聚合酶链反应优秀课件.ppt

聚合酶链反应第1页，本讲稿共69页 DNADNA的的复制复制 (replication)(replication)由亲代由亲代DNADNA合成两个相同的子代合成两个相同的子代 DNA DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA 一、一、PCR的基本原理的基本原理第2页，本讲稿共69页A AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT T母代母代DNADNA子代子代DNADNA第3页，本讲稿共69页基本原理：基本原理：在模板、引物、在模板、引物、4种种dNTP和赖热和赖热DNA聚聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的列之间的DNA区段的酶促合成反应。区段的酶促合成反应。第4页，本讲稿共69页基本步骤：基本步骤：变性：加热使双链变性：加热使双链DNA变为单链变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部退火：降温使引物和互补模板在局部 形成杂交链形成杂交链 延伸：耐热延伸：耐热DNA聚合酶按聚合酶按53方向催化方向催化以引物为起始点的延伸反应以引物为起始点的延伸反应第5页，本讲稿共69页一、一、PCR的基本原理的基本原理 示意图示意图第6页，本讲稿共69页二、二、PCR引物设计引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。二是聚合酶对引物的有效延伸。PCR反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即5引物和引物和3引物。设计引物时，引物。设计引物时，通常以信息链为基准，通常以信息链为基准，5引物与位于待扩增片段引物与位于待扩增片段5上游的一小上游的一小段段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，的合成，3引物与扩增片段引物与扩增片段3端的一小段端的一小段DNA序列互补，引导序列互补，引导互补链的合成。互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。片段。第7页，本讲稿共69页（一）（一）PCR引物设计原则引物设计原则1、引引物物长长度度一一般般为为1530个个核核苷苷酸酸。引引物物过过短短会会使使PCR的的特特异异性性降降低低，过过长长会会提提高高相相应应的的退退火火温温度度，并并使使延延伸伸温温度度超超过过TaqDNA聚聚合合酶酶的的最最适适温温度度74,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。2、引引物物中中的的碱碱基基尽尽可可能能随随机机分分布布，避避免免出出现现嘌嘌呤呤，嘧嘧啶啶的的堆堆积积现现象象。尤尤其其是是引引物物的的3端端不不应应有有连连续续3个个G和和C。否否则则会会使使 引引物物在在模模板板的的G+C富富集集序序列列区区错错误误配配对对。引引物物中中G+C的的含含量量 在在4555%左左右右。设设计计引引物物时时要要考考虑虑3端端和和5端端 引引物物具具有有相相似似的的Tm值值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引引物物长长度度要要确确保解链温度不低于保解链温度不低于54C3、引引物物自自身身内内部部不不应应存存在在互互补补序序列列以以避避免免折折叠叠成成发发夹夹结结构构。按按经经验验，引引物物自自身身存在的连续互补序列，一般不超过存在的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免，尤其应避免3端的互补重叠。端的互补重叠。第8页，本讲稿共69页5、引引物物的的碱碱基基序序列列不不应应与与非非扩扩增增区区域域有有同同源源性性。尤尤其其是是引引物物3末末端端连连续续8个个碱碱基基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引引物物3端端碱碱基基是是引引发发延延伸伸的的起起点点，因因此此一一定定要要与与模模板板DNA配配对对。引引物物3端的最佳碱基选择是端的最佳碱基选择是G和和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7、引引物物的的5端端可可以以修修饰饰，如如附附加加限限制制酶酶位位点点，引引入入突突变变位位点点，用用生生物物素素，荧荧光光物物质质，地地高高辛辛标标记记，加加入入其其它它短短序序列列包包括括起起始始密密码码子子，终终止止密密码码子子等等。在在PCR的的起起始始反反应应中中，引引物物5端端游游离离的的碱碱基基并并不不影影响响引引导导新新生生链链DNA合合成成的的能能力力。但但在在后后续续的的扩扩增增循循环环中中，这这些些与与初初始始模模板板不不配配对对的的序序列列被被带带到到PCR产产物物的的双双链链中中去去，所所以以如如此此引引物物参参与与的的PCR产产物物，既既含含有有目目的的扩扩增增片片段段又又含含有有两两侧侧引引入入的的核核苷苷酸酸序序列。列。第9页，本讲稿共69页（二）引物设计的方法（二）引物设计的方法现在现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，网页，(在线引物设计的网站有：在线引物设计的网站有：http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3www.cgi;http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer;http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;http:/itsa.ucsf.edu/urolab/methprimer/index1.html;http:/alces.med.umn.edu/rawprimer.html)得到设计好的引物，也可以在本地计算机上得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。也不尽相同。第10页，本讲稿共69页三、模板制备三、模板制备 PCR的的模模板板可可以以是是DNA，也也可可以以是是RNA。当当用用RNA作作模模板板时时，首首先先要要进进行行逆逆转转录录生生成成cDNA，然然后后再再进进行行正正常常的的PCR循循环环。大大多多数数用用途途的的PCR反反应应中中，对对DNA模模板板的的要要求求并并不不严严格格。首首先先对对纯纯度度要要求求不不严严。大大量量的的实实验验数数据据表表明明存存在在一一定定量量的的蛋蛋白白质质，或或SDS等等对对实实验验过过程程影影响响不不大大，所所以以只只要要没没有有交交叉叉污污染染，模模板板DNA的的制制备备可可以以不不必必像像克克隆隆、酶酶切切、连连接接、标标记记等等反反应应所所用用DNA制制备备那那样样严严格格。其其次次，模模板板用用量量很很低低，理理论论上上102104拷拷贝贝的的模模板板是是可可满满足足各各种种要要求求的的PCR反反应应。由由于于种种种种原原因因，准准备备的的模模板板量量要要求求达达一一定定水水平平。一一方方面面可可减减少少由由于于实实验验操操作作和和实实验验精精确确度度方方面面等等原原因因而而引引起起的的扩扩增增失失败败，同同时时用用作作扩扩增增的的模模板板DNA量量越越多多，由由于于交交叉叉污污染染引引起起的的反应失败的可能性小。反应失败的可能性小。第11页，本讲稿共69页（一）（一）DNA模板制备模板制备去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸水煮沸溶解细胞水煮沸溶解细胞要求并不严格要求并不严格模板用量低，哺乳动物基因组模板用量低，哺乳动物基因组DNA1g，质粒，质粒DNA0.1ng第12页，本讲稿共69页(二二)RNA模板的制备模板的制备RNA提取试剂盒提取试剂盒酸性硫氰酸胍酸性硫氰酸胍-酚酚-氯仿法氯仿法异硫胍氯化铯密度梯度分离法异硫胍氯化铯密度梯度分离法SDS-酚酚-氯仿法氯仿法注意防止注意防止RNA水解水解第13页，本讲稿共69页（三）模板的取材三）模板的取材病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等立克次体、支原体等病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等法医学标本：血斑、精斑、毛发法医学标本：血斑、精斑、毛发考古标本考古标本第14页，本讲稿共69页四、四、PCR基本反应基本反应（一）以（一）以DNA为模板的反应为模板的反应反应体积：反应体积：50100l缓冲液缓冲液引物引物底物：底物：4种种dNTP模板：模板：102105拷贝拷贝TaqDNA聚合酶聚合酶矿物油矿物油其中模板其中模板DNA的用量必须根据其分子量的大小加以调整。的用量必须根据其分子量的大小加以调整。第15页，本讲稿共69页（二）以（二）以mRNA为模板的反应为模板的反应以以mRNA为原始模板进行的为原始模板进行的PCR反应反应称为逆转录称为逆转录PCR一）逆转录反应体系一）逆转录反应体系体积：体积：20 l缓冲液缓冲液底物：底物：4种种dNTP引物：引物：oligo(dT)1218模板：模板：RNA逆转录酶逆转录酶其他试剂：其他试剂：RNA酶抑制剂，酶抑制剂，MgCl2.DTT.牛血清白蛋白牛血清白蛋白二）二）PCR反应体系同以反应体系同以DNA模模 板的反应体系板的反应体系第16页，本讲稿共69页（三）（三）PCR产物的积累规律产物的积累规律 在在PCR反反应应中中，DNA扩扩增增过过程程遵遵循循酶酶的的催催化化动动力力学学原原理理。反反应应初初期期，目目的的DNA片片段段呈呈指指数数扩扩增增。随随着着目目的的DNA产产物物逐逐渐渐积积累累，在在引引物物一一模模板板与与DNA聚聚合合酶酶达达到到一一定定比比例例时时，酶酶的的催催化化反反应应趋趋于于饱饱和和，此此时时扩扩增增DNA片片段段的的增增加加减减慢慢进进入入相相对对稳稳定定状状态态，即即出出现现“停停滞滞效效应应”，又又称称“平平台台期期”。到到达达平平台台期期所所需需PCR循循环环次次数数取取决决于于样样品品中中模模板板的的拷拷贝贝数数、PCR扩扩增增效效率率、DNA聚聚合合酶酶种种类类和和活活性性、以以及及非非特特异异产产物物的的竞竞争争等等因因素素。到到达达平平台台期期前前，TaqDNA聚聚合合酶酶一一般般要要进进行行25次次以以上上PCR循环。循环。多数情况下，平台期在多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。反应中不可避免。第17页，本讲稿共69页 PCR产物的积累规律示意图产物的积累规律示意图第18页，本讲稿共69页 五、五、PCR反应条件的控制反应条件的控制(一一)标准标准PCR反应流程反应流程1.反应体系：标准反应体系：标准PCR反应体积为反应体积为50100l,其中其中含有含有缓缓冲液，冲液，4种底物，引物，种底物，引物，DNA模板和耐模板和耐热热DNA聚合聚合酶酶。2.反反应应步步骤骤：加入各种：加入各种试剂试剂，950C热变热变性性510分分钟钟，使模板使模板DNA充分充分变变性，同性，同时时除去蛋白除去蛋白酶酶，氯氯仿仿对对耐耐热热DNA聚合聚合酶酶的影响。然后加入的影响。然后加入2UTaqDNA聚合聚合酶酶，加加50l液体石蜡封盖反液体石蜡封盖反应应体系，防止液体体系，防止液体挥发挥发。进进行行PCR反反应应。但。但PE9700仪设计仪设计了了热热盖，不需加液体石蜡。盖，不需加液体石蜡。第19页，本讲稿共69页(二二)循环参数数循环参数数变性温度和时间：按模板变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时复杂程度来调整变性温度和时间。间。94 ，1min；95 ，30 s；97 ，15 s；退火温度和时间：退火温度和时间：4555 ，30s1min延伸温度和时间：延伸温度和时间：72 ，时间因扩增片段的长度而异：，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；34kb,34min循环次数：循环次数：2530次，视最初靶分子浓度而定次，视最初靶分子浓度而定两步两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二温：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二温式两步式两步PCR第20页，本讲稿共69页(三三)PCR反应成分反应成分1.PCR反应的缓冲液：反应的缓冲液：1050mmol/L Tris-Cl 缓冲液，缓冲液，72 时时pH7.2,调节反应体系的调节反应体系的pH值，使值，使Taq DNA聚聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。板的二级结构。第21页，本讲稿共69页 2.镁离子浓度：镁离子浓度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会浓度过低，会显著降低酶活性。显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。在在PCR反应中，反应中，Mg2+的总量应比的总量应比dNTPs的浓度高。的浓度高。其其原原因因是是引引物物、模模板板、dNTP分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团可可与与Mg2+结结合合而而降降低低游游离离Mg2+浓浓度度，从从而而影影响响Taq DNA聚聚合合酶酶的的活性。活性。常用常用1.5mmol/L。第22页，本讲稿共69页 3.底物浓度：底物浓度：20200mol/L dNTP溶溶液液具具有有较较强强的的酸酸性性。使使用用时时应应用用NaOH将将pH值值调调至至7.07.5，分装小管，于，分装小管，于-20存放，过多冻融会使存放，过多冻融会使dNTP产生降解。产生降解。在在PCR反反应应中中，dNTPs浓浓度度在在20200mol/L,dNTP浓浓度度过过高高可可加加快快反反应应速速度度，同同时时还还可可增增加加碱碱基基的的错错误误掺掺入入率率和和实实验验成成本本。反反之之，低低浓浓度度的的dNTP会会导导致致反反应应速速度度的的下下降降，但但可可提提高高反反应应的的特特异异性性及及实实验验的的精精确确性性。4种种dNTP在在使使用用时时必必须须以以等等摩摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。第23页，本讲稿共69页 4.耐热耐热DNA聚合酶：聚合酶：2.55 u在在PCR反反应应中中，DNA聚聚合合酶酶是是最最关关键键的的因因素素之之一一。PCR发发明明的的初初期期使使用用的的DNA聚聚合合酶酶是是Klenow片片段段、T4DNA聚聚合合酶酶和和T7DNA聚聚合合酶酶，它它们们因因对对热热的的稳稳定定性性差差而而未未得得到到广广泛泛应应用用。直直到到耐耐热热的的DNA聚聚合合酶酶(Taq DNA polymerase)应应用用于于PCR反反应应，才才使使这这一一技技术术得到迅速发展和广泛应用。得到迅速发展和广泛应用。第24页，本讲稿共69页（1）TaqDNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶在聚合酶在7580具有最高的聚合酶活性。具有最高的聚合酶活性。7580每个酶分子每秒可延伸约每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，个核苷酸，70时时延伸速度在延伸速度在60个核苷酸个核苷酸/秒以上。秒以上。55时为时为22个核苷个核苷酸酸/秒；秒；37和和22时分别为时分别为1.5个和个和0.25个核苷酸个核苷酸/秒。秒。温度超过温度超过80时，合成速度明显下降，可能与引物和模时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。板结合稳定性遭到破坏有关。第25页，本讲稿共69页Taq DNA聚聚合合酶酶没没有有35外外切切酶酶活活性性。没没有有校校正正功功能能的的。对对于于30次次循循环环的的PCR扩扩增增反反应应。此此酶酶的的错错配配率率为为0.1%0.25%。Taq DNA聚聚合合酶酶体体外外扩扩增增DNA的的忠忠实实性性是是所所有有已已知知忠忠实实性性的的DNA聚聚合合酶酶中中最最低低的的。因因此此在在特特别别考考虑虑扩扩增增产产物物忠忠实实性性，推推荐荐采采用用具具有有校对功能的其他耐热的校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如聚合酶。如Vent和和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚聚合合酶酶具具有有类类似似未未端端转转移移酶酶的的功功能能，能能催催化化dNTP加加到到DNA的的3-OH端端。但但对对4种种dNTP聚聚合合到到3-未未端端的的能能力力不不同同，对对dATP的的聚聚合合能能力力高高于于其其他他3种种核核苷苷酸酸，因因此此PCR产产物物的的末末端端总总是是带带有有两两个个A。我我们们利利用用它它的的这这种种特特性性，在在构构建建T载载体体时时，在在反反应应体体系系 中中只只加加一一种种底底物物，即即只只加加dTTP。此此酶酶就就催催化化在在载载体体末末端端加加上上dT,这种载体即可直接用来克隆这种载体即可直接用来克隆PCR 产物。产物。第26页，本讲稿共69页（2）Tth DNA聚合酶聚合酶在在95 0C半衰期为半衰期为20分钟，具有逆转录酶分钟，具有逆转录酶活性，可简化活性，可简化RT-PCR。但不具。但不具35 外切酶活性，没有校对功能，催化聚合外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为反应的错误掺入率为1/500第27页，本讲稿共69页（3）Vent DNA聚合酶聚合酶该酶在该酶在1000C时半衰期达时半衰期达95分钟，分钟，97.50C时半衰期长达时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长分钟，其扩增产物的长度可达度可达1013kb。Vent DNA聚合聚合酶酶具有具有35 外切外切酶酶活性，具有校活性，具有校对对功能，功能，错错误掺误掺入率入率为为1/31000，忠，忠实实性比性比TaqDNA聚合聚合酶酶提高提高5 10倍。倍。第28页，本讲稿共69页（4）Pfu DNA聚合酶聚合酶此酶耐热性极好，在此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于半衰期大于3小时，具有小时，具有35 外切酶活性，催化外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高聚合酶高12倍。倍。第29页，本讲稿共69页 4.引物：引物：0.10.5 mol/L PCR 反反应应引引物物浓浓度度为为0.10.5mol/L,引引物物与与模模板板的的摩摩尔尔比比至至少少为为108：1。如如此此过过量量的的引引物物才才能能确确保保模模板板DNA一一旦旦变变性性就就与与引引物物退退火火，而而不不能能与与其其自自身身退退火火。但但引引物物浓浓度度偏偏高高会会引引起起错错配配和和非非特特异异性性产产物物扩扩增增，且且可可增增加加引引物物之之间间形形成成二二聚聚体体的的几几率率，降降低低扩扩增增效率。但如果该比例太低，效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。效率也会降低。第30页，本讲稿共69页 5.模板模板在一定范围内在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或或102 105拷贝的待扩增片段作为模板拷贝的待扩增片段作为模板第31页，本讲稿共69页 6.其他因素其他因素1）热启动：提高扩增的特异性）热启动：提高扩增的特异性2）添加剂：消除引物与模板的二级结构，降低）添加剂：消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进的解链温度，增进DNA复性时的特异配对，复性时的特异配对，增加或改进增加或改进DNA聚合酶的稳定性，可添加一些添聚合酶的稳定性，可添加一些添加剂。加剂。3）液体石蜡：防止反应液蒸发后引起的冷却与反应）液体石蜡：防止反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变。成分的改变。第32页，本讲稿共69页六、六、PCR实验中应注意的事项实验中应注意的事项 由于由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品的污染便有可能导致假阳性结果的出现。微量样品的污染便有可能导致假阳性结果的出现。（一）（一）PCR实验室的设置实验室的设置样品制备区样品制备区：这个区域专门用于制备模板，要求：这个区域专门用于制备模板，要求：PCR产物和产物和带有待扩增序列的带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作，克隆不能在这个区域操作，用于用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。能用于操作靶序列。在提取在提取DNA样品和样品和RNA样品时要样品时要带手套，并要经常更换。带手套，并要经常更换。纯化样品对污染的风险有极纯化样品对污染的风险有极大的影响。大的影响。第33页，本讲稿共69页PCR操作区：操作区：PCR仪应单独放在另一间实验室。仪应单独放在另一间实验室。另外，在另外，在PCR反应前应对准备和保持干净的反应前应对准备和保持干净的PCR成成分给予高度重视。分给予高度重视。所用的所有溶液应该没有核酸和所用的所有溶液应该没有核酸和核酸酶；核酸酶；所用所用PCR试剂中的水都是高质量的新鲜蒸试剂中的水都是高质量的新鲜蒸馏水；馏水；所用试剂都应大体积配制，分装保存（一次所用试剂都应大体积配制，分装保存（一次用量）；用量）；所用吸头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用吸头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。第34页，本讲稿共69页反应产物分析区：反应产物分析区：在这区域中所用的试在这区域中所用的试剂，一次性器材和仪器都必须专门用于剂，一次性器材和仪器都必须专门用于PCR产物的分析，绝对不能把这一区域产物的分析，绝对不能把这一区域的试剂或仪器用于样品的制备，的试剂或仪器用于样品的制备，PCR反反应前的操作。应前的操作。第35页，本讲稿共69页（二）设置严格对照（二）设置严格对照阳性对照：阳性阳性对照：阳性DNA模板模板阴性对照：阴性阴性对照：阴性DNA模板模板试剂对照：无试剂对照：无DNA模板模板第36页，本讲稿共69页（三）阴性结果应采取的措施（三）阴性结果应采取的措施用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增增加增加TaqDNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度增加模板量增加模板量纯化模板纯化模板增加扩增循环次数增加扩增循环次数适当降低退火温度适当降低退火温度第37页，本讲稿共69页（四）出现非特异性产物时应采取的措施（四）出现非特异性产物时应采取的措施增加退火温度增加退火温度减少减少TaqDNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度减少退火及延伸时间减少退火及延伸时间减少引物浓度减少引物浓度减少扩增循环次数减少扩增循环次数第38页，本讲稿共69页七、七、PCR相关技术的发展相关技术的发展 PCR技术建立以来，因其较高的实用性而技术建立以来，因其较高的实用性而在各个领域广泛使用。在各个领域广泛使用。PCR方法本身又在使用方法本身又在使用中不断得到发展，形成了一系列适用不同目的中不断得到发展，形成了一系列适用不同目的的特殊方法。的特殊方法。第39页，本讲稿共69页设计一对外测引物和一对内测引物设计一对外测引物和一对内测引物先用外测引物扩增含目的先用外测引物扩增含目的DNA的大片段的大片段再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段片段模板DNA加外侧引物A和B引物A 引物BPCR加内侧引物C和D引物CPCR 引物D巢式巢式PCR示意图示意图1、巢式、巢式PCR和半巢式和半巢式PCR(nested primer PCR)第40页，本讲稿共69页2、共享引物、共享引物PCR （shared primer PCR）利用利用3条引物来扩增两种不同的条引物来扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物可与序列，其中一条引物可与两种两种DNA序列互补结合序列互补结合共享引物共享引物PCR示意图示意图PCR 引物C引物APCR引物A 引物B第41页，本讲稿共69页3、多重、多重PCR(multiple PCR)用多对引物扩增同一模板的几个区域用多对引物扩增同一模板的几个区域第42页，本讲稿共69页4、不对称、不对称PCR(asymmetric PCR)采用不同的引物浓度扩增得到单链采用不同的引物浓度扩增得到单链DNA两引物浓度比为两引物浓度比为50100：1第43页，本讲稿共69页5、锚定、锚定PCR （anchored PCR)以以mRNA为模板经为模板经RT合成合成cDNA，末端转移酶在，末端转移酶在cDNA3末端加上末端加上poly(dG)尾。尾。Poly(dC)锚定引物与锚定引物与poly（dG)尾互补结合引导合成未尾互补结合引导合成未知知DNA序列序列第44页，本讲稿共69页6、反向、反向PCR（inverted PCR)用限制酶消化基因组用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计3端引物和端引物和5 端引物，扩增未知序列。端引物，扩增未知序列。第45页，本讲稿共69页7、彩色、彩色PCR（color complementation asay)用不同荧光染料分别标记用不同荧光染料分别标记PCR引物，采用多重引物，采用多重PCR扩增同一扩增同一DNA的不同区域，显示不同颜色，的不同区域，显示不同颜色，用于基因诊断。用于基因诊断。第46页，本讲稿共69页8、原位、原位PCR（in situ PCR）固定组织细胞内的固定组织细胞内的DNA或或RNA，以其为模板进行，以其为模板进行PCR反应的过程反应的过程 将原位杂交的细胞定位技术和将原位杂交的细胞定位技术和PCR的高灵敏度相结合，的高灵敏度相结合，产生了原位产生了原位PCR技术。其原理是以组织固定处理细胞内的技术。其原理是以组织固定处理细胞内的核酸或核酸或RNA作为靶序列，进行作为靶序列，进行PCR反应的过程。与其它反应的过程。与其它PCR方法不同的是，原位方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板不必从组织细胞中分离模板DNA或或RNA。如冷冻的组织或经有机试剂固定的组织细。如冷冻的组织或经有机试剂固定的组织细胞，用蛋白酶，胞，用蛋白酶，DNA 酶处理，进行原位的逆转录，再加酶处理，进行原位的逆转录，再加入入PCR扩增试剂，进行原位扩增试剂，进行原位PCR反应。用于检测靶基因的反应。用于检测靶基因的细胞定位、组织分布及靶基因的表达等。细胞定位、组织分布及靶基因的表达等。第47页，本讲稿共69页9、定量、定量PCR（quantified PCR）以以mRNA为模板合成为模板合成cDNA加入参照基因，待测基因，参照引物，待测基因引加入参照基因，待测基因，参照引物，待测基因引物物PCR扩增扩增以参照基因的扩增产物的量为基础，观测待测基以参照基因的扩增产物的量为基础，观测待测基因产物的相对量。进行定量因产物的相对量。进行定量PCR时，要考虑内参时，要考虑内参照因素、照因素、RNA制备、逆转录制备、逆转录PCR、凝胶电泳、定量、凝胶电泳、定量检测各个环节对结果的影响。检测各个环节对结果的影响。第48页，本讲稿共69页10、差异显示、差异显示PCR（differential display PCR）将两种将两种mRNA逆转录为逆转录为cDNA第一链第一链加入锚定引物，随机引物加入锚定引物，随机引物PCR扩增，以扩增产物代表相应扩增，以扩增产物代表相应mRNA分析两种细胞基因表达的差异分析两种细胞基因表达的差异第49页，本讲稿共69页11、重组、重组PCR（recombinant PCR）PCR参与的体外基因突变或基因融合过程参与的体外基因突变或基因融合过程第50页，本讲稿共69页第51页，本讲稿共69页12、荧光实时定量、荧光实时定量PCR技术技术 荧光定量荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近才出现的一种是新近才出现的一种PCR检检测方法，是基于荧光能量转移测方法，是基于荧光能量转移(FRET)的原理建立的。的原理建立的。FRET是指通过供受体发色团之间偶极是指通过供受体发色团之间偶极-偶极相互作用，偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，使受体发光。检能量从供体发色团转移至受体发色团，使受体发光。检测方法有双链测方法有双链DNA内插染料、水解探针检测模式、分子内插染料、水解探针检测模式、分子信标技术等多种。信标技术等多种。第52页，本讲稿共69页 在普通在普通PCR 仪的基础上再配备一个激发和检测仪的基础上再配备一个激发和检测的装置。通过的装置。通过PCR反应的数学函数关系，加入标准反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广泛的用途，如对病毒、性好，在临床检测方面有广泛的用途，如对病毒、病菌和其他病源微生物致病基因的检测。病菌和其他病源微生物致病基因的检测。第53页，本讲稿共69页 13.增敏增敏PCR当模板数小于当模板数小于1000个拷贝时，采用增敏个拷贝时，采用增敏PCR，可明显，可明显提高提高PCR的产量。的产量。分两期进行，第一期是在引物与模板均分两期进行，第一期是在引物与模板均少的状态下进行少的状态下进行，延长退火时间，进行，延长退火时间，进行15 20个循环。这个循环。这一期扩增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期一期扩增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期扩增时加入过多引无间的相互反应，阻止引物二聚体的扩增时加入过多引无间的相互反应，阻止引物二聚体的形成。形成。第二期反应：补加引物至第二期反应：补加引物至0.1mol/L,于常于常规规条件条件下下进进行行20个个PCR循循环环。第一期增加特异性，第二期增加第一期增加特异性，第二期增加特异特异产产物的量。物的量。第54页，本讲稿共69页 14.表达表达PCR 表达表达PCR是重组是重组PCR的一种，通过将高表达的启动子的一种，通过将高表达的启动子和高效转录的终止子附加与扩增目的基因的两个引物的和高效转录的终止子附加与扩增目的基因的两个引物的5 端，使目的基因的端，使目的基因的5 端带上强的启动子，端带上强的启动子，3 端带上端带上高效转录终止序列，将其克隆到表达载体上可获得高效表高效转录终止序列，将其克隆到表达载体上可获得高效表达。亦可直接进行转录和翻译。达。亦可直接进行转录和翻译。例如：将例如：将PCR 引物的引物的5 端带上启动子端带上启动子3 端的同源序列，端的同源序列，扩扩增的目的基因的增的目的基因的产产物物与启与启动动子混合子混合进进行第二次行第二次PCR扩扩增，增，经变经变性，退火，其中性，退火，其中有一种有一种产产物可作物可作为为PCR反反应应的模板，加入适当的引物，可的模板，加入适当的引物，可产产生生带带有启有启动动子序列目的子序列目的DNA片段，即可直接片段，即可直接进进行行转录转录和和翻翻译译。第55页，本讲稿共69页 八、八、PCR产物的检测产物的检测（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下便可以直接确定染色，在紫外灯下便可以直接确定DNA片段在凝胶片段在凝胶板中的位置。其分辨率很高，可测出板中的位置。其分辨率很高，可测出1ngDNA。首先。首先根据根据PCR扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般800bp以以上的片段用上的片段用0.8%的胶，的胶，800bp以下的片段用以下的片段用1.0%2.0%的胶。成功的的胶。成功的PCR扩增应可见到分子质量均一的一条区带扩增应可见到分子质量均一的一条区带，对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。第56页，本讲稿共69页 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的灵敏度比琼脂糖凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高泳高，主要用于分离制备小于，主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基长度的低分子质量基因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。PAGE有静电效应和分子筛效应，分辨率很高，在有静电效应和分子筛效应，分辨率很高，在DNA序列分析时，即使相差一个核苷酸片段也能很好地分开。序列分析时，即使相差一个核苷酸片段也能很好地分开。适用于适用于PCR扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比检测，银染比EB染色检测灵敏度高染色检测灵敏度高210倍。倍。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳第57页，本讲稿共69页 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是在常压基础上发展起来的是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。离子交换层析的基础是溶质分子所携带的电荷，而离子交换层析的基础是溶质分子所携带的电荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，ICE分析广分析广泛应用于泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化。的合成及其扩增后的分离纯化。（三）层析技术（三）层析技术第58页，本讲稿共69页 为了确定为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和点杂交和Southern印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。扩增产物分析。Southern印迹杂交可鉴定印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特产物的大小和特异性，检测灵敏度可达异性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是。基本过程是PCR产物产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。（四）分子杂交（四）分子杂交第59页，本讲稿共69页 若知道若知道PCR扩增片段