第4章蛋白质的共价结构.ppt

第4章蛋白质的共价结构现在学习的是第1页，共31页一、蛋白一、蛋白质的分子大小的分子大小l单体蛋白体蛋白质：有的蛋白：有的蛋白质是由一条多是由一条多肽链组成，如溶菌成，如溶菌酶、肌、肌红蛋白蛋白 寡聚蛋白寡聚蛋白质：血：血红蛋白（蛋白（2、2）、）、己糖激己糖激酶（4）l不含不含辅基的基的简单蛋白蛋白质分子量分子量=aa数目数目*110现在学习的是第2页，共31页二、二、肽肽现在学习的是第3页，共31页（一）（一）肽和和肽键的的结构构一一个个氨氨基基酸酸的的氨氨基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的羧基基之之间失失水水形形成成的的酰胺胺键称称为肽键，所所形形成成的化合物称的化合物称为肽。氨基酸借。氨基酸借肽键联结成多成多肽链。由由两两个个氨氨基基酸酸组成成的的肽称称为二二肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组成成的的肽则称称为多多肽。组成成肽链的的氨氨基基酸由于参加酸由于参加肽键的形成已的形成已经不是原来完整的分子因此称不是原来完整的分子因此称为氨基酸残基。氨基酸残基。现在学习的是第4页，共31页肽的命名的命名l在多在多肽链中，氨基酸残基按一定的中，氨基酸残基按一定的顺序排列，序排列，这种排列种排列顺序称序称为氨基酸氨基酸顺序。序。l通常在多通常在多肽链的一端含有一个游离的的一端含有一个游离的-氨基，称氨基，称为氨基端或氨基端或N-端端；在另一端；在另一端含有一个游离的含有一个游离的-羧基，称基，称为羧基端或基端或C-端。端。l氨基酸的氨基酸的顺序是从序是从N-端的端的氨基酸残基开始，以氨基酸残基开始，以C-端端氨基酸残基氨基酸残基为终点的排列点的排列顺序。如序。如下五下五肽可表示可表示为：名称：名称：丝氨氨酰甘氨甘氨酰酪氨酪氨酰丙氨丙氨酰亮氨酸亮氨酸(5(5肽，4 4个个肽键)写法：写法：Ser-Gly-Try-Ala-Leu或，（或，（*反反过来写是另外的来写是另外的肽）现在学习的是第5页，共31页*肽键的的结构特点：构特点：（1）肽键即即-CNH-这种种结构是蛋白构是蛋白质分子分子中的主要共价中的主要共价键，其中，其中C-N键具有具有约40%的部分的部分双双键性性质，而不能自由旋，而不能自由旋转。o现在学习的是第6页，共31页（2）组成成肽键的的4个个原原子子和和它它相相邻的的两两个个-碳碳原原子子（C）都都处于于同一个平面内，此平面称同一个平面内，此平面称为肽平面（或平面（或酰胺平面）。胺平面）。现在学习的是第7页，共31页多多肽链可以看成由无数个可以看成由无数个酰胺平面被胺平面被C串串联起来起来组成的；成的；现在学习的是第8页，共31页（3）在）在肽平面内，两个平面内，两个C原子及其原子及其氨基酸的侧链氨基酸的侧链R互相远离形成反式构型，互相远离形成反式构型，肽链中的中的肽键一般是一般是反式构型反式构型，反式构型比，反式构型比顺式式稳定。定。CNCHCO肽键的反式构型肽键的反式构型现在学习的是第9页，共31页(二二)肽的物理和化学性的物理和化学性质1.1.旋光性旋光性短短肽的旋光度的旋光度约等于其各个氨基酸的旋光度的等于其各个氨基酸的旋光度的总和；但和；但长肽和蛋白和蛋白质并不是氨并不是氨基酸的基酸的简单加和。加和。2.2.肽的酸碱性的酸碱性质l短短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子形式存在。的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子形式存在。N端端NH l肽的酸碱性的酸碱性质主要取决于主要取决于 C端端COOH 侧链上可解离的基上可解离的基团l在在长肽或蛋白或蛋白质中，可解离的基中，可解离的基团主要是主要是侧链基基团。现在学习的是第10页，共31页3.肽的化学反的化学反应l 肽的的-羧基基、-氨氨基基和和侧链R基基上上的的活活性性基基团都都可可以以发生生与与游游离离氨氨基基酸酸中中相相应的基的基团类似的反似的反应，如，如茚三三酮反反应（NH2末端氨基酸残基）。末端氨基酸残基）。l双双缩脲反反应*一一般般含含有有两两个个或或两两个个以以上上肽键结构构的的化化合合物物与与CuSO4碱碱性性溶溶液液都都能能发生生双双缩脲反反应而生成紫而生成紫红色或色或蓝紫色的复合物，是紫色的复合物，是肽和蛋白和蛋白质所特有的。所特有的。双双缩脲反反应可用于定量分析；游离氨基酸无此反可用于定量分析；游离氨基酸无此反应。现在学习的是第11页，共31页(三三)天然存在的活性天然存在的活性肽在生物体中，多在生物体中，多肽最重要的存在形式是作最重要的存在形式是作为蛋白蛋白质的的亚单位。但是，也有位。但是，也有许多分子量比多分子量比较小的多小的多肽以游离状以游离状态存在。存在。这类多多肽通常都具有特殊的生理通常都具有特殊的生理功能，常称功能，常称为活性活性肽。1.还原型谷胱甘原型谷胱甘肽 GluCysGly（GSH）即谷氨即谷氨酰半胱胺半胱胺酰甘氨酸甘氨酸l 红细胞胞中中的的巯基基缓冲冲剂，维持持血血红蛋蛋白白和和红细胞胞中中其其它它蛋蛋白白质的的半半胱胱氨氨酸酸残基（残基（巯基）基）处于于还原状原状态；2GSH GSSGl参与氧化参与氧化还原原过程，清除内源性程，清除内源性过氧化物和自由基。氧化物和自由基。H2O2+2GSH 2H2O+GSSGGSHPX现在学习的是第12页，共31页2.脑啡啡肽（5肽）具有具有镇痛作用。痛作用。Met-脑啡啡肽：TyrGlyGlyPheMet Leu-脑啡啡肽：TyrGlyGlyPheLeu现在学习的是第13页，共31页四、蛋白四、蛋白质测序的策略序的策略蛋白蛋白质的一的一级结构构测定包括定包括组成蛋白成蛋白质的的多多肽链数目、多数目、多肽链的氨基酸的氨基酸顺序，以及序，以及二硫二硫键位置的确定。其中最重要的是多位置的确定。其中最重要的是多肽链的氨基酸的氨基酸顺序，它是蛋白序，它是蛋白质生物功能的生物功能的基基础。现在学习的是第14页，共31页测定步定步骤(1)(1)测定蛋白定蛋白质分子中多分子中多肽链的数目。的数目。l通通过测定末端氨基酸残基定末端氨基酸残基(N端或端或C端端)的摩的摩尔数与蛋白数与蛋白质相相对分子量之分子量之间的关系，即可确定多的关系，即可确定多肽链的数目。的数目。N端端现在学习的是第15页，共31页(2)多多肽链的拆分的拆分l由多条多由多条多肽链组成的蛋白成的蛋白质分子，必分子，必须先先进行拆分。行拆分。l有些寡聚蛋白有些寡聚蛋白质，多，多肽链靠非共价靠非共价键连接的；接的；用用变性性剂：8 8mol/L尿素或尿素或6 6mol/L盐酸胍酸胍处理，理，SDS-PAGE。有些多有些多肽链间是通是通过二硫二硫键交交联的的现在学习的是第16页，共31页(3)(3)断开多断开多肽链内的二硫内的二硫桥 几条多几条多肽链通通过二硫二硫键交交联在一起，如下方法断开：在一起，如下方法断开：可在可在8mol/L尿素或尿素或6mol/L盐酸胍存在下：酸胍存在下：l用用过量的量的-巯基乙醇（基乙醇（还原原剂）处理，使二硫理，使二硫键还原原为巯基基。l过甲酸氧化：甲酸氧化：SS+HCOOOH SO3H 现在学习的是第17页，共31页(4)(4)分析每条多分析每条多肽链的氨基酸的氨基酸组成成l分离、分离、纯化的部分化的部分多多肽链样品完全品完全水解水解（酸、碱酸、碱）后）后，测定其氨基酸定其氨基酸组成，并成，并计算出氨基酸成分的算出氨基酸成分的分子比或各种残基的分子比或各种残基的数目数目，便于，便于选择裂解裂解方法及方法及试剂。现在学习的是第18页，共31页(5)(5)鉴定多定多肽链的的N末端和末端和C末端残基末端残基l多多肽链端基氨基酸分端基氨基酸分为两两类：N-端氨基酸和端氨基酸和C-端氨基酸。端氨基酸。l在在肽链氨基酸氨基酸顺序分析中，最重要的是序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。N末端末端现在学习的是第19页，共31页vSanger法：法：2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（Sanger试剂）在碱性条件下，能在碱性条件下，能够与与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。）。v在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。氨基酸。该产物能物能够用乙用乙醚抽提分离。抽提分离。不同的不同的DNP-氨基酸可以用氨基酸可以用层析法、色析法、色谱法法进行行鉴定。定。N-末末端端氨氨基基酸酸测定定 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB或或FDNB）法法现在学习的是第20页，共31页v在碱性条件下，丹磺在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基（二甲氨基萘磺磺酰氯）可以与）可以与N-端氨基端氨基发生生酰基化作用，得到丹磺基化作用，得到丹磺酰-氨基酸氨基酸,水解氨基酸不需提取直接水解氨基酸不需提取直接电泳或薄泳或薄层层析加以析加以鉴定定。v此法的此法的优点是丹磺点是丹磺酰-氨基酸有很氨基酸有很强的的荧光性光性质，检测灵敏度可以灵敏度可以达到达到1 1 1010-9-9mol，比比DNFB法高法高100100倍。倍。丹磺丹磺酰氯（DNS）法法现在学习的是第21页，共31页vEdman法：多法：多肽或蛋白或蛋白质的末端氨基酸与苯异硫的末端氨基酸与苯异硫氰酸酸酯（PITC,Edman 试剂）作用，生成无色）作用，生成无色PTH氨基酸，有氨基酸，有机溶机溶剂抽提，抽提，层析、色析、色谱法法鉴定。定。vPTC基的引入只是降低第一个基的引入只是降低第一个肽键的的稳定性，可定性，可测定氨基酸序定氨基酸序列。列。苯异硫苯异硫氰酸酸酯（PITC）法法现在学习的是第22页，共31页v氨氨肽酶是一种是一种肽链外切外切酶，它能从多，它能从多肽链的的N-端逐个的向端逐个的向里水解。里水解。v反反应时间氨基酸种氨基酸种类和数量和数量动力学曲力学曲线，N-末端残基末端残基顺序。序。v酶对各种各种肽键的敏感性不一的敏感性不一样。氨氨肽酶法法现在学习的是第23页，共31页v多多肽与无水与无水肼加加热，C-端氨基酸即从端氨基酸即从肽链上解离出来，上解离出来，其余的氨基酸其余的氨基酸氨基酸氨基酸酰肼化物。苯甲化物。苯甲醛沉淀氨基酸的沉淀氨基酸的酰肼，上清中的，上清中的C端游离氨基酸借助端游离氨基酸借助FDNB或或DNS法、法、层析析鉴定。定。vGln、Asn、Cys、Arg不能用此法。不能用此法。肼解法解法C-末末端端氨氨基基酸酸测定定无水无水现在学习的是第24页，共31页v羧肽酶是一种是一种肽链外切外切酶，它能从多，它能从多肽链的的C-端逐个的水解。根据不同的反端逐个的水解。根据不同的反应时间测出出酶水解所水解所释放出的氨基酸种放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白和数量，从而知道蛋白质的的C-末端残末端残基基顺序。序。羧肽酶法法羧肽酶A：除除Pro、Arg、Lys 外的所有外的所有C端端a.a 羧肽酶B：只水解只水解Arg、Lysv目前常用的目前常用的羧肽酶有四种：有四种：A,B,C和和Y；A和和B来自胰来自胰脏；C来来 自柑桔叶；自柑桔叶；Y来自面包酵母。来自面包酵母。现在学习的是第25页，共31页(6)(6)裂解多裂解多肽链成成较小片段小片段 采用不同的断裂方法将多采用不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套品断裂成两套或多套肽段段或或肽碎片，碎片，对每段每段肽分离分离纯化、氨基酸化、氨基酸鉴定。定。现在学习的是第26页，共31页v较高高专一性，水解一性，水解产率高，所以使用广泛。常率高，所以使用广泛。常见的蛋白的蛋白酶（内切（内切酶）有：有：v胰蛋白胰蛋白酶：Lys（Arg）X v胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶（糜蛋白（糜蛋白酶）Tyr（Trp、Phe）Xv胃蛋白胃蛋白酶：Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu)v葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白蛋白酶）：）：GluXv梭菌蛋白梭菌蛋白酶（Arg蛋白蛋白酶）：）：ArgX多多肽链的的选择性降解性降解酶裂裂解解法法C现在学习的是第27页，共31页v溴化溴化氰水解法，水解法，MetX v羟 胺胺（NH2OH）断断 裂裂，AsnGly 专一性不一性不强化学裂解法化学裂解法现在学习的是第28页，共31页(7)(7)测定各定各肽段的氨基酸序列段的氨基酸序列最常用的最常用的肽段段测序方法是序方法是Edman化学降解法，此外化学降解法，此外还有有酶解解法、法、质谱法。法。现在学习的是第29页，共31页vEdman反反应:（苯异硫苯异硫氰酸酸酯，PITC法）法）N-末端氨基酸分析法。此法的特末端氨基酸分析法。此法的特点是能点是能够不断重复循不断重复循环，将，将肽链N-端端氨基酸残基逐一氨基酸残基逐一进行行标记和解离。和解离。Edman化学降解法化学降解法肽肽段段段段氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸顺顺序序序序分分分分析析析析法法法法现在学习的是第30页，共31页耦耦联环化断裂化断裂转化化产 物物：苯苯 乙乙 内内 酰 硫硫 脲 衍衍 生生 物物（PTH-氨氨基基酸酸），无无色色，可可以以用用层析法分离析法分离鉴定。定。被被Edman用用 来来 鉴 定定 多多 肽 的的NH2末端氨基酸末端氨基酸。现在学习的是第31页，共31页