第四章目的基因的转化及其原理课件.ppt

第四章目的基因的转化及其原理第1页，此课件共53页哦植物基因转化系统植物基因转化系统载体转化系统（载体转化系统（Ti质粒转化载体质粒转化载体，Ri质粒转化载体）质粒转化载体）原生质体原生质体DNA直接导入转化系统直接导入转化系统基因枪基因枪DNA导入转化系统导入转化系统花粉粒介导转化系统花粉粒介导转化系统第2页，此课件共53页哦一、植物基因工程载体命名规则及种类一、植物基因工程载体命名规则及种类1、植物基因工程载体命名规则：、植物基因工程载体命名规则：(1)pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌农杆菌的质粒类型根癌农杆菌的质粒类型（Agrobacterium tumefaciens）pRiT37/pArT37发根农杆菌的质粒类型发根农杆菌的质粒类型（Agrobacterium rhizogenes）第3页，此课件共53页哦（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，如：如：leu（亮氨酸基因位点）（亮氨酸基因位点）基因表基因表现现型用正体表示，如型用正体表示，如Leu（3）基因中任何位点）基因中任何位点发发生突生突变则变则在在该该基因符号后加基因符号后加该该位位点斜体大写字母，如亮氨酸点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分位点分别为别为突突变变型或型或缺陷型，表示缺陷型，表示为为：leuA、leuB(4)抗性和敏感性分抗性和敏感性分别别用用R或或r，S或或s表示表示 第4页，此课件共53页哦2 2、植物基因工程载体的种类及特性、植物基因工程载体的种类及特性植物基因工植物基因工程载体程载体克隆载体克隆载体中间载体中间载体中间克隆载体中间克隆载体中间表达载体中间表达载体卸甲载体卸甲载体onc-onc+转化载体转化载体中间黏粒载体中间黏粒载体质粒质粒/黏粒载体黏粒载体基因标记载体基因标记载体一元转化载体一元转化载体（顺式载体）（顺式载体）双元转化载体双元转化载体（反式式载体）（反式式载体）共整合载体共整合载体SEV（拼接末端载体；（拼接末端载体；split-endvector）第5页，此课件共53页哦二、根癌农杆菌二、根癌农杆菌TiTi质粒的结构与功能质粒的结构与功能 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能质粒的遗传特性、结构及功能2、T-DNA的基因结构与功能的基因结构与功能3、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能 第6页，此课件共53页哦一、一、TiTi质粒的遗传特性、结构及功能质粒的遗传特性、结构及功能1.Ti质质粒的粒的遗传遗传特性及特性及类类型型Ti质质粒粒是是根根癌癌农农杆杆菌菌染染色色体体外外的的遗遗传传物物质质，为为双双股股共共价价闭闭合合的的环环状状DNA分子。分子。根据其根据其诱导诱导的植物冠的植物冠瘿瘿瘤中所合成的冠瘤中所合成的冠瘿瘿碱种碱种类类不同，不同，Ti质质粒可以被分成粒可以被分成四种四种类类型：型：章章鱼鱼碱型碱型(octopine)胭脂碱型胭脂碱型(nopaline)农农杆碱型（杆碱型（agropine）农农杆菌素碱型（杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型）或称琥珀碱型(succinamopine)第7页，此课件共53页哦图图3-1章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒基因图。质粒基因图。章鱼碱基因章鱼碱基因T-DNA区区结合转移区结合转移区冠瘿碱代谢冠瘿碱代谢复制起始区复制起始区毒力区毒力区生长素基因生长素基因细胞分裂素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成冠瘿碱合成第8页，此课件共53页哦2.Ti质粒的功能区域质粒的功能区域Ti质粒可分为四个区：质粒可分为四个区：（1）T-DNA区（区（transferred-DNAregions）：）：T-DNA是是农农杆杆菌菌侵侵染染植植物物细细胞胞时时，从从Ti质质粒粒上上切切割割下下来来转转移移到到植植物物细细胞胞的的一一段段DNA，称称为为转转移移DNA。该该DNA片片段段上上的的基基因因与肿瘤的形成有关。与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（区（virulenceregion）该该区区段段上上的的基基因因能能激激活活T-DNA转转移移，使使农农杆杆菌菌表表现现出出毒毒性性，故故称称之之为为毒毒区区。T-DNA区区与与Vir区区在在质质粒粒DNA上上彼彼此此相相邻邻，约约占占Ti质质粒粒DNA的三分之一。的三分之一。第9页，此课件共53页哦（3）Con区（区（regionsencodingconjugations）该该区区段段上上存存在在着着与与细细菌菌间间接接合合转转移移的的有有关关基基因因（tra），调调控控Ti质质粒粒在在农农杆杆菌菌之之间间的的转转移移。冠冠瘿瘿碱碱能能激激活活tra基基因因，诱诱导导Ti质质粒粒转转移移，因因此此称称之之为为接接合合转移编码区。转移编码区。（4）Ori区（区（originofreplication）该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。质粒的自我复制，故称之为复制起始区。第10页，此课件共53页哦3.Ti质粒的生物学功能质粒的生物学功能Ti质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下7个方面个方面:参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。）和一些细胞分裂素的活动。诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。决定寄主菌株的植物寄主范围。决定寄主菌株的植物寄主范围。有有的的Ti质质粒粒能能够够抑抑制制某某些些根根瘤瘤土土壤壤杆杆菌菌噬噬菌菌体体生生长长与与发发育育，即即具具有有对对噬噬菌菌体体的的“排排外外性性”。第11页，此课件共53页哦表表4-1Ti质粒放入部分基因及其功能质粒放入部分基因及其功能基因缩写基因缩写表型及功能表型及功能在基因图上的位置（在基因图上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌体排斥噬菌体API111-11310-12agr对对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感质粒编码的农杆菌素敏感138-141arc分解精氨酸分解精氨酸4-59-10agc分解农杆菌分解农杆菌54-57noc分解胭脂碱分解胭脂碱18-20nos合成胭脂碱合成胭脂碱0-1occ分解章鱼碱分解章鱼碱39-41ocs合成章鱼碱合成章鱼碱0-1ori复制起点复制起点33-3590-95roi（tmr）抑制长根抑制长根206-207190-192shi（tms）抑制长芽抑制长芽202-203187-188traTi质粒转移质粒转移121-12321-30inc质粒不相容性质粒不相容性33-3590-95第12页，此课件共53页哦二、二、T-DNA的基因结构与功能的基因结构与功能1.T-DNA的发现的发现 Chilton等等人人于于1982发发现现。(MDCHILTON,DTEPFER,A PETIT,D CHANTAL,CD FRANCINE,TJACQUES.Agrobacterium rhizogenesinserts T-DNAinto the genomes of the host plant root cells.Nature,1982(295):432-434）研研究究证证明明，这这部部分分DNA是是从从质质粒粒DNA上上切切割割后后，转转移移到到肿瘤细胞，故称之为转移肿瘤细胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。）。第13页，此课件共53页哦GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT图图3-2Ti质粒上几个重要区域及其序列质粒上几个重要区域及其序列LB：左边界序列；：左边界序列；RB：右边界序列：右边界序列第14页，此课件共53页哦2.T-DNA的结构特点的结构特点lTi质粒质粒T-DNA区的长度约为区的长度约为23kb；l lT-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；中；l 在在T-DNA的的5端端和和3端端都都有有真真核核表表达达信信号号。如如TATAbox、AATAAbox及及polyA等。等。第15页，此课件共53页哦T-DNA的两端左右边界各为的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列的重复序列，即边界序列（bordersequence），分别称之为左边界（），分别称之为左边界（BL或或TL）和右边界）和右边界（BR或或TR）。该该25bp边界序列属保守序列边界序列属保守序列,但通常右边界（但通常右边界（TR）序列更为保守，）序列更为保守，左边界左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心部分是序列在某些情况下有所变化。其核心部分是14bp，可分为可分为10bp(CACGATATAT)及及4bp(GTAA)两部分两部分,是完全保是完全保守的。守的。致瘤性：右边界作用大于左边界致瘤性：右边界作用大于左边界第16页，此课件共53页哦3.T-DNA上的编码基因及功能上的编码基因及功能T-DNA的转录有下述共同点：的转录有下述共同点：T-DNA的两条链都是有意义链的两条链都是有意义链,即都能被转录。即都能被转录。T-DNA上每个基因都有各自的启动子。上每个基因都有各自的启动子。基因的转录由植物细胞基因的转录由植物细胞RNA聚合酶聚合酶完成。完成。T-DNA具典型的真核生物具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，合成起始和终止的调节信号，T-DNA的转录机理可能与真核生物相同。的转录机理可能与真核生物相同。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。第17页，此课件共53页哦TLTRTCiaaH iaaMauxiptcytocsfrsmasags图图4-3章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒的质粒的T-DNA编码基因结构编码基因结构iaaH：吲哚吲哚乙酸胺水解乙酸胺水解酶酶；iaaM：色氨酸：色氨酸单单加氧加氧酶酶；aux：生：生长长素；素；ipt:异戊异戊烯烯基基转转移移酶酶；cyt：细细胞分裂素；胞分裂素；frs：琥珀碱合成：琥珀碱合成酶酶；mas：甘露碱合成：甘露碱合成酶酶；ags：农农杆碱合成杆碱合成酶酶第18页，此课件共53页哦T-DNA区基因的功能区基因的功能第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，如如:frs、mas、ags第二类是致瘤基因；包括生长素基因第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分和细胞分裂素基因裂素基因cyt第19页，此课件共53页哦三、三、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能1、Vir区操纵子的基因结构：区操纵子的基因结构：农杆菌致瘤所必须的；Vir区仅位于T区DNA左侧；两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。HABGCDEFtzsABGCDE章鱼碱章鱼碱胭脂碱胭脂碱图图 4-5章鱼碱型和胭脂碱型章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的质粒的Vir区编码基因结构区编码基因结构第20页，此课件共53页哦表表4-4章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒质粒vir基因基本结构与功能基因基本结构与功能遗传座位遗传座位分子量分子量（kb）基因数基因数表达方式表达方式功能功能virA2.81组成型组成型帮助接受植物信号分子启动毒性区表达帮助接受植物信号分子启动毒性区表达virG1.01组成型组成型转录活化转录活化virC1.52诱导型诱导型T-DNA加工加工virD4.54诱导型诱导型T-DNA加工加工virE2.22诱导型诱导型T-DNA加工加工virB9.511诱导型诱导型膜转运蛋白膜转运蛋白virF1.01诱导型诱导型T-DNA转运转运virH94.22诱导型诱导型细胞色素细胞色素P-450单氧化酶单氧化酶第21页，此课件共53页哦三、农杆菌三、农杆菌Ti质粒基因转化机理质粒基因转化机理已已知知农农杆杆菌菌附附着着到到植植物物细细胞胞后后，只只留留在在细细胞胞间间隙隙中中。T-DNA首首先先在在细细菌菌中中被被加加工工、剪剪切切、复复制制，然然后后转转入入植植物物细细胞胞，并并非非整整个个Ti质质粒粒都都进进入入植植物物细细胞胞。该该基因转化过程是一个复杂的遗传工程。基因转化过程是一个复杂的遗传工程。第22页，此课件共53页哦1、T-DNA的加工及转移的加工及转移第23页，此课件共53页哦四、四、T链整合植物基因组的分子机理链整合植物基因组的分子机理1、整合位点及其特性、整合位点及其特性T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何一条染色体在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何一条染色体插入位点常有以下特点：插入位点常有以下特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；优先整合到转录活跃的植物基因位点；T-DNA与植物与植物DNA连接处富含连接处富含A，T碱基对；碱基对；植植物物DNA上上的的插插入入靶靶位位点点与与T-DNA边边界界序序列列有有一一定定程程度度的的同同源源性。性。第24页，此课件共53页哦2.T-DNA的整合机理的整合机理双链断裂修复模型（双链断裂修复模型（DSBRmodel）单链缺口修复模型（单链缺口修复模型（SSGRmodel）第25页，此课件共53页哦Sci，IF：9.205第26页，此课件共53页哦第27页，此课件共53页哦Fig4-6IllegitimaterecombinationmodelsforT-DNAintegration.(a)Double-strandbreak-repair(DSBR)andsingle-strand gap-repair(SSGR)models equally explain the integration events leading to T-DNA insertion 621-x34.AsoutlinedintheDiscussion,theDSBRmodelpredictsadouble-strandbreakinthetarget.UnwoundorexonucleaseprocessedendsoftheT-DNAandofthetargetannealbypartialhomologouspairing.Single-strandoverhangsareremovedbyendo-orexonucleasedigestion;theendsarerepairedandligated.TheSSGRmodelpredictsanickinthetargetthatisconvertedtoagapbya5-3exonuclease.TheT-strandinvadesthegapandasynapsisisformedbypartialpairingbetweenT-DNAendsandtarget.TheoverhangsoftheT-DNAareremovedandtheT-strandisligatedtothetarget.AnickintroducedintothesecondstrandofthetargetinitiatesrepairsynthesisofthesecondstrandoftheT-DNA.(b)ApplicationoftheSSGRmodelforT-DNAinsertion621-36.Asproposedinthemodelofinsertion621-x34,repairattheendsofinvadingT-strandmayoccurbeforeligation.AbsenceofaninternalCAGTT-DNAsequencefromtherightjunctionofinsert621-36suggeststhatcopyingofthetargetplantDNAledtoalterationoftherightT-DNAendduringintegration.Mismatchrepairmaysimilarlyexplaintheobserveddeletion.(c)AmodifiedversionofSSGRmodelexplainingpossibleinvolvementofVirD2proteininrecombinationeventsthatresultedinT-DNAinsertions621-37andN6H-cs4.T-DNAinvasiondepictedinthemodelinvolvesVirD2-mediatedrecognitionofanick(orgap)thatisfollowedbyligationofthe5endoftheT-strandtothetargetDNA.The3endoftheT-strandmovesalongthetarget,whiletheunwoundtargetDNAstrandisremovedbyexonucleolyticdigestion.Atthepositionwherethe3endoftheT-strandisstabilizedbybase-pairing,theT-strandisligatedtothetarget.Atthesamepositionanickisintroducedinthesecondstrandofthetargetthatdefinestheleftbreak-pointoftargetdeletionandinitiatesthereplicationoftheT-strand.Symbolsusedforpresentationofputativerecombinationeventsareexplainedunderneaththemodels.第28页，此课件共53页哦3.T-DNA整合的遗传效应整合的遗传效应T-DNA插入的遗传特性：插入的遗传特性：(1)T-DNA的的插插入入不不引引起起植植物物DNA大大的的重重排排。但但多多数数插插入入会会导导致致靶靶位位点处小的缺失，缺失多至点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。个核苷酸。(2)另另一一个个常常见见的的结结果果是是，在在T-DNA植植物物DNA连连接接处处，会会有有几几个个至至33个个核核苷苷酸酸的的“填填充充”DNA（FillerDNA）存存在在，这这些些“填填充充”DNA的序列与靠近连接处的植物的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。序列相似。(3)在在植植物物靶靶位位处处不不要要求求有有特特异异的的序序列列，但但若若在在T-DNA两两端端和和植植物物靶靶位处之间有一段短序列（位处之间有一段短序列（510b）同源，则可以在整合中起作用。）同源，则可以在整合中起作用。第29页，此课件共53页哦五、农杆菌五、农杆菌TiTi质粒的改造及载体构建质粒的改造及载体构建 1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建2、中间载体、中间载体/表达载体的构建表达载体的构建3、植物基因转化载体系统的构建、植物基因转化载体系统的构建第30页，此课件共53页哦1 1、TiTi质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建野生型野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：Ti质质粒分子量过大，一般在粒分子量过大，一般在160240kb，基因工程中难以操作；，基因工程中难以操作；大型的野生大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，质粒上分布着各种限制酶的多个切点，.难以找到可难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野重组技术直接向野生型生型Ti质粒导入外源基因；质粒导入外源基因；T-DNA区内含有许多编码基因，其中区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰宿主植物中基因产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10左右）左右）,因此，通过因此，通过Ti质粒的体质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的中只有单一切点的载体；载体；Ti质粒上还存在一些对于质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。转移不起任何作用的基因。第31页，此课件共53页哦为为了了使使Ti质质粒粒成成为为有有效效的的外外源源基基因因导导入入载载体体，必必须须对对野野生生型型Ti质质粒粒进进行行一一番番科科学学的的改改造造。十十分分幸幸运运的的是是，大大肠肠杆杆菌菌具具有有能能与与农农杆杆菌菌高高效效地地接接合合转转移移的的特特性性。因因此此，科科学学家家们们可可以以先先将将T-DNA片片段段克克隆隆到到大大肠肠杆杆菌菌的的质质粒粒中中，并并插插入入外外源源基基因因，最最后后通通过过接接合合转转移移把把外外源源基基因因引引入入到到农农杆杆茵茵的的Ti质质粒粒上上，这这是是一一种种把把预预先先进进行行亚亚克克隆隆、切切除除、插插入入或或置置换换的的T-DNA引引入入Ti质质粒粒的的有有效效方方法法。带带有有重重组组T-DNA的的大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒衍衍生生载载体体称称为为”中中间间载载体体”（intermediatevector），而而接接受受中中间间载载体体的的Ti质质粒粒则则称称为为受受 体体 Ti质质粒粒（acceptor Ti p1asmid），一一 般般 是是 卸卸 甲甲 载载 体体（disarmedvector）。）。第32页，此课件共53页哦2、onc-卸甲载体卸甲载体所所谓谓卸卸甲甲载载体体就就是是无无毒毒的的（non-oncogenic）Ti质质粒粒载载体体。因因为为利利用用野野生生型型的的Ti质质粒粒作作载载体体时时，影影响响植植株株再再生生的的直直接接原原因因是是T-DNA中中onc基基因因的的致致瘤瘤作作用用。因因此此，为为了了使使野野生生型型的的Ti质质粒粒成成为为基基因因转转化化的的载载体体，必必须须切切除除T-DNA上上的的onc基基因因，即即“解解除除”其其“武武装装”,构构建建成成所所谓谓“卸卸甲甲”或或称称“缴缴械械”载载体体（disarmedvector）。在在这这种种onc-载载体体中中，已已经经缺缺失失的的T-DNA部部位位被被大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种常常用用的的质质粒粒pBR322取取代代。这这样样任任何何适适合合于于克克隆隆在在 pBR322质质粒粒中中的的外外源源DNA片片段段，都都可可以以通通过过与与 pBR322质质粒粒DNA的同源重组，而被共整合到的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。质粒载体上。第33页，此课件共53页哦onc+卸甲载体卸甲载体对对于于研研究究外外源源基基因因在在转转基基因因植植株株中中的的表表达达，以以及及对对于于以以改改良良农农作作物物为为目目的的的的植植物物基基因因工工程程而而言言，onc-体体系系是是最最有有用用的的。不不过过，人人们们可可能能还还要要设设计计一一些些特特殊殊的的实实验验来来研研究究外外源源基基因因在在冠冠瘿瘿瘤瘤组组织织中中的的表表达达问问题题。在在这这种种情情况况下下，使使用用onc+菌菌株株载载体体则则比比较较合合适适。由由于于冠冠瘿瘿瘤瘤组组织织具具有有不不依依赖赖于于激激素素的的表表型型特特征征，所所以以这这种种载载体体系系统统的的优优点点在在于于它它可可以以快快速速地地增增生生冠冠瘿瘿组组织织，比比较较快快速速而而容容易得到转化体。易得到转化体。第34页，此课件共53页哦 2 2、中间载体的构建、中间载体的构建（1）中间载体的基本结构与特点）中间载体的基本结构与特点为为解解决决Ti质质 粒粒 不不 能能 直直 接接 导导 入入 目目 的的 基基 因因 的的 困困 难难，构构 建建 中中 间间 载载 体体（intermediatevector）是是有有效效方方法法之之一一。中中间间载载体体是是一一种种在在一一个个普普通通大大肠肠杆杆菌菌的的克克隆隆载载体体（例例如如pBR322质质粒粒）中中插插入入了了一一段段合合适适的的T-DNA片片段段，而而构构成成的的小小型型质质粒粒。中中间间载载体体通通常常是是多多拷拷贝贝的的E.Coli小小质质粒粒，这这一一点点对对于于通通过过体体外外遗遗传传操操作作导导入入外外源源基基因因是是非非常常必必要要的的。从从结结构构特特点点看看可可分分为为两两类类中中间间载载体体，即即共共整整合合系系统中间载体和双元载体系统中间载体。统中间载体和双元载体系统中间载体。第35页，此课件共53页哦共整合系统中间载体的特征中中间间载载体体必必须须含含有有与与Ti质质粒粒T-DNA区区同同源源的的序序列列，此此外外含含有有pBR的的序序列列，在在其其被被引引入到根癌农杆菌后即可高频地与入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的质粒的T-DNA的同源序列进行重组；的同源序列进行重组；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它它必必须须 有有bom位位点点，在在有有诱诱导导质质粒粒存存在在的的情情况况下下，bom位位点点的的存存在在可可以以使使中中间间载体在不同细菌细胞内进行转移；载体在不同细菌细胞内进行转移；它它应应该该含含有有阳阳性性植植物物选选择择标标记记，以以利利于于转转化化植植物物细细胞胞的的筛筛选选，例例如如新新霉霉素素磷磷酸酸转转移移酶酶(neomycinphosphotransferase,Npt-)基基因因，其其可可赋赋予予转转化化植植物物细细胞胞卡卡那那霉霉素抗性；素抗性；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；无无Ti质粒的边界序列。质粒的边界序列。第36页，此课件共53页哦双元载体系统的中间载体与共整合系统中间载体不同之处是与共整合系统中间载体不同之处是:无同源序列；无同源序列；具有具有LB和和RB;无无Co1E1复制点复制点 第37页，此课件共53页哦（2）中间表达载体）中间表达载体启动子及其它调控序列启动子及其它调控序列转转录录的的调调控控对对真真核核生生物物基基因因表表达达起起着着关关键键性性作作用用。就就真真核核生生物物基基因因表表达达调调控控序序列列而而言言，大大多多数数真真核核生生物物在在转转录录起起始始点点的的5端端上上游游区区第第30至至25bp处处具具有有TATA盒盒，在在70至至80bp处处还还有有CAAT盒盒。在在大大多多数数真真核核生生物物基基因因的的3端端具具有有AATAA序序列列。这这些些5和和3端端的的调调控控序序列列对对真真核核生生物物的的基基因因表表达达起起着着关关键键性性作作用用。Ti质质粒粒虽虽然然来来源源于于农农杆杆菌菌，但但其其Nos、Ocs、Tmr等等基基因因具具有有与与真真核核生生物物启启动动子子类类似似的的TATA盒盒和和CAAT盒盒，均均能能在在植植物物细细胞胞中中表表达达，并并且且无无组组织织特特异异性性。因因此此，它它们们成成为为早早期期构构建建嵌嵌合合基基因因的的启启动动子子，其其中中以以Nos启启动动子（子（pNos）最常用。）最常用。第38页，此课件共53页哦第39页，此课件共53页哦3、植物基因转化载体系统的构建、植物基因转化载体系统的构建（1）一元）一元载载体系体系统统（2）双元）双元载载体系体系统统第40页，此课件共53页哦1一元载体系统的构建这这一一类类载载体体是是中中间间表表达达载载体体与与改改造造后后的的受受体体Ti质质粒粒之之间间，通通过过同同源源重重组组所所产产生生的的一一种种复复合合型型载载体体，通通常常亦亦称称为为共共整整合合载载体体（co-intergratedvecter），又又由由于于该该载载体体的的T-DNA区区与与Ti质质粒粒Vir区区连连锁锁，因因此此又又称称之之为顺式载体（为顺式载体（cis-vector）。）。一元载体的特点是一元载体的特点是:由两个质粒（由两个质粒（E.coli质粒和质粒和Ti质粒）重组而成，质粒）重组而成，分子量较大；分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较相对较低；低；必须用必须用Southern杂交或杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；对大的共整合体质粒进行检测；构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体和构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体和拼接未端载体（拼接未端载体（split-endvector,SEV）。）。第41页，此课件共53页哦（1）共整合载体的构建共整合载体的特点是：共整合载体的特点是：中间表达载体与受体中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；中中间表达载体与受体间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是质粒之间同源序列是pBR322。共整合载体的构建过程共整合载体的构建过程l）中中间间载载体体pLGV1103导导入入农农杆杆菌菌:目目前前通通常常采采用用两两种种方方法法，即即接接合合转转移移法法（conjugative transfer）和三亲杂交转移法。）和三亲杂交转移法。2）中间载体与受体）中间载体与受体Ti质粒的同源重组。质粒的同源重组。3）共整合载体的选择。）共整合载体的选择。第42页，此课件共53页哦共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序共整合转化程序第43页，此课件共53页哦（2）SEV的构建SEV系系统统即即T-DNA边边界界拼拼接接系系统统，亦亦称称拼拼接接末末端端载载体体（sp1it-endvecter,SEV）。它它是是由由Freley等等人人于于1985年年建建立立的的另另一一种种共共整整合合载载体体，也也因因为为它它的的两两个个LIH序序列列在在同同源源重组前分别处于不同质粒上而得名。重组前分别处于不同质粒上而得名。SEV与与pGV3850的差异及构建过程如下述：的差异及构建过程如下述：1）SEV的的受受体体Ti质质粒粒的的T-DNA上上的的致致瘤瘤基基因因（onc）及及TR都都已已被被缺缺失失，T-DNA的的保保留留部部分分被被称称为为“左左边边界界内内部部同同源源区区”（1eftinsidehomcology，LIH）。该该受受体体Ti质质粒粒还保留了还保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的抗性基因。基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的抗性基因。2）SEV中中间间载载体体具具有有一一个个细细菌菌的的抗抗性性基基因因，一一个个植植物物抗抗性性基基因因及及与与受受体体Ti质质粒粒同同源源的的LIH序列及序列及TR。3）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源序列，即可发生同同源序列，即可发生同源重组，形成源重组，形成SEV的共整合载体。的共整合载体。第44页，此课件共53页哦（3）SEV与pGV3850比较两两者者都都是是通通过过受受体体Ti质质粒粒与与中中间间载载体体同同源源重重组组而而形形成成，故故同同属属于于共共整整合的一元载体系统，但它们之间有着一定的差异：合的一元载体系统，但它们之间有着一定的差异：1）它它们们的的受受体体Ti质质粒粒与与中中间间载载体体的的结结构构不不同同。pGV3850的的左左右右边边界界在在一个受体一个受体Ti质粒上，而质粒上，而SEV来自二个质粒，即来自二个质粒，即TR来自中间载体。来自中间载体。2）同同源源序序列列不不同同。pGV3850重重组组的的同同源源序序列列是是pBR322，而而SEV是是LIH。3）SEV是是更更有有效效的的共共整整合合载载体体。由由于于pGV3850共共整整合合载载体体，带带有有大大肠肠杆杆菌菌pBR322序序列列，外外源源基基因因嵌嵌合合在在该该序序列列中中，因因而而转转化化的的植植物物中中也也带带有有重重复复的的pBR322序序列列。此此重重复复序序列列可可能能对对转转化化植植物物中中的的外外源源基基因的稳定性有影响，而因的稳定性有影响，而SEV系统则排除了这种可能。系统则排除了这种可能。第45页，此课件共53页哦2双元载体系统双元载体（binaryvecter）系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（transvecter）.第46页，此课件共53页哦（1）双元载体系统的构建原理双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互补作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点（oriV），而代替了共整合载体中用以重组的同源区，能够在任何农杆菌寄主里自发复制。第47页，此课件共53页哦（4）双元载体的构建将MiniTi质粒转入含有He1perTi质粒根癌农杆菌的途径有两条，一条是直接用纯化的MiniTi质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条是与共整合载体构建一样，采用三亲接合的方式。MiniTi质粒均能以E.coli的pRK2013为辅助质粒，通过三亲杂交而接合转移到含有辅助Ti质粒的农杆菌细胞内。由于E.coli的pRK2013不能在农杆菌中复制最后消失，含有MiniTi质粒和He1perTi质粒的根癌农杆菌可直接用于植物细胞的转化。第48页，此课件共53页哦第49页，此课件共53页哦（5）一元载体系统和双元载体系统的比较双元载体系统与一元载体系统之间有着较大的差异：双元载体系统与一元载体系统之间有着较大的差异：1）双元载体不需要共整合过程，因此系统中的两个质粒不必含有同源序列。）双元载体不需要共整合过程，因此系统中的两个质粒不必含有同源序列。2）Mini-Ti质粒具有质粒具有E.coli质粒的复制位点、能在农杆菌的寄主中复质粒的复制位点、能在农杆菌的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加制，使其质粒的拷贝数增加10100倍，而且倍，而且Mini-Ti质粒分子量小质粒分子量小（10kb），可以直接进行体外遗传操作。），可以直接进行体外遗传操作。3）双元载体不需经过两个质粒的共整合过程，因此构建的操作步骤比较简）双元载体不需经过两个质粒的共整合过程，因此构建的操作步骤比较简单。单。4）由于）由于mini-Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，而且构建的频率较高。较容易，而且构建的频率较高。第50页，此课件共53页哦（5）一元载体系统和双元载体系统的比较5）由由于于根根癌癌农农杆杆菌菌感感染染的的寄寄主主范范围围是是由由Vir基基因因及及染染色色体体上上的的基基因因决决定定的的，因因此此，使使用用双双元元载载体体系系统统更更便便于于根根据据转转化化材材料料的的来来源源不不同同选选择择适适宜宜的的He1per系统。系统。6）双双元元载载体体在在外外源源DNA转转入入植植物物细细胞胞前前，无无需需进进行行同同源源重重组组，插插入入载载体体的外源基因变异可能要比的外源基因变异可能要比pGV3850系统来得小。系统来得小。7）共共整整合