二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化复习进程.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化-二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化伴随凋亡现象的研究王秀丽虞星炬马小军中国科学院大连化学物理研究所1802组摘要目的：以小鼠胚胎干细胞系（ES-D3）为研究模型，应用诱导剂二甲基亚砜（DMSO）促进ES-D3向心肌细胞方向分化，明确其最佳诱导剂量及应用时间，旨在进一步标准化高效获得ES源心肌细胞的实验方法。同时探讨诱导剂量的DMSO在诱导ES-D3走向分化的同时，是否伴随有细胞凋亡现象的发生。方法：MTT法首先确定DMSO的应用剂量范围，然后设计不同条件培养基对ES-D3进行诱导分化，并在形态学，蛋白质及基因水平对ES源心肌细胞进行鉴定。此外，利用形态学、流式细胞仪等技术对DMSO诱导细胞凋亡进行定性及定量分析。结果：DMSO的低细胞毒性参考剂量为1%，能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞（与阴性对照组比较，p<0.01），诱导分化率可达96.7%。ES源心肌细胞不但能够表达多种心肌蛋白，而且其肌小节结构发育成熟。RT-PCR结果提示DMSO的促分化效应可能与心肌转录因子GATA-4的表达有关。此外，1%DMSO作用24h后即可诱导ES-D3细胞部分发生凋亡，并且随时间的延长而不断增强，分析该作用可能与凋亡相关基因p53的表达增高有关，而与抗凋亡基因bcl-2无明显相关性。结论：1%DMSO不但能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞，而且还能够以时间依赖的方式诱导ES-D3细胞部分走向凋亡。即：诱导分化与促进凋亡并存于DMSO对ES-D3的作用体系。关键词胚胎干细胞二甲基亚砜心肌细胞分化凋亡一.引言胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）是一类来自胚胎囊胚期内细胞团的多潜能细胞群，兼具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力。1981年，小鼠ES细胞系的成功建立成为干细胞研究领域的重要里程碑1。继之，ESC定向诱导分化的研究成为该领域的热点和难点课题。其中研究的较早也较为深入的是ESC向心肌细胞方面分化的研究2,3。这不但为发育生物学提供了宝贵的体外研究模型，而且还为心肌损伤后的细胞治疗提供了理想的种子细胞。但是，因ESC自发性分化为心肌细胞的比率很低(<0.2%-0.5%)，为了提高心肌细胞分化率，近年来多种化学诱导剂和细胞因子先后应用于ESC向心肌细胞分化的研究4-6。其中二甲基亚砜（dimethylsulphoxide,DMSO）的诱导作用受到国内外学者的公认。但由于促进ESC诱导分化的具体机制尚未完全阐明，加之细胞来源及质控标准的差异，各研究对所用剂量、具体诱导方法及诱导分化率报道不一。本研究基于前期工作基础，以ES-D3作为诱导分化的细胞模型，旨在将DMSO诱导ESC向心肌细胞分化的方法进一步标准化。此外，由于DMSO本身生物学效应比较复杂：在细胞生物学研究中，不但具有诱导分化的作用，而且还可促进肿瘤细胞走向凋亡（apoptosis）7-9。对于DMSO在诱导ESC走向分化的同时，是否伴随有细胞凋亡现象的发生，国内外尚无相关报道。本研究首次对此进行初步研究，以利于进一步全面阐明DMSO对ESC的复杂生物学效应。二.材料与方法1材料1.1 129纯系小鼠胚胎干细胞系（ES-D3），25-30代，由北京大学医学部提供。1.2 主要试剂与设备H-DEMEM(Gibco),胎牛血清（Hyclone），二甲基亚砜(Sigma)，丝裂霉素C（Sigma），Phalloidin-TRITC(Sigma),a-actinin,desmin单克隆抗体(Sigma)，多克隆抗体cTnT（福州迈新生物公司），基因组DNA试剂盒提取试剂盒（北京天为时代生物公司），RT-PCR试剂盒（Promega）。2 超纯水制备机(MILLI-Q,France)，OLYMPUS相差显微镜(BX51,Japan)，Leica荧光显微镜（DMIRN,Germany），激光共聚焦显微镜(Bio-RadRadiance2100,USA)，全自动酶标仪(TECAN,Austrial)，流式细胞仪（B-D,USA），凝胶成像分析仪（天能，上海）方法2.1小鼠胚胎干细胞ES-D3的培养复苏ES-D3接种于预先经10mg/ml丝裂霉素C处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞（primarymouseembryonicfibroblast,PMEF）饲养层，加入含15%胎牛血清(FBS)、0.1mmol/Lb-巯基乙醇(b-Me)，1%非必需氨基酸及103U/ml白血病抑制因子（LIF）的H-DMEM培养基维持培养。为保持其理想的未分化状态，当ES-D3集落达到60%-70%融合时，即需传代。2.2MTT法测定DMSO细胞毒性对数生长期的ES-D3细胞（1´105cells/ml）接种于96孔板，实验组由高到低浓度加入DMSO溶液（20%0.08%），对照组则加入等体积H-DEMM培养基。孵育48h,加入MTT溶液后置全自动酶标仪测定每孔OD495nm值，并计算平均生长率。计算公式：生长率（%）=实验组OD值/对照组OD值´100%，按药物浓度-生长率绘制剂量效应曲线（Bliss软件统计分析）。2.3ES-D3向心肌细胞诱导分化及鉴定.1ES-D3悬浮培养10,11取对数生长期ES-D3，经0.25%胰酶消化后制备为细胞悬滴（300-400cells/40ml），置于底面平皿内装有少量PBS缓冲液的100mm培养皿盖内面悬滴培养48h，此时肉眼可见大小均一的拟胚体(embryoidbodies,EBs)形成。小心吸取EBs转入100mm细菌级培养皿内，更换含不同浓度DMSO(0.5%，0.8%，1%，2%)的分化培养基，继续悬浮培养5d,每隔2d换液。.2EBs贴壁诱导培养悬浮培养共7d后，分别将EBs接种至24孔培养板(1个/孔，内有0.1%gelatin预处理的盖玻片)，先加少量培养基孵育3h-5h以利于EBs贴附于盖玻片，然后再添加适量条件培养基继续贴壁培养，定期换液。每日观察EBs分化情况，以捕获出现跳动的心肌细胞合胞体的最初时间及数量。2.4ES源心肌细胞的鉴定.1免疫组织化学的鉴定EBs贴壁培养20d后，部分终止培养。收集出现跳动区域的多个EBs，10%甲醛溶液固定，逐级脱水后石蜡包埋制备为石蜡切片。其余步骤按照石蜡切片SABC免疫组化试剂盒说明书操作。一抗分别为desmin、cTnT，二抗为生物素化羊抗鼠IgG。制备激光共聚焦样品需要首先在镜下挑取收缩的细胞克隆，经0.1%collagenaseII消化后接种至0.1%gelatin包被的盖玻片，继续培养2-3d，冷丙酮固定。a-actinin检测同免疫组化操作(IgG-FITC)，同时Phalloidin-TRITC标记a-actin，Hoechst33258复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察ES源心肌细胞肌小节的发育情况，同时以新生小鼠心肌细胞为对照。.2RT-PCR检测心肌转录因子GATA-4及心室肌基因MLC-2vmRNA的表达Trizol裂解各组细胞后进行总RNA的提取，具体操作参照Trizol试剂说明书，终样品测定OD260/280确定RNA质量。反转录反应总体系20ml，RNA样品各1mg，反应条件为：422h995min，终产物cDNA于-70保存。PCR反应总体系50ml，95预变性5min，具体引物序列（北京博润基因公司合成）及循环条件见Table1。循环结束时72延伸10min。取8mlPCR产物于2%agrose凝胶电泳，数码拍照。成像系统通过以b-actin为内参，分别进行半定量分析。2.5DMSO诱导ES-D3细胞凋亡的检测诱导浓度DMSO（1%）加入ES-D3分化培养基中（即分化培养第d开始），分别于处理后24h，48h，72h收集细胞样品进行观察分析，同时以自发性分化的ES-D3细胞为对照组（分化培养第d）。.1细胞凋亡的形态学鉴定经处理的各组细胞于倒置显微镜下观察细胞凋亡时细胞核DNA的浓缩及核碎裂情况，Leica自动图像采集系统保留图像。.2DNA电泳检测ES-D3凋亡“ladder”分别收集ES-D3细胞（约1×107），PBS洗涤次，酶氯仿异戊醇法提取基因组DNA，具体参照试剂盒说明书。测定OD260/280，取等量DNA于2%agrose电泳（含荧光染料Goldview），数码拍照图像。.3流式细胞光度术(flowcytometer,FCM)分析ES-D3凋亡收集各组细胞(约1´106)，PBS缓冲液清洗后重悬于含3%FBS，70%无水乙醇的PBS缓冲液中固定保存。上机检测前经3000rpm´1min收集细胞，加入0.2mlRNAaseA（500mg/ml），3730min，再加入0.3mlPI(100mg/ml)置暗处染色20min后上机检测。.4RT-PCR检测凋亡相关基因p53，bcl-2mRNA的表达总RNA的提取以及RT-PCR具体操作步骤同前。引物序列（北京博润基因公司合成）及循环条件见Table1。取8mlPCR产物凝胶电泳，数码拍照。alphaImager2000进行半定量分析方法同前。表1RT-PCR引物序列GenesPrimersequenceTm（）CyclesLength(bp)12MLC-2v5-gccaagaagcggatagaagg-3'5-ctgtggttcagggctcagtc-3483550013GATA-45-ctgtcatctcacgggca-3'5-ccaagtccgagcaggaattt-34930275p535-ctgtcatctcacgggca-3'5-ccaagtccgagcaggaattt-35030479bcl-25-ctgtcatctcacgggca-3'5-ccaagtccgagcaggaattt-34935304b-actin5-atggatgacgatatcgctg-35-atgaggtagtctgctaggt-348285683 统计学处理本实验所涉及的实验数据均用±s表示，两组间数据比较均采用studentt检验分析。三.结果1DMSO诱导ES-D3分化为心肌细胞1.1MTT方法检测DMSO细胞毒性由剂量-效应曲线（图1）可确定：DMSO的非细胞毒性剂量为.3%（生长率>95%），低毒剂量为%（生长率70-80%），故选择其低毒剂量为诱导分化的最大参考剂量。图1.DMSO对ES-D3的细胞毒性曲线1.2ES-D3的诱导分化及ES源心肌细胞的鉴定.1DMSO对ES-D3细胞的诱导分化效应诱导分化至第9d（贴壁诱导第2d），即可在相差显微镜下观察到跳动的心肌合胞体，其初始收缩频率为47-60beats/min，2-3天后增至80-102beast/min。维持培养过程中细胞体积逐渐增加，且观察到心肌细胞彼此相连成条索状规律收缩。细胞克隆可维持跳动最长达70d。本实验设计不同浓度DMSO条件培养基，以摸索其最佳诱导应用剂量。结果表明：与不加任何诱导剂的对照组比较，1%DMSO能显著提高ES-D3向心肌细胞的诱导分化率(p<0.01)，其最高可达96.7%，且该诱导作用具有一定的剂量依赖性。但当DMSO浓度达到2%时，其对于ES-D3的细胞毒性已明显表现出来，培养基中可见大量死亡细胞。具体见Table2：表2不同浓度DMSO对ES-D3分化为心肌细胞的影响DMSO浓度(%)接种Ebs(个)跳动EBs(个)跳动分化百分率(%)0402.0±1.05.00.54014.0±3.6*35.00.84028.3±4.0*70.81.04038.7±1.596.72.0408.3±3.1#20.8分别与对照组比较：p<0.01,*p<0.01，#p<0.01，*p>0.05,(±s,n=3).2ES源心肌细胞的鉴定.1免疫组化检测心肌蛋白的表达及电镜观察源于ES-D3的跳动细胞克隆均不同程度的表达心肌蛋白desmin，cTnT。激光共聚焦图像同时显示心肌a-actin和a-actinin（+），肌小节结构发育成熟，与阳性对照正常新生小鼠心肌细胞无明显区别（图2，图3）。cba图2由ES-D3分化而来的心肌细胞表达心肌蛋白desmin(a)和cTnT(b)，（c）为PBS代替一抗的阴性对照（石蜡切片免疫组化DAB染色，100´）cba图3.1%DMSO诱导ES-D3分化的心肌细胞表达心肌a-acitin和a-acitinin的免疫荧光检测(激光共聚焦显微镜，红色代表a-acitin，绿色代表a-acitinin，hoechst33258复染细胞核，1000´).2RT-PCR检测GATA-4，MLC-2vmRNA的表达RT-PCR产物的电泳结果见图4，可见自发性分化的ES-D3细胞在分化第6d开始少量表达心肌转录因子GATA-4；而经1%DMSO作用24h后，即诱导分化第4天，即可检测到GATA-4mRNA的表达，且伴随作用时间的延长（48h，72h），其表达量不断增加。检测经诱导分化至第20天的RT-PCR产物，其心室特异性基因肌球蛋白轻链MLC-2vmRNA表达（+）。2 DMSO诱导部分ES-D3细胞凋亡2.1ES-D3细胞凋亡的形态学改变及特征性DNA“ladder”ES-D3细胞经DMSO诱导作用24h后，在倒置显微镜下可观察到部分细胞皱缩变圆，体积缩小，随着作用时间的延长，细胞表面逐渐凸起小膜泡，细胞核浓缩边集，不断脱落悬浮于培养集中。提取不同时间的细胞基因组DNA，通过agrose电泳显示以180-200bp为单位的DNA“ladder”。随着DMSO作用时间的延长，该凋亡效应不断增强。图5.(a)1%DMSO诱导ES-D3细胞在分化过程中表达心肌细胞转录因子GATA-4。1:DL2000marker(TaKaRa);lane，2:阴性对照（EBsd6，0%DMSO），3,4,5分别为EBsd4,d5,d6(1%DMSO).-actin为内参照基因。(b)AlphaImager2002软件对RT-PCR结果的半定量分析(*p<0.01,*p<0.05)。(b)为1%DMSO诱导部分ES-D3细胞表达心室肌细胞的特异性基因MLC-2v,1,3为内参照基因-actin，2为自发性分化的阴性对照组，4为1%DMSO诱导组。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp54321GATA-4275bp(a)54321-actin568bp(b)*12345-actin568bpMLC-2v500bp(c)87654321300bp图6-1.1%DMSO作用72h后部分ES-D3细胞悬浮于培养集中，形态皱缩变圆，细胞核浓缩边集。图6-2.DMSO作用后部分ES-D3细胞发生凋亡的DNA“ladder”（1为自发性分化第6天的阴性对照组；2，4，6分别为1%DMSO作用24h，48h，72h；3，5，7分别为2%DMSO作用24h，48h，72h;8位100bpmarker.FCM定量检测ES-D3细胞凋亡采用FCM及其所携带软件计算细胞凋亡率，结果表明：在自发性分化的过程中（分化培养第d）即有少量细胞发生凋亡，其调亡率为1.94%；但经1%DMSO作用不同时间后，其细胞凋亡率显著增加（图7，*p<0.01,n=3），由此表明DMSO对细胞的促凋亡效应。2.3RT-PCR检测凋亡相关基因p53，bcl-2mRNA的表达ES-D3细胞经DMSO作用后，凋亡相关基因表达水平上调，伴随作用时间的延长，其表达量不断增加；而bcl-2mRNA的表达一直处于较低水平，过程中未见显著改变（图9）Apoptosis:1.94%±0.22%Apoptosis:1.76%±0.24%*Apoptosis:7.32%±0.96%*Apoptosis:14.87%±1.13%图7.FCM定量检测1%DMSO作用不同时间后部分细胞ES-D3发生凋亡的亚二倍体峰。（R-2，R-3，R-4分别为1%DMSO作用24h，48h，72h，自发性分化第6天为对照组）2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp54321Figure9.图1%DMSO作用不同时间后，ES-D3细胞p53及bcl-2mRAN表达变化（3，4，5分别为1%DMSO作用24h，48h，72h；2为自发性分化第6天的阴性对照组；1为DL2000marker。(c)AlphaImager2002软件对RT-PCR结果的半定量分析(*p<0.01,*p<0.05l).p53479bp(a)54321Bcl-2304bp(b)54321-actin568bp*(c)四.讨论胚胎干细胞ES-D3来源于小鼠4d胎龄囊胚的内细胞团，因其具有分化全能性和无限增殖的能力而在干细胞研究中广泛应用6，7。本实验基于前人的研究工作，以化学诱导剂DMSO作用于ES-D3细胞，旨在摸索其最佳诱导条件以标准化获得ES源心肌细胞的方法。结果表明：以自发性分化的阴性对照组比较，DMSO（分化第3d始加入）能够以剂量依赖的方式显著促进ES-D3细胞向心肌细胞的分化。其最佳诱导剂量为1%，诱导分化率最高可达96.7%，且该方法具有相当理想的可重复性。在此基础上，我们还分别利用免疫组织化学技术和RT-PCR方法对跳动的细胞克隆进行了蛋白表达及基因水平的鉴定。结果表明：这些细胞克隆均可不同程度的表达多种心肌蛋白，肌球蛋白轻链MLC-2vmRNA表达阳性。在胚胎发育过程中，基因MLC-2v最早表达于胚胎第8d心管的心室肌细胞，其心室肌特异性远高于肌球蛋白重链基因（MHC），因此成为心肌发育过程中的重要分子标志之一14。由此我们可以认为：这些细胞克隆均为由ES-D3分化而来的心肌细胞；且激光共聚焦图像提示：这些ES源心肌细胞的肌小节结构已经发育得相当成熟，几近于阳性对照新生鼠心肌细胞的结构15。诸多因素可以影响ES细胞向心肌细胞的诱导分化率及分化成熟程度。Wobus等16认为：包括：细胞种类及未分化状态；EB形成的质量、贴壁时间及种植密度；所选用的培养基及诱导剂的添加等。本研究在诱导分化过程中对上述因素分别加以标定，使得应用1%DMSO显著提高了ES向心肌细胞的分化率。DMSO是一种非质子型溶剂，因其对多种物质及化学反应都具有特殊的溶媒效应而广泛应用于生物学及生物化学研究，但DMSO本身的生物学效应至今仍未完全阐明。20世纪70年代，人们先后发现DMSO对白血病细胞株K562、HL60等具有不同程度的诱导分化和促进凋亡效应。McBurney等4（1982年）以胚胎瘤细胞系P19为研究模型，首次证明DMSO能够促进ES细胞向包括心肌细胞在内的中胚层发育，但对其相关机制未做深入探讨。此后的研究对机制方面的报道也较少，且所用细胞模型及具体诱导方法不一。本实验在标准化DMSO诱导应用的剂量和时间流程基础上，还利用RT-PCR方法初步探讨了DMSO诱导分化与心肌转录因子GATA-4的相关性。GATA-4是一种心肌特异性的锌指结构转录因子，在心脏发育早期即有表达且持续至整个心脏发育过程。研究表明：GATA-4是多种心肌特异性基因的转录激活剂及关键调节子。Grepin等17利用反义核苷酸抑制GATA-4的表达，发现P19细胞向心肌细胞的发育被阻断且有部分细胞走向凋亡。本研究结果表明：ES-D3自发性分化的第6d开始表达转录因子GATA-4，该结论与国外报道一致18。而经1%DMSO作用后，GATA-4的表达提前至第4d，且其表达水平随着DMSO作用时间的延长而不断增加。由此提示：DMSO促进ES-D3细胞向心肌细胞方向分化可能是首先作用于GATA-4,使该基因提前开放表达的同时上调其表达水平，从而实现其促进心肌细胞分化的作用。而目前国内外对此并无详细报道。但关于DMSO究竟是如何作用于GATA-4；GATA-4的表达与心肌细胞的分化这一时相过程又有怎样的分子生物事件发生-这些问题目前尚未明确。此外，上述我们已经提及：在细胞生物学研究中，DMSO不但可以促进细胞分化，而且还具有诱导肿瘤细胞凋亡的效应。但对于DMSO是否在促进ES-D3细胞分化的同时也能够诱导部分细胞走向凋亡？对此，国内外尚无报道。而我们在上述ES-D3细胞诱导分化的研究过程中，每次换液时都发现培养基中存在一定量的悬浮死亡细胞。由此我们想及：是否DMSO在诱导ES-D3部分细胞走向心肌分化的同时也使部分细胞走向了凋亡？检测结果证实了我们上述的假设：1%DMSO作用24h，在分化的同时即有部分细胞发生典型的凋亡形态学改变，呈现DNA“ladder”；FCM检测其凋亡率为1.76%，且该效应具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。由此初步证明DMSO能够诱导部分ES-D3细胞产生凋亡。素有“万能溶媒”之称的DMSO自介入细胞生物学领域以来，其复杂的生物学效应正逐步为国内外学者所认识。既往研究表明：对于不同的细胞株，DMSO具有不同的生物学作用。除了诱导分化19、抵抗凋亡刺激信号，还可导致细胞周期停滞并发生细胞凋亡6，7。但相关机制的探讨却是众说纷纭：DMSO能功能修饰p53或上调bcl-2表达水平以诱导永生化细胞走向凋亡；也可通过CSF-1干扰自分泌生存环诱导巨噬细胞系发生凋亡；而在U937细胞系中，DMSO诱导凋亡可能与不确定的某种酪氨酸激酶有关20；在RPMI-8402胸腺淋巴瘤细胞系所诱导可因PKC的激活而增强。本研究证明：1%DMSO在促进ES-D3细胞分化的同时也能够诱导部分细胞产生凋亡，而后者与凋亡相关基因p53表达水平存在一定的相关性，而与抗凋亡基因bcl-2的表达无明显相关。此外，我们近期的免疫组化结果表明：该过程中Fas，Fas-L，BCL-2蛋白均低水平表达，但P53及BAX蛋白呈现强阳性（本文未提供，尚在整理中）。提示P53及BAX可能在蛋白及基因水平参与了由DMSO引发的胚胎干细胞凋亡途径。综上，我们知道，在组织、器官乃至整个胚胎有机体发育的过程中，细胞增殖、分化及凋亡等生物学现象组成一个复杂的动态平衡系统。它们之间的对立与统一才构成完整的生命运动。我们的研究发现ES-D3在自发性分化的过程中也伴随着凋亡现象的发生。这不但进一步为上述结论提供了有力的论据，而且也充分说明ES细胞是模拟胚胎体内发育过程的理想体外模型。此外，我们还证明：DMSO不但能够诱导ES-D3向心肌细胞的分化，而且还能促进部分细胞走向凋亡。如果从发育生物学的宏观角度来解释，这是生命运动辩证统一的体现，是对生命现象的一种诠释。当然，对于这其中复杂的信号转导机制的阐明尚需大量深入的研究。参考文献1. 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