿共六十六页哦三、其他免疫细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测 1.巨噬细胞功能的检测 2.NK细胞和LAK细胞功能的检测第五十九页，讲稿共六十六页哦1.1.巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测第六十页，讲稿共六十六页哦2.NK2.NK细胞和细胞和LAKLAK细胞功能的检测细胞功能的检测NKNK细胞靶细胞（细胞靶细胞（K562K562）LAKLAK细胞靶细胞（细胞靶细胞（LiBr)LiBr)第六十一页，讲稿共六十六页哦第一节第一节 免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化第二节第二节 体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测第三节第三节 细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测 第四节第四节 细胞因子及其受体的细胞因子及其受体的检测技术检测技术 第八章机体免疫功能的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术 第六十二页，讲稿共六十六页哦第四节第四节 细胞因子及其受体的检测技术细胞因子及其受体的检测技术一、细胞因子的检测方法二、细胞因子受体的检测方法第六十三页，讲稿共六十六页哦一、细胞因子的检测方法 1.生物活性检测技术（依赖性细胞株、功能测定等）2.免疫学检测技术（ELISA、RIA）3.分子生物学技术（分子杂交技术、PCR）4.单个细胞产生细胞因子的测定技术（反向溶血空斑试验、ELISPOT）第六十四页，讲稿共六十六页哦第四节第四节 细胞因子及其受体的检测技术细胞因子及其受体的检测技术一、细胞因子的检测方法二、细胞因子受体的检测方法第六十五页，讲稿共六十六页哦感谢大家观看第六十六页，讲稿共六十六页哦