细胞凋亡检测技术课件.ppt

细胞凋亡检测技术第1页，此课件共73页哦二、研究简史二、研究简史半个世纪前半个世纪前:人们就观察到在生物的发生、生人们就观察到在生物的发生、生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象的生理自发退化死亡现象.19651965年年:发育生物学家发育生物学家LockshinLockshin和和WilliamsWilliams首先首先提出了提出了PCDPCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发育调节性死亡。育调节性死亡。第2页，此课件共73页哦 1972 1972年年:Kerr:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念，等首次提出了细胞凋亡的概念，从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认为这从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。现象，可能具有十分重要的生物学意义。19771977年年:人们注意到在生理或病理性刺激条人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并认为件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。现象，可能具有十分重要的生物学意义。第3页，此课件共73页哦 19801980年年:Wyllie:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和学特征，包括核固缩和DNADNA降解成寡核苷酸片段等。降解成寡核苷酸片段等。19891989年年:0wen:0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中，发现选择过程中，发现T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)与自身抗原相互与自身抗原相互作用与未成熟作用与未成熟T T细胞的细胞的PCDPCD发生有关，并在体外证实剌发生有关，并在体外证实剌激激CD3CD3分子可诱导未成熟分子可诱导未成熟T T细胞细胞PCDPCD的发生。证明了信的发生。证明了信号传递物质对号传递物质对PCDPCD的调控作用。的调控作用。第4页，此课件共73页哦 19911991年年:Ellis:Ellis首首先先发发现现了了线线虫虫(C.elegans)(C.elegans)体体内内Ced-3Ced-3、4 4两两个个基基因因与与PCDPCD的的发发生生密密切切相相关关，随随后后逐逐渐渐发发现现了了多多种种参参与与PCDPCD的的正正相相调调节节基基因因和和负负相相调调节节基基因因，前前者者包包括括Ced-2Ced-2、p53p53、cmyccmyc、FasFas、糖糖皮皮质质激激素素受受体体及及白白细细胞胞介介素素11转转化化(ICE(ICE等等基基因因，后后者者则则有有Ced-9Ced-9、bcl-2bcl-2、p53p53等基因等基因.第5页，此课件共73页哦三、细胞凋亡的特征三、细胞凋亡的特征n细胞凋亡与细胞坏死虽然都是细胞死亡，但细细胞凋亡与细胞坏死虽然都是细胞死亡，但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性细胞死亡的胞凋亡的形态及生化特征与坏死性细胞死亡的特点则不同特点则不同第6页，此课件共73页哦（一）细胞凋亡的形态学改变：（一）细胞凋亡的形态学改变：组织内单个细胞或小团细胞的死亡组织内单个细胞或小团细胞的死亡 不引发细胞自溶，也不引起炎症反应不引发细胞自溶，也不引起炎症反应电镜下可见：凋亡细胞固缩电镜下可见：凋亡细胞固缩 胞浆致密，细胞器密集、退变胞浆致密，细胞器密集、退变 核染色质致密，聚集于核膜处核染色质致密，聚集于核膜处 胞核裂解，胞浆形成多发性芽突胞核裂解，胞浆形成多发性芽突 凋亡小体形成凋亡小体形成光镜下：凋亡小体外被以胞膜，圆形或卵圆形，胞浆浓光镜下：凋亡小体外被以胞膜，圆形或卵圆形，胞浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片。缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片。第7页，此课件共73页哦细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死 单细胞丢失单细胞丢失细细胞胞膜膜发发泡泡但但仍仍完完整整,细细胞胞膜膜内内陷将细胞分割成凋亡小体陷将细胞分割成凋亡小体不发生炎症反应不发生炎症反应被临近正常细胞或吞噬细胞吞噬被临近正常细胞或吞噬细胞吞噬溶酶体完整溶酶体完整染色质均一凝集染色质均一凝集 细胞成群丢失细胞成群丢失细细胞胞膜膜不不完完整整,细细胞胞肿胀、溶解肿胀、溶解发生严重炎症反应发生严重炎症反应被巨噬细胞吞噬被巨噬细胞吞噬溶酶体裂解溶酶体裂解染色质凝集成块、染色质凝集成块、不均一不均一 第8页，此课件共73页哦第9页，此课件共73页哦第10页，此课件共73页哦细胞坏死时核的变化细胞坏死时核的变化第11页，此课件共73页哦细胞坏死时的细胞坏死时的炎症反应炎症反应第12页，此课件共73页哦(二二)细细胞胞凋凋亡亡的的生生化化改改变变：凋凋亡亡过过程程中中出出现现的的生生化化改改变变以以DNA的片段化及蛋白质的降解最为重要。的片段化及蛋白质的降解最为重要。1)DNA的片段化的片段化 组成染色质的组成染色质的DNA链被激活的核酸链被激活的核酸内切酶切割，可形成内切酶切割，可形成180200bp或其整倍数的片段，或其整倍数的片段，电泳中呈特征灶的电泳中呈特征灶的“梯梯”状条带状条带，这是判断凋亡发生的客，这是判断凋亡发生的客 观指标之一。观指标之一。2)蛋白质的降解蛋白质的降解 凋亡蛋白酶激活，水解细胞的蛋白质结构，导致细胞凋亡蛋白酶激活，水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体并形成解体并形成凋亡小体凋亡小体、水解相关活性蛋白，从而使该、水解相关活性蛋白，从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。蛋白获得或丧失某种生物学功能。第13页，此课件共73页哦细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死生理因素诱导生理因素诱导非生理因素造成的意非生理因素造成的意外损伤外损伤受大分子合成和激活过程的严格受大分子合成和激活过程的严格调控调控离子稳态调节丧失离子稳态调节丧失需要能量需要能量不需要能量不需要能量需要大分子合成需要大分子合成不需要核酸和蛋白质不需要核酸和蛋白质的合成的合成有新基因从头转录有新基因从头转录没有新基因转录没有新基因转录染色质非随机降解为染色质非随机降解为DNA“梯带梯带”染色质染色质DNA随机降解随机降解第14页，此课件共73页哦四、细胞凋亡的过程与调控四、细胞凋亡的过程与调控 凋亡信号转导凋亡信号转导凋亡基因激活凋亡基因激活细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除(一一)凋亡的四个阶段：凋亡的四个阶段：第15页，此课件共73页哦凋凋亡亡诱诱导导因因素素+受体受体cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺死死亡亡信信号号凋凋亡亡基基因因激激活活DNase激活激活Caspase激活激活巨巨噬噬细细胞胞吞吞噬噬分分解凋亡细胞解凋亡细胞第16页，此课件共73页哦（二）细胞凋亡的调控（二）细胞凋亡的调控1.细胞凋亡的相关因素细胞凋亡的相关因素（1）诱导性因素诱导性因素激素和生长因子失衡：缺乏（激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴细胞凋亡）或过，淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素多（糖皮质激素，淋巴细胞凋亡），淋巴细胞凋亡）理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等 免疫性因素：如，免疫性因素：如，CTL分泌粒酶分泌粒酶靶细胞凋亡靶细胞凋亡微生物因素：细菌、病毒及毒素。（微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV）第17页，此课件共73页哦（2）抑制性因素：）抑制性因素：细胞因子：细胞因子：IL-2、神经营养因子、神经营养因子激素：激素：ACTH、睾丸酮、雌激素等、睾丸酮、雌激素等二价金属阳离子：二价金属阳离子：Zn2+药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸基酸病毒：病毒：EB病毒、牛痘病毒病毒、牛痘病毒CrmA第18页，此课件共73页哦2.细胞凋亡信号转导细胞凋亡信号转导凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点：凋亡信号转导系统的特点：多样性：不同种类细胞有不同系统多样性：不同种类细胞有不同系统耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联，耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统第19页，此课件共73页哦研究较多的系统：研究较多的系统：依据：依据：细胞凋亡时胞内游离细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升浓度显著上升用用Ca2+载体载体A23187人为升高人为升高B淋巴细胞淋巴细胞Ca2+水平，水平，B淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡用用Ca2+络合剂降低胞内络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡水平，阻止细胞凋亡 激活激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+活化核转录因子活化核转录因子1胞内胞内Ca2+信号系统（信号系统（Ca2+为第二信使）为第二信使）第20页，此课件共73页哦2cAMP/PKA信号系统（信号系统（cAMP为第二信使）为第二信使）依据：依据：双丁酰双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡凋亡糖皮质激素使糖皮质激素使cAMP上升上升cAMP激活激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化残基磷酸化改变蛋白质功能改变蛋白质功能第21页，此课件共73页哦3Fas蛋白蛋白/Fas配体信号系统配体信号系统Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白蛋白：细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白蛋白+Fas配体（抗配体（抗Fas）细胞凋亡细胞凋亡机制：机制：Fas蛋白蛋白+Fas配体（抗配体（抗Fas）神经鞘磷脂酶活性神经鞘磷脂酶活性产生产生神酰胺神酰胺蛋白激酶激活蛋白激酶激活细胞凋亡细胞凋亡Fas蛋白蛋白+抗抗Fas、TNF 激活激活ICE样样caspase 降解降解H1组组蛋白蛋白染色体松驰染色体松驰DNA暴露内切酶位点暴露内切酶位点通过通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡第22页，此课件共73页哦4神经酰胺信号系统神经酰胺信号系统神经酰胺：神经鞘磷脂（神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的作用下）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血白血病细胞，诱导细胞凋亡病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-、Fas抗原、抗原、糖皮质激素糖皮质激素 第23页，此课件共73页哦5二酰甘油二酰甘油/蛋白激酶蛋白激酶C（PKC）信号系统）信号系统二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产催化下产生的一种第二信使物质。生的一种第二信使物质。依据：依据：活化的活化的PKC1可诱导可诱导u937白血病细胞凋亡白血病细胞凋亡抑制抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡亡PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、质激素、T细胞受体激活、细胞受体激活、IL-2撤除）撤除）第24页，此课件共73页哦6酪氨酸蛋白激酶系统酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子生长因子或细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶激活酪氨酸蛋白激酶靶蛋白靶蛋白酪氨酸磷酸化酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活蛋白激活通过通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化细胞分化细胞分化生长因子或细胞因子撤除生长因子或细胞因子撤除不能激活酪氨酸蛋白激酶系不能激活酪氨酸蛋白激酶系统统细胞凋亡细胞凋亡第25页，此课件共73页哦3.凋亡相关基因凋亡相关基因三类：三类：抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP促进凋亡基因：促进凋亡基因：P53、Bax、ICE双向调节基因：双向调节基因：c-myc、Bclx第26页，此课件共73页哦(B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病白血病-2B cell lymphoma/leukemia-2基因的缩写)Bcl-2蛋白：蛋白：229个氨基酸（人）、个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）个氨基酸（小鼠）分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用：作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡依据：依据：导入导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡凋亡淋巴细胞有淋巴细胞有20%呈呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射线、阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）抗癌药物）1.Bcl-2第27页，此课件共73页哦 直接的抗氧化作用直接的抗氧化作用 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF）抑制促凋亡性调节蛋白质抑制促凋亡性调节蛋白质Bax、Bak的细胞毒作用的细胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶（抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活）的激活 维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制：抗凋亡作用机制：第28页，此课件共73页哦作用：作用：野生型（野生型（wtP53）：）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡（结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分分子警察子警察”）突变型：抑制细胞凋亡突变型：抑制细胞凋亡野生型野生型P53的作用机制：的作用机制：P53蛋白蛋白细胞周期细胞周期G1期检查染期检查染色体色体DNA损伤（检查点功能）损伤（检查点功能）发现发现DNA损伤损伤剌激剌激CIP的的表达表达阻止细胞进入下一周期，启动阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制修复机制修复失修复失败败启动细胞凋亡机制启动细胞凋亡机制细胞凋亡细胞凋亡2.P53第29页，此课件共73页哦c-myc:一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。节作用。作用机制：作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因，其作用取决胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子增殖，增殖，无生长因子无生长因子凋亡）。凋亡）。Bcl-x：能翻译：能翻译Bcl-XL和和Bcl-Xs两种蛋白，两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑制蛋白抑制细胞凋亡，细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡（合成以谁为主）蛋白促进细胞凋亡（合成以谁为主）3.c-myc,Bcl-x第30页，此课件共73页哦五、五、细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制（一）氧化损伤（一）氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：依据：各种氧化剂（各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡）可直接诱导细胞凋亡抑制超氧化物歧化酶（抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡）活性可诱导细胞凋亡抗氧化剂（抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（各种凋亡诱导因素（TNF-、电离辐射）引起的细胞凋亡、电离辐射）引起的细胞凋亡第31页，此课件共73页哦引起引起DNA损伤，激活损伤，激活P53基因基因引起引起DNA损伤，活化多聚损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭核糖合成酶，耗竭NAD，消耗，消耗大量大量ATP攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基生过氧羟基24碳四烯酸碳四烯酸激活激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶细胞膜损伤，细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变改变活化核转录因子活化核转录因子NF-B、AP-1，加速凋亡相关基因表达，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：第32页，此课件共73页哦（二）钙稳态失衡（二）钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：依据：各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程凋亡发生时胞浆凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）行性疾病）第33页，此课件共73页哦激活激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解依赖的核酸内切酶，降解DNA链链激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成有利于凋亡小体形成激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达Ca2+在在ATP的配合下使的配合下使DNA链舒展，暴露核小体之间链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割内切酶切割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：第34页，此课件共73页哦（三）线粒体损伤（三）线粒体损伤线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（膜电位（m）下降，能量代谢水平显著降低）下降，能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据：依据：抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（电位（m）下降）下降阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2）第35页，此课件共73页哦线粒体改变引起细胞凋亡的机制：线粒体改变引起细胞凋亡的机制：CaCa2+2+NONO缺血缺血原卟啉原卟啉活性氧活性氧线线 粒粒 体体mm下降下降Bcl-2(-)PTP开放开放Apaf+Cyt.CCaspase-9Caspase-9酶原酶原Caspase-9Caspase-9(+)Caspase-3Caspase-3酶原酶原Caspase-3Caspase-3(+)CaspaseCaspase抑制剂抑制剂AIF(-)蛋白质水解蛋白质水解细胞凋亡细胞凋亡DNA断裂断裂无活性核酸内切酶无活性核酸内切酶核酸内切酶激活核酸内切酶激活(+)(+)第36页，此课件共73页哦第二节第二节 细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡检测方法：归纳起来，可分细胞凋亡检测方法：归纳起来，可分三方面，即根据凋亡的形态学特征、细三方面，即根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征以及细胞凋亡的流式胞凋亡的生化特征以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。本节主要介绍细胞凋亡的细胞仪检测。本节主要介绍细胞凋亡的常用病理学检测方法。常用病理学检测方法。第37页，此课件共73页哦一、苏木精一、苏木精-伊红染色方法伊红染色方法(HE(HE染色染色)1石蜡组织切片石蜡组织切片HE染色（略）染色（略）2细胞爬片或细胞涂片的细胞爬片或细胞涂片的HE染色染色第38页，此课件共73页哦（1）细胞爬片或细胞涂片的制备：）细胞爬片或细胞涂片的制备：贴贴壁壁生生长长细细胞胞(包包括括肿肿瘤瘤细细胞胞)：让让细细胞胞生生长长在在盖盖玻玻片片使使其其在在上上面面爬爬行行生生长长。取取出出盖盖玻玻片片，经经PBS轻轻轻轻漂漂洗洗后后，用用4%的的甲甲醛醛或或多多聚聚甲甲醛醛在在常常温下固定温下固定510min，即可染色。，即可染色。悬悬浮浮生生长长细细胞胞(包包括括肿肿瘤瘤细细胞胞)或或贴贴壁壁生生长长的的细细胞胞经经消消化化脱脱壁壁成成单单细细胞胞悬悬液液后后，可可经经细细胞胞涂片后染色。涂片后染色。（2）染色方法）染色方法:同石蜡组织切片同石蜡组织切片HE染色，免去染色，免去第第1和第和第2步。步。第39页，此课件共73页哦【结果判断】1.光光学学显显微微镜镜下下细细胞胞核核呈呈蓝蓝黑黑色色，胞胞浆浆呈呈淡淡红红色色。凋凋亡亡细细胞胞在在组组织织中中单单个个散散在在分分布布，表表现现为为核核染染色色质质致致密密浓浓缩缩，核核碎碎裂裂等。等。2.在在细细胞胞爬爬片片上上，凋凋亡亡的的细细胞胞变变圆圆、变变小小，可可见见细细胞胞核核固固缩缩、碎碎裂裂，染染色色体体被被染染成成深深蓝蓝色色或或蓝蓝黑黑色色；可可见见细细胞胞膜膜皱皱折折、卷卷曲曲和和出出泡泡，以以及及芽芽生生形形成成膜膜包包裹裹的的凋凋亡亡小小体体(apoptotic bodies。而而正正常常细细胞胞经经染染色色后后仍仍保保持持细细胞胞原原有有的的生生长长形形状状(如如梭梭形形或或多多角角形形)，细细胞胞核核规规整整，染染成成均均一一蓝蓝色色。细细胞胞涂涂片片时时可可见见凋凋亡亡细细胞胞核核固固缩缩、碎碎裂裂，染染色色变变深深；正正常常细细胞胞染染色色体体显显均均匀匀淡淡蓝蓝色色或或蓝蓝色色，而而坏坏死死细细胞胞细细胞胞肿肿胀胀，可可见见细细胞胞膜膜的的连连续续性性破破坏坏，核核染染色色体体染染成成很很淡淡的的蓝色甚至消失。蓝色甚至消失。第40页，此课件共73页哦第41页，此课件共73页哦 嗜酸性小体嗜酸性小体(凋亡凋亡)嗜酸性变及嗜酸性小体嗜酸性变及嗜酸性小体肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂、溶解或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂、溶解消失，呈嗜酸性小体状消失，呈嗜酸性小体状第42页，此课件共73页哦二、甲基绿二、甲基绿-派诺宁染色法派诺宁染色法第43页，此课件共73页哦【染色原理染色原理】细细胞胞凋凋亡亡和和细细胞胞坏坏死死均均可可表表现现为为细细胞胞核核固固缩缩等等细细胞胞死死亡亡形形态态，但但两两者者发发生生机机制制不不同同。细细胞胞凋凋亡亡是是一一种种细细胞胞主主动动死死亡亡过过程程，需需要要有有细细胞胞内内蛋蛋白白酶酶的的激激活活，细细胞胞质质内内常常有有mRNA表表达达的的增增强强。而而细细胞胞坏坏死死则则是是一一种种被被动动的的细细胞胞死死亡亡过过程程，细细胞胞质质内内常常有有RNA的的损损失失。根根据据这这一一特特点点，可可应应用用试试剂剂甲甲基基绿绿对对DNA染染色色的的特特异异性性和和派派诺诺宁宁对对RNA的的亲亲和和性性，使使甲甲基基绿绿对对固固缩缩细细胞胞核核内内的的脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸着着染染，如如果果细细胞胞质质内内核核糖糖核核酸酸呈呈派派诺诺宁宁阳阳性性染染色色者者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。第44页，此课件共73页哦【试剂及配制试剂及配制】1.组织固定液组织固定液 无水乙醇无水乙醇600ml 氯氯 仿仿300ml 冰乙酸冰乙酸100ml 第45页，此课件共73页哦2.甲基绿纯化甲基绿纯化 新购买的甲基绿新购买的甲基绿(methyl green)需用氯仿进行纯化需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫。方法是将处理以去除甲基紫。方法是将2%甲基绿水溶液甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入氯仿倾入洁净分液漏斗，加入氯仿20ml充分混匀，使充分混匀，使其内的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏其内的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带紫红色的氯仿移去，斗下部的砂塞，慢慢把下沉带紫红色的氯仿移去，再加入新的氯仿再加入新的氯仿10ml，如此反复更换氯仿，直到无，如此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作为贮存液，紫红色为止。该液作为贮存液，4保存。保存。第46页，此课件共73页哦3.染色液染色液甲基绿贮存液甲基绿贮存液5m15%派诺宁水溶液派诺宁水溶液lm1蒸馏水蒸馏水12m12mol/L乙酸钠乙酸钠(pH4.8)18ml(临用前配制，临用前配制，滤纸过滤滤纸过滤)第47页，此课件共73页哦【操作方法操作方法】1.新鲜取材组织置组织固定液中新鲜取材组织置组织固定液中4固定固定36h；2.直直接接转转入入95%乙乙醇醇脱脱水水和和无无水水乙乙醇醇脱脱水水，二二甲甲苯苯透透明，石蜡包埋；明，石蜡包埋；3.切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水；切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水；4.置染色液中室温下染片约置染色液中室温下染片约lh；5.取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液；取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液；6.插入丙酮中迅速分化；插入丙酮中迅速分化；7.转入丙酮二甲苯转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗；稍洗；8二甲苯透明二甲苯透明23次；次；9中性树胶封固中性树胶封固 第48页，此课件共73页哦【结果判断】凋凋亡亡细细胞胞：光光学学显显微微镜镜下下凋凋亡亡细细胞胞细细胞胞核核固固缩缩呈呈绿绿色色或或绿绿蓝蓝色色着着染染，胞胞质质呈呈红红紫紫色色着着染染。观观察察时时可可用用凋凋亡亡指指数数进进行行计计数数，即即随随机机选选择择约约1020个个视视野野(每每张张切切片片约约10002500个个细细胞胞，计数凋亡细胞百分率。，计数凋亡细胞百分率。细胞坏死：只有固缩细胞核呈绿色着染。细胞坏死：只有固缩细胞核呈绿色着染。第49页，此课件共73页哦第50页，此课件共73页哦三、吖啶橙染色法三、吖啶橙染色法【染色原理染色原理】吖啶橙的荧光随吖啶橙的荧光随pH而变，其正色为绿色，随而变，其正色为绿色，随pH下下降可变到橙红色。吖啶橙与降可变到橙红色。吖啶橙与DNA和和RNA通过两个通过两个部位结合，连接碱基对和磷酸盐基团，吖啶橙与碱部位结合，连接碱基对和磷酸盐基团，吖啶橙与碱基对结合，形成第一复合物。第二复合物在多核苷基对结合，形成第一复合物。第二复合物在多核苷酸表面，由吖啶橙与磷酸盐基团连接而成。酸表面，由吖啶橙与磷酸盐基团连接而成。pH 6.0时，时，DNA结合染料的聚合加速，结合染料的聚合加速，pH低于低于3.8时，聚合时，聚合受抑制，而受抑制，而RNA在在pH 6.0和和3.8都能聚合而使颜色变都能聚合而使颜色变红红。第51页，此课件共73页哦【试剂试剂及配制及配制】吖啶吖啶橙橙贮贮存液存液:10mg:10mg吖啶吖啶橙溶解于橙溶解于100ml PBS100ml PBS中，中，pH 4.8pH 4.86.06.0滤过滤过，4 40 0C C避光保存避光保存【操作方法操作方法】1.制备活细胞悬液，浓度约为制备活细胞悬液，浓度约为107/ml2.取取95l细胞悬液，加细胞悬液，加5l吖啶橙贮存液混匀吖啶橙贮存液混匀3.吸吸一一滴滴混混合合液液滴滴于于洁洁净净玻玻片片上上，直直接接用用盖盖玻玻片片封片封片4.荧荧光光显显微微镜镜选选用用激激发发滤滤片片BG12，BV等等，阻阻断滤片用断滤片用515nm或或SP3 第52页，此课件共73页哦【结果判断结果判断】正正常常细细胞胞：在在荧荧光光显显微微镜镜下下，细细胞胞核核DNA为为黄黄色色或或黄黄绿绿色色均均匀匀荧荧光光，细细胞胞质质和和核核仁仁的的RNA为为桔黄或桔红色荧光桔黄或桔红色荧光 凋凋亡亡细细胞胞：细细胞胞核核或或细细胞胞质质内内可可见见致致密密浓浓染染的的黄黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片绿色染色，甚或见黄绿色碎片 坏死细胞：细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可坏死细胞：细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失减弱或消失 第53页，此课件共73页哦第54页，此课件共73页哦四、原位末端标记四、原位末端标记 原位末端标记（原位末端标记（ISEL)ISEL)是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶酸在酶末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdTTdT）和）和DNADNA聚合酶聚合酶I I或或KIenowKIenow大片段大片段的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。通股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。通常有两种方法常有两种方法:末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTPdUTP缺口末端标记缺口末端标记(简称简称TUNEL)TUNEL)；DNADNA聚合酶聚合酶I I或或KlenowKlenow大片段介导的原位缺口平大片段介导的原位缺口平移移(简称简称INST)INST)。在不考虑所使用的催化酶时，统称为原位末端标。在不考虑所使用的催化酶时，统称为原位末端标记。记。第55页，此课件共73页哦 TUNELTUNEL鉴鉴定定的的原原理理基基于于细细胞胞凋凋亡亡时时产产生生DNADNA断断链链，所所介介导导的的酶酶是是TdTTdT，该该酶酶能能将将外外源源性性的的生生物物素素或或地地高高辛辛标标记记的的dUTPdUTP无无需需DNADNA模模板板连连接接到到凋凋亡亡细细胞胞核核的的DNADNA断断链链的的3-3-羟羟基基(3-0H(3-0H末末端端，DNADNA断断链链可可是是单单股股断断链链也也可可是是双双股股断断链链，两两种种断断链链都都有有游游离离的的3-3-羟羟基基末末端端，因因此此，TUNELTUNEL鉴鉴定定可可以检测凋亡细胞核中的单股和双股以检测凋亡细胞核中的单股和双股DNADNA断链。断链。第56页，此课件共73页哦【试剂准备和配制】1.0.15mol/L 的的PBS:0.15mol/L NaCl，0.1mol/L 磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液；2蛋白酶蛋白酶K 20g/ml，0.15mol/L的的PBS配制；配制；3组组织织预预处处理理液液(2SSC溶溶液液):先先配配制制20SSC溶溶液液作作为为储储存存液液，用用时时10倍倍稀稀释释(1SSC溶溶液液含含 0.3mol/L NaCl，30mmol/L枸橡酸纳枸橡酸纳)；4内源酶阻断剂内源酶阻断剂:3%H202-甲醇溶液（或甲醇溶液（或PBS）第57页，此课件共73页哦5 缓缓 冲冲 液液 A(buffer A 250mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgC12，10mmol/L-巯巯 基基 乙乙 醇醇，0.005%BSA，pH 7.56链卵白素标记的辣根过氧化物酶；链卵白素标记的辣根过氧化物酶；7 DAB-H202显显 色色 液液:DAB用用0.1mol/L Tris-Cl(pH7.6)配成配成0.4%，分装一，分装一20避光保存；避光保存；8TdT缓冲液缓冲液(pH6.8)二甲胂酸纳二甲胂酸纳(Na-Cacodylate 100mmol/L二琉基苏糖醇二琉基苏糖醇(dithiothrenol 0.1mmol/L氯化钻氯化钻(C00)5mmol/L9TdT反应液反应液在在TdT缓缓 冲冲 液液 中中 加加 入入 TdT酶酶100U/ml，0.001mmol/L biotin-11-dUTP第58页，此课件共73页哦【染色步骤】1.切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行；切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行；2.3%的的H202阻断内源性过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶30min；3.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；4.切片浸泡在切片浸泡在2SSC 80 20min；5.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；6.蛋白酶蛋白酶K消化消化020min；7.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；8.TdT缓冲液孵育缓冲液孵育 10min第59页，此课件共73页哦9.TdT反应液反应液37孵育孵育 1h；10.切片浸泡在切片浸泡在2SSC溶液溶液10min，以终止反应；，以终止反应；11.0.15mol/L的的PBS洗洗3次次5min；12.链链卵卵臼臼素素标标记记的的辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶孵孵育育30min（POD）；）；13.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；14.0.04%的的DAB显色显色510min，镜下控制时间；，镜下控制时间；15.苏苏木木精精对对比比染染色色10-30sec，常常规规复复水水、透透明明和和封封固。固。第60页，此课件共73页哦【结果判断】凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。而正常非形态呈碎点状，不规整，大小不一致。而正常非凋亡细胞和阴性对照片核被苏木素复染呈蓝色，凋亡细胞和阴性对照片核被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致核相对较大，形态大小较为一致第61页，此课件共73页哦第62页，此课件共73页哦第三节第三节 细胞凋亡的应用细胞凋亡的应用一细胞凋亡与机体发育一细胞凋亡与机体发育 细细胞凋亡是多胞凋亡是多细细胞胞动动物生命活物生命活动过动过程中不可缺少程中不可缺少的的组组成内容，是成内容，是动动物借以存活的需要，因而物借以存活的需要，因而贯贯穿于穿于动动物全部寿命周期中。无物全部寿命周期中。无论论是低等是低等动动物物还还是高等是高等动动物，物，都是如此。在哺乳都是如此。在哺乳动动物胚胎物胚胎发发生、生、发发育和成熟育和成熟过过程中，程中，构成构成组织组织的的细细胞生死交替，胞生死交替，细细胞凋亡是保胞凋亡是保证证个体个体发发育育成熟所必需的。成熟所必需的。第63页，此课件共73页哦二细胞凋亡与机体稳态二细胞凋亡与机体稳态 组成机体的细胞不但需要不断地与环境进行物质、组成机体的细胞不但需要不断地与环境进行物质、信息和能量的交换，而且这些细胞本身也处在不断信息和能量的交换，而且这些细胞本身也处在不断的更新中。这种更新是以细胞数量上的恒定为前提的更新中。这种更新是以细胞数量上的恒定为前提的，因此是一种动态平衡状态，显然，各种细胞数的，因此是一种动态平衡状态，显然，各种细胞数量上稳定，不但保证了机体各组织器官具有形态学量上稳定，不但保证了机体各组织器官具有形态学上的稳定性，同时也是机体生理功能或内环境稳定上的稳定性，同时也是机体生理功能或内环境稳定的必要条件。没有这种细胞生理性死亡，细胞更新的必要条件。没有这种细胞生理性死亡，细胞更新就不可能发生，因此，细胞产生与细胞凋亡之间的就不可能发生，因此，细胞产生与细胞凋亡之间的平衡是机体稳态的基本条件，它们的平衡一旦破坏，平衡是机体稳态的基本条件，它们的平衡一旦破坏，就会导致疾病的产生就会导致疾病的产生 第64页，此课件共73页哦三、三、细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡不足（一）细胞凋亡不足1.肿瘤肿瘤发生机制：目前认为：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋发生机制：目前认为