核酸的研究方法讲稿.ppt

关于核酸的研究方法第一页，讲稿共三十一页哦一一.核酸的分离，提纯和定量测定核酸的分离，提纯和定量测定（一）一）DNA的分离提纯的分离提纯真真核核生生物物DNA与与蛋蛋白白质质的的复复合合物物（DNP）溶溶于于水水和和浓浓盐盐溶溶液液，但但不不溶溶于于0.14mol/L盐盐溶溶液液，用用苯苯酚酚或或氯氯仿使蛋白质变性，仿使蛋白质变性，DNA溶于上清液。溶于上清液。在十二烷基硫酸钠（在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下用蛋白酶消化存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除除去去RNA，操作在低温下进行，防止过酸，过碱，或操作在低温下进行，防止过酸，过碱，或机械振荡，可得高质量的机械振荡，可得高质量的DNA。第二页，讲稿共三十一页哦（二）（二）RNA的分离提纯的分离提纯RNA易易被被广广泛泛存存在在的的RNase水水解解，所所有有器器皿皿与与溶溶液液都都要要经经过过处处理理除除去去RNase，在在破破碎碎细细胞胞的的同同时时应应使使RNaes失失活活，在在实实验验反反应应体体系系中中要要加加RNaes的的抑抑制剂。制剂。目目前前常常用用的的分分离离方方法法为为釽釽盐盐/氯氯化化铯铯密密度度梯梯度度离离心心（RNA密密度度1.89，DNA密密度度-1.71，蛋蛋白白质质密密度度超螺旋超螺旋DNA解链环状解链环状DNA松弛环状松弛环状DNA线形线形DNA也就是在离心管中最上层是线形也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下最下面是面是RNA。第十一页，讲稿共三十一页哦三三.核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳一）琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：（1）核酸分子大小）核酸分子大小应用凝胶电泳可正确地测定应用凝胶电泳可正确地测定DNA片段的片段的分子大小。在同一胶上加一已知其相对分子质量的样品。电泳分子大小。在同一胶上加一已知其相对分子质量的样品。电泳完毕后，经溴化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的完毕后，经溴化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。中各片段的大小。（2）胶浓度）胶浓度（3）DNA的构象的构象（4）电压）电压（5）碱基组成）碱基组成（6）温度）温度（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺作支持物。以聚丙烯酰胺作支持物。第十二页，讲稿共三十一页哦核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳第十三页，讲稿共三十一页哦（一）（一）DNA的酶法测序的酶法测序四四.核酸的核苷酸序列测定核酸的核苷酸序列测定第十四页，讲稿共三十一页哦DNA的酶法测序的酶法测序第十五页，讲稿共三十一页哦DNA的酶法测序的酶法测序第十六页，讲稿共三十一页哦DNA的酶法测序的酶法测序第十七页，讲稿共三十一页哦Sanger法法第十八页，讲稿共三十一页哦Sanger法法第十九页，讲稿共三十一页哦第二十页，讲稿共三十一页哦（二）（二）DNA的化学法测序的化学法测序Maxam和和Gilbert于于1977年发明年发明1）用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰2）然然后后用用哌哌啶啶切切除除碱碱基基，DNA链链断断裂裂成成片片段段，末末端端为为特特异异碱基碱基3）变性胶电泳分离，放射自显影得到测序图谱变性胶电泳分离，放射自显影得到测序图谱4）判断方法同判断方法同Sanger终止法终止法（三）三）RNA测序测序1）用用特特异异酶酶切切断断特特异异碱碱基基位位置置的的核核酸酸链链。电电泳泳分分离离得得到到测测序序图图谱谱，同同Sanger终止法。终止法。2）化学试剂断裂化学试剂断裂RNA，电泳得到测序图谱电泳得到测序图谱3）逆转录生成逆转录生成DNA，然后用然后用DNA测序法。测序法。第二十一页，讲稿共三十一页哦五五.DNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）PCR,polymerasechainreaction是是80年代发展起来年代发展起来的新技术，广泛应用于分的新技术，广泛应用于分子生物学子生物学(molecularbiology)和基因工程和基因工程(geneengineer-ing)及其它与及其它与DNA鉴定相关的其它领鉴定相关的其它领域，如疾病检域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法测、临床应用、商品检疫、法医鉴定和新药品的开医鉴定和新药品的开发等。发等。PCR是指那些模拟体内是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选复制的方式在体外选择择性地扩增性地扩增(amplify)DNA某个特殊区域的技术某个特殊区域的技术 第二十二页，讲稿共三十一页哦PCR过程在自然界是不存在的，它是人们对过程在自然界是不存在的，它是人们对DNA复制的深刻理解而带来的产物。复制的深刻理解而带来的产物。现代现代PCR概念是概念是KaryMullis于于20世纪世纪80年代早期年代早期发明的。经过与发明的。经过与Cetus公司的同事合作，最终导致公司的同事合作，最终导致现在广泛使用的现在广泛使用的PCR技术的诞生。技术的诞生。Mullis的创新点在于使用两个与的创新点在于使用两个与DNA的两条不同链的两条不同链互补的寡核苷酸作为引物特异性地扩增两个引物之互补的寡核苷酸作为引物特异性地扩增两个引物之间间的的DNA区域，并且重复进行。在此同时，得到的区域，并且重复进行。在此同时，得到的扩增产物又可作为下一轮扩增的模板扩增产物又可作为下一轮扩增的模板(template)，从而使得扩增产物按几何级数递增。从而使得扩增产物按几何级数递增。特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热DAN聚聚合合酶使酶使PCR从概念成为真正适用的技术。从概念成为真正适用的技术。第二十三页，讲稿共三十一页哦1.基本要素基本要素 Template:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等等 substrates:dNTP DNApolymerase:Taqpoly2.反应过程反应过程denaturedsDNAssDNA92-96 Cannealing 37-72 C50-58 Cextension 72 C这三个热反应过程的重复称为一个循环这三个热反应过程的重复称为一个循环(cycle)第二十四页，讲稿共三十一页哦PCR主要由主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成热循环构成：即在高温（即在高温（95）下，待扩增的靶）下，待扩增的靶DNA双链双链受热变性成为两条单链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（模板；而后在低温（3755）情）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板模板结合，形成部分双链；在结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温（酶的最适温（72）下，以引物）下，以引物3端端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，方向延伸，合成合成DNA新链。这样，每一双链的新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次模板，经过一次解链、解链、退火、延伸退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此分子。如此反复进行，每一次循环所产生的反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩特异区拷贝数扩增一倍，增一倍，PCR产物得以产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过的批数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达倍以上，实际上一般可达106107倍。倍。第二十五页，讲稿共三十一页哦聚合酶链式反应聚合酶链式反应第二十六页，讲稿共三十一页哦假设扩增效率为假设扩增效率为“X”，循环数为循环数为“n”，则则二者与扩增倍数二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增扩增30个循环即个循环即n=30时，若时，若X=100%，则则y=230=1073741824(109)；而若而若X=80%时，则时，则y=1.830=45517159.6(107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外线照射下（紫外线照射下（254nm）一般都可见到一般都可见到DNA的特异扩增区带。的特异扩增区带。第二十七页，讲稿共三十一页哦六六.DNA的化学合成的化学合成将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。5-OH用二对甲氧三苯甲基（用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护。碱基上的氨基用苯甲酸保护。对对3-OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。用氨基亚磷酸化合物进行活化。第二十八页，讲稿共三十一页哦A第一个核苷酸的第一个核苷酸的3-OH与固相（树脂）结合在一起，它的与固相（树脂）结合在一起，它的5-OH与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的5-OH及碱环上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。及碱环上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。B亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯C加入二氯乙酸除去生长链中的加入二氯乙酸除去生长链中的5-OH上的保护剂上的保护剂DMT，至此至此DNA链已延伸了一个核苷酸单位，并可投入下一轮反应。链已延伸了一个核苷酸单位，并可投入下一轮反应。D整个整个DNA片段合成完毕后，用苯硫酚除去片段合成完毕后，用苯硫酚除去5-OH上的保护剂上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使片段与固相树脂断开，使DNA得以得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。第二十九页，讲稿共三十一页哦DNA的的化化学学合合成成第三十页，讲稿共三十一页哦感谢大家观看第三十一页，讲稿共三十一页哦