临床免疫学检验 名词解释&重要知识点 (上)讲课稿.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。临床免疫学检验 名词解释&重要知识点 (上)-抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。带现象（zonephenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。免疫佐剂（immunoadjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为。单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即。多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。杂交瘤技术【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。（一）小鼠骨髓瘤细胞理想骨髓瘤细胞的条件：细胞株稳定，易于传代培养；细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；该细胞是HGPRT或TK的缺陷株；能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞；融合率高。目前最常用的是NS-1和SP2/O细胞株（二）免疫脾细胞多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c小鼠；免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全弗氏佐剂。（三）细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000DPEG作细胞融合剂，浓度3050%之间，基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:21:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核的异核体，最终产生杂交细胞。（四）杂交瘤细胞的选择性培养肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），经HAT培养液筛选后，只有具备两亲本细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。细胞类型正常培养细胞TK缺陷细胞HGPRT缺陷细胞杂交瘤细胞正常培养基 + + + +HAT培养基 + - - +凝集反应（agglutinationreaction）：是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。直接：在适当电解质参与下，细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，称为。间接：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象，称为。其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中的待检抗体。反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的待检抗原。间接凝集抑制反应：用抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体作为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。间接血凝试验：是以红细胞为载体的间接凝集试验，即用已知的抗原（或抗体）致敏红细胞，与标本中相应的抗体（或抗原）特异结合，出现红细胞凝集现象。胶乳凝集抑制试验（LAT）：将抗原（或抗体）致敏胶乳颗粒，直接与待检标本中的抗体（或抗原）发生凝集反应。（常用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳）直接coombs试验：将抗人球蛋白试剂直接加到表面结合抗体的受检红细胞中，即可见细胞凝集。用于检测吸附于红细胞表面的不完全抗体。（如HDN、AIHA）间接coombs试验：将受检血清和具有相应抗原性的红细胞相结合，再加入抗人球蛋白抗体即可出现可见的红细胞凝集。用于检测血清中游离的不完全抗体。沉淀反应（precipitationreaction）：是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。免疫浊度测定：是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。钩状效应（highdosehookeffect）：免疫浊度测定，抗原过量导致形成的免疫复合物（IC）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。单向免疫扩散实验：是先将一定量的抗体混于琼脂凝胶中，使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。环的直径或面积的大小与抗原含量正相关。常用于IgG/A/M、补体C3/C4等血浆蛋白的测定。双向免疫扩散试验：是将抗原核抗体加在同一琼脂板的对应孔中，各自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线。沉淀线靠近抗原孔，说明抗体浓度较大；靠近抗体孔则说明抗原浓度大。形成的沉淀线弯向分子量大的一方。（待测物为两种抗原）两条沉淀线互相吻合相连，两抗原中存在相同表位；两条沉淀线交叉，说明两抗原完全不同；两条沉淀线相切，提示两抗原之间有部分相同。对流免疫电泳（CIEP）：实质上是双扩和电泳的结合。在pH8.6的碱性缓冲液琼脂中进行电泳，分子量小、等电点低、带有较多负电荷的Ag泳向阳极，而Ab球蛋白等电点偏高（约为6-7），在pH8.6时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指电场中液体对固体支持物的相对移动）干扰后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内即可相遇，在孔间两者分子比例合适的地方形成沉淀线。（抗原加在-级，抗体加在+级）抗原浓度越高，沉淀线越接近抗体孔，甚至超过抗体孔。本法简便快速，灵敏度是双扩的816倍，可检出蛋白质浓度达g/ml，常用于Ag/Ab的性质/效价/纯度测定。火箭免疫电泳（RIE）：实质上是单扩和电泳的结合。是将抗体混合于琼脂中，电泳时，抗体不移动，抗原由负极向正极移动，并随抗原浓度的下降，抗原泳动的基底区也逐渐变窄，抗原抗体免疫复合物形成的沉淀西安也越来越窄，形成一个火箭状的不溶性复合物沉淀峰。抗体浓度一定时，沉淀峰的高度与抗原量呈正相关。其灵敏度可达ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。免疫电泳（IEP）：将待测标本（蛋白质抗原）置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因所带电荷、分子量及构型不同，被分成肉眼不可见的若干区带。然后沿与电泳方向开一平行的抗体槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散。18-24h后，各区带蛋白与相应的Ab在相应的位置上形成弧形沉淀线。Ag越多，沉淀线越靠近Ab槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组分分析，仅为定性实验。免疫固定电泳（IFE）：实质是区带电泳和沉淀反应相结合。先将血清蛋白质置于琼脂凝胶中进行区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加于凝胶表面的泳道上，经过孵育，固定剂和抗血清在凝胶内渗透、扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的抗体，形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经氨基黑，参考泳道和抗原抗体沉淀区被着色，根据电泳移动距离分离单克隆组分，可对各类Ig及其轻链进行分型。最常用于M蛋白的鉴定。放射性核素：具有放射性的核素，在自然条件下可发生自发性的转化变为另一种（放射性）核素，并同时释放射线。这一转变过程称为放射性衰变。放射化学纯度：指在标记物中结合在抗原（或抗体）上的放射活性占该标记物总放射活性的百分比。比放射活性：是指单位质量标记物中所含的放射性活度，或每分子抗原（或抗体）平均所结合的放射性原子数目。放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素标记抗原与非标记抗原（待测/标准抗原）同时和限量特异性抗体进行竞争性结合反应，通过测定放射性核素标记抗原与抗体复合物的放射性活度，经相应的数学函数关系推算待测抗原的含量。免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性标记的抗体来测定样品中抗原的方法，所用的标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的。待测抗原与过量标记抗体结合反应形成标记抗体-抗原复合物及游离的标记抗体，测定的是标记抗体-抗原复合物的量.荧光免疫技术：是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫荧光技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。荧光抗体技术（FAT）：以荧光素标记抗体对抗原进行定位染色，并借助荧光显微镜观察标本片上荧光染色的形态，从而判断是否存在待测抗原，这种技术就是。荧光抗体染色方法：直接法（简便快速特异性强，但敏感性不如间接法，一种荧光抗体只能检测一种抗原）、间接法（敏感性比直接法高510倍，一种荧光二抗可检测多种抗原/抗体，但容易产生非特异性荧光）、双标记法（用于检测同一标本中的两种抗原）荧光：荧光物质吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为。发射光谱：是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的谱图激发光谱：是指固定检测发射光（荧光）波长，用不同波长的激发光照射样品得到的荧光的谱图。荧光效率：是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率发射荧光的光量分子数（荧光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）荧光猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。只有那些能产生明显荧光的有机化合物才能作为荧光色素。stokes位移：即激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素stokes位移大（273nm），激发/发射光谱不重叠，可减少干扰。酶免疫技术：是将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种免疫标记检测技术。是将酶与抗原或抗体结合成酶标记结合物（酶标抗原/抗体），酶标结合物既保留了抗原/抗体的免疫学活性，同时也保留了酶对底物的催化活性。在酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶作用的相应底物，通过酶催化底物产生显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定。常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）、-半乳糖苷酶（-Gal）常用的底物：HRP有邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）。ALP为对-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。-Gal为4-甲基伞形酮-D半乳糖苷（4MUG）常用的标记方法：交联法（戊二醛）和直接法（改良过碘酸钠法）固相载体的选择：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜载体包被（coating）：将抗体或抗原结合在固相载体上的过程。封闭（blocking）：用1%5%的牛血清蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附的干扰。酶联免疫吸附试验（ELISA）【基本原理】把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗体）；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（一）ELISA检测抗原的方法主要有：1、双抗体夹心法：适用于至少两个抗原决定簇（AD）的Ag。先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体，加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育，使固相抗体抗原复合物与酶标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，为“双抗体夹心”；洗涤去除游离酶标记抗体。加入底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG等项目的检测。2、双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原决定簇，分别制备两种单克隆抗体，在包被时使用一种单抗，酶标记时使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标记抗体同时加入反应体系，两种抗体分别与不同的抗原决定簇结合，只进行一次温育，在洗涤后即可加底物进行显色反应。担当待测抗原浓度过高时，可出现钩状效应，甚至出现假阴性结果，必要时可将标本适当稀释后重新测定。）3、竞争法：适用于小分子Ag或半抗原（只有一个AD）。先用特异性抗体包被固相载体，然后同时加入待测抗原和酶标记的抗原，待测样本中的抗原与酶标记抗原竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色。（二）ELISA检测抗体的方法主要有：1、间接法：检测Ab最常用的方法。常用酶标记羊抗人IgG。2、双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法，原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，但一般不会出现钩状效应。临床上乙型肝炎表面抗体HBsAb的测定常用此法。3、竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除的杂质，不易得到足够的纯化抗原或抗原性质不稳定时，可采用此方法。主要用于测定HBcAb和HBeAb。原理见下：（1）HBcAb的竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，然后加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体，此时待测标本中的HBcAb与酶标记HBcAb竞争性地与固相载体上的核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待测标本中的HBcAb的含量负相关。（2）HBeAb的竞争法：先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，此时待测标本中的HBeAb和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg，温育后洗涤，加入酶标记的HBeAb，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色强弱与待测标本中HBeAb的含量呈负相关。4、捕获法：又称反向间接法，主要用于血清中特定Ig类别的测定，最常用于病原体急性感染诊断中IgM型抗体检测。原理：首先将针对IgM的第二抗体包被于固相载体形成固相抗体，加入待测标本后，标本中所有的IgM（特异/非特异）即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原，其与固相载体上捕获的IgM特异性抗体结合，再加入针对特异性抗原的酶标记抗体，形成固相抗人链IgM-抗原-酶标记抗体复合物，最后加入底物显色，即可对待测标本中抗原特异性IgM进行定性或定量测定。此法临床上常用于病原体急性感染的实验室诊断，如急性甲肝时可检测HAV-IgM抗体，急性乙型肝炎时可检测抗HBc-IgM抗体。发光免疫分析（CLIA）：是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。兼有高灵敏性和高特异性。发光：分子/原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并施放光子的过程。化学发光：伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。发光效率：又称化学发光反应量子产率，是指发光剂在反应中的发光分子数与参加反应的分子数之比，取决于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。化学发光免疫技术可分为均相反应（不需分离）和非均相反应（需要分离）非均相分离方式有：固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离。【化学发光剂】直接化学发光剂：鲁米诺和吖啶酯（常用）间接化学发光剂：鲁米诺及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物【标记技术】常用标记方法：碳二亚胺缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法影响标记的因素：发光剂的选择、被标记蛋白质的性质、标记方法的选择、原料比、标记率、温度、纯化与保存。化学发光酶免疫分析（CLEIA）【原理】：是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗体（或抗原），与待测标本中相应的抗原（或抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。【特点】：属酶免疫测定范畴，测定过程与ELISA类似，仅最后一步酶反应的底物改为发光剂、测定的仪器改为光信号检测仪；酶标记抗原或抗体结合稳定；酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发出的光稳定，持续时间长，便于记录和测定。电化学发光免疫分析（ECLIA）【原理】是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应（它包括电化学和化学发光两个过程）。在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，复合物进入流动室，同时注入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在点击下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本缓冲液被冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光信号由安装在流动室上方的光信号检测器检测，光的强度与待测抗原的浓度成正比。【特点】：三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始的发光，持续时间长，信号强度高，容易测定、控制；三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性；试剂灵敏度高，稳定性好。生物素（B）又称维生素H，分子式为C10H16O3N2S，等电点（pI）为3.5。生物素结构中，I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻吩环，含有一个戊酸侧链，末端羧基是标记抗体或其他分子的唯一结构。抗体分子经生物素化后，其结合抗原的活性不受影响。多种酶经生物素化后，其催化能力保持不变或稍有降低。生物素-亲合素系统【特点】：高特异性、高敏感性、稳定强、实用性强【应用】：在标记免疫技术中可应用于标记信号放大环节，也可用于固相包被（或分离）环节一、应用于固相载体的包被环节链霉亲合素（亲合素）为弱酸性蛋白，可以吸附在固相载体（聚苯乙烯微孔板或纳米微球）表面，形成链霉亲合素包被固相载体；利用生物素标记抗原（或抗体），使待包被的抗原（抗体）通过生物素与固相材料表面的链霉亲合素结合，实现间接包被。此种包被模式不但可增加抗原（或抗体）包被数量，也可减少空间位阻效应，提高抗原（或抗体）的利用效率。此外，若固相材料不与生物素化抗原（或抗体）结合，待生物素化抗原（或抗体）与待检抗体（或抗原）反应后，再加入链霉亲合素预包被磁性纳米微球，含有生物素的免疫复合物可结合在固相载体表面，达到同样的分离效果。二、应用于检测系统的信号放大生物素-亲合素系统用于检测信号放大，可提高标记免疫分析的敏感性。基本方式有生物素-亲合素-生物素模式（BAB）和生物素-亲合素模式（BA）或标记亲合素模式。如将生物素标记在第一抗体上称为直接法，如生物素标记在第二抗体上称为间接法。生物素-亲合素-生物素模式的特点是生物素标记分子（如生物素标记抗体/酶蛋白），以游离亲合素为桥，连接抗原-抗体和信号检测系统；由于一个亲合素分子能同时结合4个生物素，且一个生物素大分子可标记多个生物素而产生级联放大效应，提升检测敏感性。实际应用中的ABC法：预先按一定比例将亲合素与生物素标记示踪物质（如生物素标记ALP）混合，形成可溶性的亲合素-生物素化酶标复合物，同时确保预留一定位点与生物素化的抗体（或抗原）结合。此种方法能减少操作步骤，又能实现标准化操作（有商品化的试剂）。将ABC法应用于双抗体夹心ELISA中，形成ABC-ELISA，为常用方法。固相膜免疫分析技术：是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶标记或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等）标记抗体或抗原作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。胶体金免疫技术：是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。胶体金：也称金溶胶，是金盐被还原为金原子后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成（内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷的H+）。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。免疫金：是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物。其制备过程实质上是抗体蛋白等大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。（一）斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）【原理】是在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的（一般5min左右完成）阳性反应在膜上呈现红色斑点。本法简化了操作步骤，达到简便的目的，已成为“床旁检测（POCT）”的主要方法之一。【方法类型】：双抗体夹心法：将抗体包被在硝酸纤维素膜中央，滴加待检标本，若标本中有待测抗原则在渗滤过程中与膜上抗体结合，然后滴加胶体金标记抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。间接法：将抗原包被在硝酸纤维素膜上，依次滴加待测标本、洗涤液和胶体金标记抗人IgG抗体，再加洗涤液洗涤，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。本法因受非目的IgG的干扰，易产生假阳性，临床上较少使用。（二）斑点金免疫层析试验（DICA）【原理】是将胶体金标记和蛋白质层析技术相结合的，以硝酸纤维素膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。在DICA中，滴加在膜一端的标本溶液受载体末的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读实验结果。【方法类型】：双抗体夹心法、竞争法、间接法（三）临床应用及评价1、特点：操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、便于保存等特点。2、灵敏度问题：灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，临床应用中应引起高度重视。3、临床应用：临床只能作为定性/半定量试验，目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如人绒毛膜促性腺激素HCG）。斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）【原理】与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为对蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。【技术要点】1、抗原包被膜：加少量（12L）抗原于膜上。由于NC膜吸附力强，故需在包被后进行封闭。2、抗原抗体反应：滴加样品血清，其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗。3、显色反应：滴加能形成不溶有色沉淀的底物溶液（如HRP标记物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。【方法评价】斑点-ELISA的优点为：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高68倍；试剂用量较ELISA约节约10倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存（-20可长达半年），不影响其活性。免疫印迹试验（IBT）亦称酶联免疫电转移印迹法（EITB），通常又称Western-blot。【原理】是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析相结合的技术，具有分析容量大、敏感性高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种常用方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。【技术要点】1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极涌动，分子量越小，涌动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有染色后才显出电泳区带）。2、电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（12A），通电45min转移即可完成。此阶段分离效果肉眼仍不可见。3、酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3,3-二氨基联苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨。并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。【方法学评价】1、抗体的性质：影响本试验成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体时别的表位的性质。只有那些能识别耐变形表位的抗体可与抗原结合，所以在该试验中常选用多克隆抗体。2、IBT的灵敏度：一种是在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩。其他方法都是针对增强信号本身设计的，包括使用信号更好和更强的荧光实际或使条带局部酶的活性增强等。3、IBT法在临床应用中存在一定局限性。非标记抗体酶免疫组织化学染色首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的敏感性【技术类型】（一）酶桥法抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体）将特异性识别组织抗原的第一抗体连接，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。本法较酶标法的敏感性有所提高，但操作分四步较为复杂。（二）过氧化物酶抗过氧化物酶酶（PAP）法是在酶桥法的基础上加以改良。本法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物）。该复合物由两个抗酶抗体和三个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同与酶桥法相比，PAP法操作简便，分三步；PAP复合物结构稳定，避免了酶桥法中标记易脱落的弊端；敏感性高；背景着色淡，因为即使桥联抗体存在有非特异性抗体的可能，但因其与第一抗体并非同种属，故不能与抗酶抗体结合。并且，如果抗酶抗体中存在着非抗酶抗体，当其与桥抗体或组织成分结合时，由于其不能与酶结合，也不会产生非特异性反应。（三）双桥PAP法该法建立在PAP法的基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未饱和Fc段结合，或桥抗体与特异性第一抗体未饱和的Fc段结合。如此对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测又实用价值。（四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP）法因部分组织细胞内含内源性过氧化物酶，限制了HRP的广泛应用，需选用其他酶免疫组织化学反应。本法是用碱性磷酸酶（ALP）代替HRP建立的碱性磷酸酶（ALP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP。其技术要点与PAP法相似。【常用酶及显色底物】最常用的是辣根过氧化物酶（HRP），常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色其他有：氨基乙基卡巴唑（AEC），反应产物为橘红色；4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。碱性磷酸酶为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：偶氮偶联反应，最终与重氮化合物作用生成不溶沉淀，如快蓝为深蓝色，快红为红色。靛蓝四唑反应，最终形成紫蓝色不溶沉淀。其他标记酶还有葡萄糖氧化酶（GO）、-半乳糖酶等；前者底物为葡萄糖，配以NBT和PMS，呈蓝色沉淀。对含有丰富内源性过氧化物酶的组织切片（如淋巴/肿瘤组织），首选ALP标记的免疫组织化学方法（但HRP比ALP染色结果的保存时间长）。GO存在敏感性不高、显色底物不易保存等缺点。ALP和HRP结合可进行双重或三重免疫组织化学标记。流式细胞术（FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。【工作原理】采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行分析处理，保证了检测速度与统计分析精确性。因而能同时从一个细胞上获取多种参数资料，保证对该细胞进行详细的分析。-