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关于脂类代谢与控制关于脂类代谢与控制第一页，讲稿共七十五页哦概述概述n n脂类，也称脂质或类脂，是一类低溶于水而高溶于非极性溶剂的生物有机分子。n n对大多数脂类而言，其化学本质是脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物。n n参与脂类组成的脂肪酸多是4碳以上的长链一元羧酸，醇成分包括甘油（丙三醇）、鞘胺醇、高级一元醇和固醇。n n脂类元素组成主要是碳、氢、氧，有些含有氮、磷及硫等。第二页，讲稿共七十五页哦第三页，讲稿共七十五页哦第一节 脂类的代谢与调节一、脂肪酸的分解（一、脂肪酸的分解（-氧化作用）氧化作用）n n1904年年年年，Franz Franz KnoopKnoop将将末末端端碳碳连连有有苯苯基基的的一一些些奇奇数数碳碳和和偶偶数数碳碳脂脂肪肪酸酸衍衍生生物物喂喂狗狗，然然后后分分离离狗狗尿尿中中的的苯苯化化合合物物。Knoop发发现现，当当奇奇数数碳碳脂脂肪肪酸酸衍衍生生物物被被降降解解时时，尿尿中中检检测测出出的的是是马马尿尿酸酸（苯苯甲甲酸酸和和甘甘氨氨酸酸的的结结合合物物）；如如果果是是偶偶数数碳碳，则则尿尿中中排排出出的的是是苯苯乙乙尿尿酸酸（苯苯乙乙酸酸和和甘甘氨氨酸酸的的结结合合物物）。因因此此KnoopKnoop认认为为，脂脂肪肪酸酸的的氧氧化化发发生生在在-碳碳原原子子上上，即即每每次次从从脂脂肪肪酸酸链链上上降降解解下下来来的的是是2碳碳单单位位，也也就就是是后后来来所所谓谓的的脂脂肪肪酸酸-氧化。氧化。第四页，讲稿共七十五页哦 第五页，讲稿共七十五页哦细胞内脂肪酸的降解过程可以分为细胞内脂肪酸的降解过程可以分为3个阶段：个阶段：n n脂肪酸在细胞质中活化为脂酰脂肪酸在细胞质中活化为脂酰CoA；n n脂酰脂酰CoA通过转运系统进入线粒体基质；通过转运系统进入线粒体基质；n n以以2碳单位降解碳单位降解-氧化。氧化。第六页，讲稿共七十五页哦1 1、脂肪酸的活化、脂肪酸的活化 n n长长链链脂脂肪肪酸酸氧氧化化前前必必须须进进行行活活化化，活活化化在在线线粒粒体体外外进进行行（原原核核生生物物在在细细胞胞溶溶胶胶中中进进行行），脂脂肪肪酸酸先与先与CoACoA形成硫酯键。形成硫酯键。n n胞胞液液中中的的脂脂肪肪酸酸可可以以在在脂脂酰酰CoACoA合合成成酶酶的的催催化化下下，与与乙乙酰酰CoACoA酯酯化化，生生成成脂脂酰酰CoACoA。细细胞胞中中有有4 4种种不不同同的的脂脂酰酰CoACoA合合成成酶酶，它它们们分分别别对对带带有有短短的的（C C1212）和和更更长长的的（C C1616）碳碳链链的的脂脂肪肪酸酸具具有有催催化化的特异性。的特异性。第七页，讲稿共七十五页哦 第八页，讲稿共七十五页哦2 2、脂肪酸转入线粒体、脂肪酸转入线粒体 肉毒碱（肉毒碱（carnitine）穿梭机制）穿梭机制第九页，讲稿共七十五页哦肉毒碱穿梭机制包括以下步骤：肉毒碱穿梭机制包括以下步骤：n n在在脂脂酰酰肉肉毒毒碱碱转转移移酶酶I I（carnitine carnitine acyltransferase acyltransferase I I，CAT CAT I I）催催化化下下，脂脂酰酰CoACoA中中中中的的的的脂脂脂脂酰酰酰酰基基基基转转转转移移移移到到到到L-肉肉毒毒碱碱上，形成脂酰肉毒碱。上，形成脂酰肉毒碱。n n脂脂酰酰肉肉毒毒碱碱在在肉肉毒毒碱碱：脂脂酰酰肉肉毒毒碱碱转转运运酶酶的的作作用用下下，与游离的肉毒碱交换后进入线粒体基质。与游离的肉毒碱交换后进入线粒体基质。n n在在线线粒粒体体基基质质中中，脂脂酰酰肉肉毒毒碱碱在在与与膜膜结结合合的的脂脂酰酰肉肉毒毒碱碱转转移移酶酶IIII（CAT CAT IIII是是是是CAT CAT I I的的的的同同同同功功功功酶酶酶酶）的的的的催催催催化化化化下下下下，重重重重新生成脂酰新生成脂酰新生成脂酰新生成脂酰CoACoA和肉毒碱（和肉毒碱（和肉毒碱（和肉毒碱（CAT I催化反应的逆反应）。催化反应的逆反应）。第十页，讲稿共七十五页哦第十一页，讲稿共七十五页哦3 3、脂肪酸的、脂肪酸的-氧化氧化 n n脂脂肪肪酸酸的的-氧氧化化发发生生于于线线粒粒体体中中，脂脂酰酰CoACoA氧氧化化生生成乙酰成乙酰CoACoA涉及涉及4 4个基本反应：个基本反应：n n第一次氧化反应（第一次氧化反应（oxidation）；）；n n水化反应（水化反应（hydration）；）；n n第二次氧化反应（第二次氧化反应（oxidation）；）；n n硫解反应（硫解反应（cleavage）。）。第十二页，讲稿共七十五页哦第十三页，讲稿共七十五页哦第十四页，讲稿共七十五页哦第十五页，讲稿共七十五页哦第十六页，讲稿共七十五页哦第十七页，讲稿共七十五页哦4、脂肪酸的其他氧化分解方式、脂肪酸的其他氧化分解方式n n奇数碳链脂肪酸的分解 氧化产生n-1个乙酰CoA和1个丙酰CoA，丙酰CoA与ATP、CO2反应，生成甲基丙二酸单酰CoA，经分子重排成琥珀酰CoA，进入TCA循环。n n脂肪酸的-氧化脂肪酸位的碳原子首先氧化，生成二羧酸，再通过-氧化作用脱下二碳化合物。第十八页，讲稿共七十五页哦第十九页，讲稿共七十五页哦5 5、能量代谢、能量代谢 脂肪酸代谢的能量产生分为三个阶段：脂肪酸代谢的能量产生分为三个阶段：n n长链脂肪酸经长链脂肪酸经-氧化降解为乙酰基（乙酰氧化降解为乙酰基（乙酰CoACoACoACoA）。）。n n乙酰基经柠檬酸循环氧化为乙酰基经柠檬酸循环氧化为COCOCOCO2 2。n n前面两个阶段产生的前面两个阶段产生的前面两个阶段产生的前面两个阶段产生的NADHNADHNADHNADH和和FADHFADHFADHFADH2 2 2 2经呼吸链氧化，合成经呼吸链氧化，合成ATPATPATPATP。第二十页，讲稿共七十五页哦第二十一页，讲稿共七十五页哦二、脂肪酸的生物合成二、脂肪酸的生物合成n n对对微微生生物物、动动植植物物细细胞胞合合成成脂脂肪肪酸酸的的研研究究证证明明，脂脂肪肪酸酸的的合合成成并并不不是是脂脂肪肪酸酸-氧氧化化的的逆逆反反应应，而而是是通通过另外的途径合成。过另外的途径合成。n n在在脂脂肪肪酸酸氧氧化化途途径径中中，中中间间产产物物都都是是辅辅酶酶A A（CoASHCoASH）的的衍衍生生物物；在在脂脂肪肪酸酸的的生生物物合合成成途途径径中中，则则都都是是酰酰基基载载体体蛋蛋白白（ACPACP）的的衍衍生生物物。这这是是两者之间的根本性区别。两者之间的根本性区别。第二十二页，讲稿共七十五页哦ACP：不同生物体中的ACP十分相似，E.coli中的ACP是一个由77个aa组成的热稳定蛋白质，在第36位Ser的侧链上，连有辅基4-磷酸泛酰巯基乙胺。第二十三页，讲稿共七十五页哦 脂脂肪肪酸酸的的生生物物合合成成是是在在细细胞胞液液中中进进行行，需需要要COCO2 2和和柠柠檬檬酸酸参参加加；而而氧氧化化降降解解是是在在线线粒粒体体中中进进行行的。的。真核生物中脂肪酸的生物合成包括三个过程：真核生物中脂肪酸的生物合成包括三个过程：n n乙酰乙酰CoACoA的转运（柠檬酸转运系统）。的转运（柠檬酸转运系统）。n n丙二酸单酰丙二酸单酰CoACoA的生成的生成 。n n脂肪酸的合成。脂肪酸的合成。第二十四页，讲稿共七十五页哦1 1、乙酰、乙酰CoACoA的转运（柠檬酸转运系统）的转运（柠檬酸转运系统）n n由由糖糖代代谢谢产产生生的的乙乙酰酰CoACoA可可以以通通过过柠柠檬檬酸酸转转运运系系统统，从从线线粒粒体体转转运运到到胞胞质质中中，供供给给脂脂肪肪酸酸的合成。的合成。n n首首先先在在柠柠檬檬酸酸合合成成酶酶催催化化下下，线线粒粒体体中中的的乙乙酰酰CoACoA和草酰乙酸缩合形成柠檬酸。和草酰乙酸缩合形成柠檬酸。n n生生成成的的柠柠檬檬酸酸经经柠柠檬檬酸酸二二羧羧酸酸载载体体转转运运出出线粒体。线粒体。第二十五页，讲稿共七十五页哦第二十六页，讲稿共七十五页哦n n进进入入到到胞胞液液内内的的柠柠檬檬酸酸经经柠柠檬檬酸酸裂裂解解酶酶催催化化，裂裂解解生生成成乙乙酰酰CoACoA和和草草酰酰乙乙酸酸，裂裂解解反反应应需需要要CoA-SHCoA-SH和消耗和消耗ATPATP。n n柠柠檬檬酸酸裂裂解解生生成成的的草草酰酰乙乙酸酸在在细细胞胞质质中中的的苹苹果果酸酸脱脱氢氢酶酶催催化化下下还还原原为为苹苹果果酸酸，同同时时NADHNADH氧氧化化为为NADNAD。n n苹苹果果酸酸在在苹苹果果酸酸酶酶催催化化下下脱脱羧羧生生成成丙丙酮酮酸酸，NADPNADP还原为还原为NADPHNADPH。第二十七页，讲稿共七十五页哦2 2、丙二酸单酰、丙二酸单酰CoACoA的生成的生成 n n细细细细胞胞胞胞质质质质中中中中的的的的乙乙乙乙酰酰酰酰CoACoA在在在在乙乙乙乙酰酰酰酰CoACoACoACoA羧羧化化酶酶催催化化下下羧羧化化，形形成成丙丙二二酸酸单单酰酰CoACoA。乙乙酰酰CoACoA羧羧化化酶酶的的辅辅基基是是生生物素，其反应机理类似丙酮酸羧化酶。物素，其反应机理类似丙酮酸羧化酶。第二十八页，讲稿共七十五页哦3 3、脂肪酸的合成、脂肪酸的合成n n脂脂肪肪酸酸的的合合成成是是在在脂脂肪肪酸酸合合成成酶酶复复合合体体的的作作用用下下完完成成的的。E.coli的的脂脂肪肪酸酸合合成成酶酶复复合合体体包包含含7种种酶酶，而而哺哺乳乳动动物物的的脂脂肪肪酸酸合合成成酶酶只只有有一一条条肽肽链链，但但具具有有多多种种催催化化活活性性。另另外外，脂脂肪肪酸酸的的合合成成还还需需要要酰酰基基载载体体蛋蛋白白（ACP：acyl carrier protein）来转移酰基基团。来转移酰基基团。第二十九页，讲稿共七十五页哦 包包括括5 5个个反反应应步步骤骤：前前体体负负载载，前前体体缩缩合合，还还原原，脱水和进一步还原。脱水和进一步还原。负载负载n n乙乙酰酰CoACoA在在乙乙酰酰CoA-ACPCoA-ACP转转酰酰基基酶酶的的催催化化下下，将将其其乙酰基转移到乙酰基转移到ACPACP上，形成乙酰上，形成乙酰-ACP-ACP。n n丙丙二二酸酸单单酰酰CoACoA在在丙丙二二酸酸单单酰酰-ACP-ACP转转酰酰基基酶酶的的催催化化下下，将将丙丙二二酸酸单单酰酰基基转转移移到到ACPACP上上，形形成成丙丙二二酸酸单单酰酰-ACP-ACP。E.Coli中脂肪酸的合成中脂肪酸的合成第三十页，讲稿共七十五页哦缩合缩合n n酮酮酰酰基基-ACP-ACP合合成成酶酶接接受受乙乙酰酰-ACP-ACP的的乙乙酰酰基基，释释放放HS-ACPHS-ACP。酮酮酰酰基基-ACP-ACP合合成成酶酶催催化化乙乙酰酰基基转转移移到到丙丙二二酸酸单单酰酰-ACP-ACP上上，形形成成乙乙酰酰乙乙酰酰-ACP-ACP，并并释放一分子释放一分子COCO2 2。还原还原n n在在酮酮酰酰基基ACPACP还还原原酶酶催催化化下下，乙乙酰酰乙乙酰酰-ACP-ACP中中的的b-b-酮酮基基被被NADPHNADPHH H还还原原为为醇醇，形形成成D-b-D-b-羟羟丁丁酰酰-ACP-ACP。第三十一页，讲稿共七十五页哦脱水脱水n n在在b-b-羟羟酰酰基基-ACP-ACP脱脱水水酶酶的的催催化化下下，D-b-D-b-羟羟丁丁酰酰-ACPACP脱水，生成带有双键的反式丁烯酰脱水，生成带有双键的反式丁烯酰-ACP-ACP。还原还原n n烯烯酰酰基基-ACP-ACP还还原原酶酶催催化化反反式式丁丁烯烯酰酰-ACP-ACP还还原原为为丁酰丁酰-ACP-ACP，NADPHNADPH为辅酶。为辅酶。第三十二页，讲稿共七十五页哦第三十三页，讲稿共七十五页哦第三十四页，讲稿共七十五页哦4 4、脂肪酸、脂肪酸-氧化和合成的主要区别氧化和合成的主要区别n n从从上上述述脂脂肪肪酸酸合合成成途途径径可可以以看看出出，脂脂肪肪酸酸合合成成和和降降解解是是通通过过完完全全不不同同的的两两条条途途径径进进行行的的。下下表表归归纳纳了了软软脂脂酸酸-氧化和合成的主要区别。氧化和合成的主要区别。氧化和合成的主要区别。氧化和合成的主要区别。第三十五页，讲稿共七十五页哦为增加脂肪酸生物合成，可从以下几方面考虑：为增加脂肪酸生物合成，可从以下几方面考虑：选选育育乙乙酰酰-CoA-CoA羧羧化化酶酶活活力力强强的的菌菌株株，设设法法解解除除终终产产物（脂酰物（脂酰CoACoA及脂肪酸）的反馈抑制。及脂肪酸）的反馈抑制。n n选选育育抗抗代代谢谢产产物物结结构构类类似似物物突突变变株株（抗抗脂脂肪肪酸酸结结构构类类似物），即抗反馈调节突变株。似物），即抗反馈调节突变株。n n选选育育营营养养缺缺陷陷型型的的回回复复突突变变株株或或选选育育条条件件突突变变株株，解解除除微微生生物物细细胞胞正正常常的的自自我我调调节节，使使脂脂肪肪酸酸得得以以积积累。累。三、脂肪酸生物合成的代谢控制育种三、脂肪酸生物合成的代谢控制育种第三十六页，讲稿共七十五页哦选选育育易易生生成成并并大大量量积积累累柠柠檬檬酸酸的的菌菌株株或或有有利利于柠檬酸合成而不利于柠檬酸降解的突变株。于柠檬酸合成而不利于柠檬酸降解的突变株。选选育育丧丧失失或或只只具具有有微微弱弱柠柠檬檬酸酸脱脱氢氢酶酶活活力力的的突突变株。如异柠檬酸脱氢酶的渗漏突变株等。变株。如异柠檬酸脱氢酶的渗漏突变株等。第三十七页，讲稿共七十五页哦 第二节 多不饱和脂肪酸发酵 的代谢控制育种n n多多多多不不不不饱饱饱饱和和和和脂脂脂脂肪肪肪肪酸酸酸酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是是是是指指指指含含含含2 2个个或或2个个以以上上双双键键且且碳碳原原子子数数为为161622的的直直链链脂脂肪肪酸酸，包包括括-亚亚麻麻酸酸、花花生生四四烯烯酸酸、二二十十碳碳五五烯烯酸酸（EPAEPA）、二十二碳六烯酸（）、二十二碳六烯酸（）、二十二碳六烯酸（）、二十二碳六烯酸（DHA）等。）等。n n由由于于多多不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸可可广广泛泛用用于于医医药药、食食品品、化化妆妆品品、饲饲料料等等领领域域，因因此此世世界界各各国国开开展展了了多多饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的微微生生物物育育种种、发发酵酵提提取取工工艺艺以以及及发发酵酵动动力力学学等等方方面面的的研研究。究。第三十八页，讲稿共七十五页哦n n多不饱和脂肪酸的自然来源主要是动植物，但含量最丰富的是微生物，特别是藻类、真菌、细菌等，且主要以储存油和膜脂的形式存在，尤其是-3多不饱和脂肪酸。n n藻类、真菌、细菌拥有重新合成多种-3多不饱和脂肪酸所需的系列脱饱和酶和连接酶，它们是自然界中这些化合物的初始生产者，而高等植物和动物则很少含有-3多不饱和脂肪酸。第三十九页，讲稿共七十五页哦n n目前商业上-3多不饱和脂肪酸主要是从深海鱼油中提取，工艺复杂、成本高、稳定性差，还受气候条件和资源的限制。n n微生物具有适应性强、生长繁殖迅速、生长周期短、易培养、不受原料产地限制等特点，所以利用微生物生产多不饱和脂肪酸是一条重要途径。n n目前，日本、英国等国家已先后问世了-亚麻酸、双高-亚麻酸、花生四烯酸等发酵产品，而EPA、DHA等仍处于研究阶段。第四十页，讲稿共七十五页哦一、一、-亚麻酸发酵的代谢控制育种亚麻酸发酵的代谢控制育种n n1919191919191919年年德德国国的的药药理理学学家家Hei-duschKaHei-duschKa博博士士从从月月见见草草中中发发现现与与亚亚油油酸酸相相似似的的高高级级多多不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸，被被命命名名为为-亚麻酸。亚麻酸。亚麻酸。亚麻酸。n n-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸是是是是人人人人体体体体内内内内所所所所必必必必需需需需的的的的必必必必需需需需脂脂脂脂肪肪肪肪酸酸酸酸。如如如如果果果果人人人人体体体体一一一一旦旦旦旦缺缺缺缺乏乏乏乏了了了了必必必必需需需需脂脂脂脂肪肪肪肪酸酸酸酸，心心心心脑脑脑脑血血血血管管管管、生生生生殖殖殖殖、内内内内分分分分泌泌泌泌等等等等系系系系统统统统就就就就会会会会出出出出现现现现异异异异常常常常，发发发发生生生生紊紊紊紊乱乱乱乱，从从从从而而而而引引引引起起起起高高高高血血血血脂脂脂脂，高高高高血血血血压压压压，血血血血栓栓栓栓病病病病、动动动动脉脉脉脉粥粥粥粥样样样样硬硬硬硬化化化化、糖糖糖糖尿尿尿尿病病病病、加加加加速速速速衰衰衰衰老老老老等等等等一一一一系系系系列列列列疾疾疾疾病病病病，-亚亚亚亚麻麻麻麻酸特别对脑组织的生长发育至关重要。酸特别对脑组织的生长发育至关重要。酸特别对脑组织的生长发育至关重要。酸特别对脑组织的生长发育至关重要。第四十一页，讲稿共七十五页哦第四十二页，讲稿共七十五页哦n n当当-亚亚麻麻酸酸的的生生物物活活性性含含量量达达到到15%15%15%15%以以以以上上上上，就就就就能能能能起起起起到到到到显显显显著著著著的的的的药药药药理理理理治治治治疗疗疗疗作作作作用用用用。由由由由此此此此可可可可见见见见，-亚亚麻麻酸酸是是人人类类的的生命之宝。生命之宝。n n从从从从植植植植物物物物中中中中提提提提取取取取-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸受受受受到到到到诸诸诸诸多多多多因因因因素素素素的的的的限限限限制制制制，植植植植物物物物生生生生长长长长周周周周期期期期长长长长，种种种种子子子子采采采采集集集集较较较较难难难难，油油油油含含含含量量量量不不不不稳稳稳稳定定定定，难难难难以以以以满满满满足足足足人人人人们们们们日日日日益增长的需求。益增长的需求。益增长的需求。益增长的需求。n n1948194819481948年年，BernhardBernhard和和和和AlberchAlberch首首次次从从布布拉拉克克须须霉霉的的菌菌体体脂脂肪肪中中鉴鉴定定出出含含有有-亚亚麻麻酸酸，揭揭开开了了微微生生物物发发酵酵-亚麻酸的序幕，大量的研究随之展开。亚麻酸的序幕，大量的研究随之展开。第四十三页，讲稿共七十五页哦n n亚亚麻麻酸酸（GLAGLA）为为为为全全全全顺顺顺顺式式式式6 6，9 9，12121212十十八八碳碳三三烯烯酸酸，非非共共轭轭立立体体构构型型，分分子子式式为为C C1818H H3030O O O O2 2，由由于于其其高高度度的的不不饱饱和和性性在在空空气气中中不不稳稳定定，在在碱碱性性条条件件下下易易发发生生双双键位置及构型的异构化反应，形成共轭多烯酸。键位置及构型的异构化反应，形成共轭多烯酸。第四十四页，讲稿共七十五页哦发酵法生产发酵法生产亚麻酸的菌种亚麻酸的菌种n n目目前前发发现现能能积积累累亚亚麻麻酸酸的的微微生生物物主主要要是是一一些些真真菌菌和和微微藻藻，其其中中真真菌菌研研究究较较多多的的有有被被孢孢霉霉属属、毛毛霉霉属属、枝枝酶酶属属、根根霉霉属属等等；藻藻类类的的研研究究主要集中在螺旋藻。主要集中在螺旋藻。n n藻藻类类的的培培养养受受外外界界条条件件的的影影响响较较大大，生生产产多多不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸有有一一定定难难度度，真真菌菌在在自自然然界界分分别别广广且且易易培培养养，目目前前利利用用真真菌菌发发酵酵生生产产亚亚麻麻酸酸已成为国内外研究热点。已成为国内外研究热点。第四十五页，讲稿共七十五页哦n n丝丝状状真真菌菌利利用用葡葡萄萄糖糖合合成成-亚亚麻麻酸酸的的代代谢谢途途径径如下图所示。如下图所示。n n从从图图中中可可以以看看出出，-亚亚麻麻酸酸的的生生物物合合成成机机制制比比较较复复杂杂，从从葡葡萄萄糖糖到到-亚亚麻麻酸酸需需涉涉及及2020多多步步酶酶促促反反应。关于其代谢调节机制，目前尚不清楚。应。关于其代谢调节机制，目前尚不清楚。-亚麻酸的代谢途径分析亚麻酸的代谢途径分析第四十六页，讲稿共七十五页哦第四十七页，讲稿共七十五页哦n n脂肪酸合成的前体物质，一是乙酰CoA，为脂肪酸的合成提供碳骨架；二是NADPH，为脂肪酸的合成提供还原力。n nNADPH主要由胞质转氢酶循环产生，限速酶为苹果酸酶。当苹果酸酶的活性受到抑制或者表达上被削弱时，胞质中的NADPH将减少，脂肪酸的合成也将随之减少。n n因此，胞内NADPH与乙酰CoA的水平对微生物合成GLA至关重要。第四十八页，讲稿共七十五页哦第四十九页，讲稿共七十五页哦-亚亚麻麻酸酸产产生生菌菌的的育育种种思思路路可可归归纳纳如如下下：第五十页，讲稿共七十五页哦 根根据据上上述述育育种种思思路路，要要选选育育-亚亚麻麻酸酸高高产产菌菌株株，可可以以从以下几方面着手：从以下几方面着手：1、出发菌株的选择、出发菌株的选择n n-亚亚麻麻酸酸产产生生菌菌多多采采用用被被孢孢霉霉（Mortierella）、毛毛霉霉（Mucor）、红红酵酵母母（Rhodotorula）、小小克克银银汉汉霉霉（Cunninghamella）等等产产油油脂脂较较高高的的真真菌菌作作为为出出发菌株。发菌株。第五十一页，讲稿共七十五页哦诱变育种及其筛选方法诱变育种及其筛选方法n n目目前前，用用于于产产GLAGLA微微生生物物诱诱变变的的方方法法主主要要有有物物理理诱诱变变和和化化学学诱诱变变，物物理理诱诱变变包包括括：紫紫外外诱诱变变、激激光光诱诱变变、低低能能离离子子注注入入等等；常常用用的的化化学学诱诱变变方方法法有有：硫硫酸酸二二乙乙酯酯、亚硝基胍、氯化锂和亚硝酸盐诱变等。亚硝基胍、氯化锂和亚硝酸盐诱变等。n n然然而而，产产生生正正突突变变的的概概率率通通常常较较小小，因因此此需需要要一一种种简简单单易易行行的的筛筛选选方方法法不不仅仅可可以以减减轻轻工工作作量量，还还可可以以提提高高筛筛选选效效率率，减减小盲目性。小盲目性。第五十二页，讲稿共七十五页哦n n苏苏丹丹黑黑染染色色法法筛筛选选：其其原原理理是是菌菌体体用用苏苏丹丹黑黑染染色色后后，油油脂脂被被染染成成蓝蓝黑黑色色，原原生生质质为为淡淡红红色色，在在显显微微镜镜下下观观察察菌菌体体的的颜色，蓝黑色深者说明菌体内的油脂含量较多。颜色，蓝黑色深者说明菌体内的油脂含量较多。n n于于爱爱群群等等利利用用苏苏丹丹黑黑染染色色法法筛筛选选获获得得株株GLAGLA产产生生菌菌EM10EM10，通通过过摇摇瓶瓶培培养养，其其生生物物量量达达11.882gL11.882gL，菌菌丝丝体体油油脂脂含含量量达达18.8618.86，进进一一步步鉴鉴定定该该菌菌株株，表表明明该该菌菌为为毛毛霉属。霉属。n n刘阳等通过紫外-硫硫 酸酸 二二 乙乙 酯酯 复复 合合 诱诱 变变 深深 黄黄 被被 孢孢 霉霉AS3.3410AS3.3410，用用苏苏丹丹黑黑染染色色初初筛筛，得得到到突突变变株株H3.3410-5H3.3410-5，其GLA含量较原始菌株提高了含量较原始菌株提高了14.414.4。第五十三页，讲稿共七十五页哦2、切断或减弱支路代谢、切断或减弱支路代谢n n通通通通过过过过切切切切断断断断或或或或减减减减弱弱弱弱非非非非-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸生生生生物物物物合合合合成成成成的的的的支支支支路路路路代代代代谢谢谢谢，使使使使更更更更多多多多的的的的磷磷磷磷酸酸酸酸烯烯烯烯醇醇醇醇式式式式丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸、乙乙乙乙酰酰酰酰CoA、亚亚亚亚油油油油酸酸酸酸生生生生成成成成-亚亚亚亚油油油油酸，从而提高酸，从而提高酸，从而提高酸，从而提高-亚油酸的产量。亚油酸的产量。亚油酸的产量。亚油酸的产量。n n据据报报道道，采采用用-亚亚油油酸酸缺缺陷陷型型、花花生生四四烯烯酸酸缺缺陷陷型型、二二十十碳碳五五烯烯酸酸缺缺陷陷型型，均均有有助助于于-亚亚油油酸酸产产量量的的提提高高。另另外外，选选育育花花生生四四烯烯酸酸渗渗漏漏、二二十十碳碳五五烯烯酸酸渗渗漏漏突变株，也可使突变株，也可使-亚麻酸的产量得到提高。亚麻酸的产量得到提高。第五十四页，讲稿共七十五页哦3、解除反馈调节、解除反馈调节n n选选育育脂脂肪肪酸酸结结构构类类似似物物抗抗性性突突变变株株（如如LTBr）、耐耐高高浓浓度度-亚亚麻麻酸酸突突变变株株，均均能能不不同同程程度度地地解解除除-亚亚麻麻酸酸的的反反馈馈调调节节机机制制，使使得得代代谢谢更更加加流流畅，从而提高畅，从而提高-亚麻酸的产量。亚麻酸的产量。第五十五页，讲稿共七十五页哦4、强化能量代谢、强化能量代谢n n提提高高菌菌体体细细胞胞内内ATP的的水水平平，有有利利于于脂脂肪肪酸酸的的合合成成。因因此此，选选育育呼呼吸吸抑抑制制剂剂（丙丙二二酸酸、氰氰化化钾钾、亚亚砷砷酸酸等等）抗抗性性突突变变株株、ADPADP磷磷磷磷酸酸酸酸化化化化抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂（羟羟羟羟胺胺胺胺、2,4-二二二二硝硝硝硝基基基基酚酚酚酚等等等等）抗抗抗抗性性性性突突突突变变变变株株株株、抑抑抑抑制制制制能能能能量量量量代代代代谢谢谢谢的的的的抗抗抗抗生生生生素素素素（寡寡寡寡霉霉霉霉素素素素、缬缬缬缬氨氨氨氨霉霉霉霉素素素素等等等等）抗抗抗抗性性性性突突突突变变变变株株株株，均均均均有有有有助助助助于于于于-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸产产产产量量量量的的的的提提提提高。高。高。高。第五十六页，讲稿共七十五页哦5、增加前体物的合成、增加前体物的合成n n菌菌菌菌体体体体生生生生物物物物合合合合成成成成-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸与与与与HMPHMP、EMPEMP途途途途径径径径直直直直接接接接相相相相关关关关。增增增增加加加加HMPHMP途途途途径径径径，NADPH的的数数量量增增多多，有有利利于于-亚亚麻麻酸酸产量的提高。产量的提高。n n选选选选育育育育异异异异柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶渗渗渗渗漏漏漏漏突突突突变变变变株株株株，也也也也有有有有利利利利于于于于-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸产产产产量的提高。量的提高。量的提高。量的提高。第五十七页，讲稿共七十五页哦6、选育、选育6-脱氢酶活力强的突变株脱氢酶活力强的突变株n n6-6-脱脱氢氢酶酶是是生生物物合合成成-亚亚麻麻酸酸的的关关键键酶酶之之一一，其其活活性性的的高高低低直直接接与与-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸含含含含量量量量的的的的高高高高低低低低密密密密切切切切相相相相关关关关，可可可可采采采采用用用用TTCTTC酶酶酶酶活活活活测测测测定定定定法法法法来来来来反反反反映映映映6-脱脱氢氢酶酶的的活活性性。TTCTTC为为一一种种无无色色的的氧氧化化还还原原剂剂，能能被被6-6-脱脱氢氢酶酶还还原原成成红红色色的的物物质质，红红色色越越深深，表表明明菌菌体体细细胞胞内内的的6-6-脱脱氢氢酶酶活活力力越越强，强，-亚麻酸的积累量也就越多。亚麻酸的积累量也就越多。亚麻酸的积累量也就越多。亚麻酸的积累量也就越多。第五十八页，讲稿共七十五页哦7、选育低温生长突变株、选育低温生长突变株n n细细胞胞膜膜是是重重要要的的微微生生物物细细胞胞表表面面结结构构，由由脂脂质质和和蛋蛋白白质质组组成成。脂脂质质分分子子中中不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的含含量量越越高高，其其在在低低温温下下细细胞胞膜膜的的流流动动性性也也就就越越大大，即即微微生生物物细细胞生长的温度就越低。胞生长的温度就越低。n n据据报报道道，选选育育在在相相对对低低温温（1515）条条条条件件件件下下下下生生生生长长长长良良良良好好好好的的的的突突突突变株，其变株，其变株，其变株，其-亚麻酸的产量提高亚麻酸的产量提高1.41.4倍。倍。第五十九页，讲稿共七十五页哦8、选育耐高糖的突变株、选育耐高糖的突变株n n在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。n n-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸发发发发酵酵酵酵与与与与培培培培养养养养基基基基中中中中糖糖糖糖浓浓浓浓度度度度有有有有密密密密切切切切关关关关系系系系，在在在在一一一一定定定定范范范范围围围围内内内内，-亚亚麻麻酸酸的的产产量量随随糖糖浓浓度度的的增增加加而而增增加加，但但糖浓度过高就会抑制菌体生长，降低产物的积累。糖浓度过高就会抑制菌体生长，降低产物的积累。n n因因因因此此此此，通通通通过过过过选选选选育育育育耐耐耐耐高高高高糖糖糖糖的的的的突突突突变变变变株株株株，可可可可使使使使菌菌菌菌体体体体高高高高效效效效率率率率地地地地利利利利用用用用葡萄糖，从而提高葡萄糖，从而提高葡萄糖，从而提高葡萄糖，从而提高-亚麻酸的产量。亚麻酸的产量。第六十页，讲稿共七十五页哦9、基因工程育种、基因工程育种n n通通过过基基因因工工程程手手段段改改造造-亚亚亚亚麻麻麻麻酸酸酸酸生生生生产产产产菌菌菌菌，能能能能大大大大幅幅幅幅度度度度提提提提高菌种的高菌种的高菌种的高菌种的-亚麻酸合成能力。亚麻酸合成能力。亚麻酸合成能力。亚麻酸合成能力。n nHuangHuangHuangHuang等等从从高高山山被被孢孢霉霉中中克克隆隆得得到到12121212和和和和6666去去去去饱饱饱饱和和和和酶酶酶酶编编编编码码码码基基基基因因因因的的的的cDNAcDNAcDNAcDNA序序序序列列列列，并并并并将将将将它它它它们们们们分分分分别别别别克克克克隆隆隆隆至至至至啤啤啤啤酒酒酒酒酵酵酵酵母母母母中中中中。当当当当表表表表达达达达1212去去去去饱饱饱饱和和和和酶酶酶酶时时时时，以以以以油油油油酸酸酸酸为为为为底底底底物物物物，发发发发酵酵酵酵终终终终点点点点时时时时其其其其亚亚亚亚油油油油酸酸酸酸的的的的含含含含量量量量达达达达到到到到了了了了2525，当当表表达达66去去饱饱和和酶酶时时，以以亚亚麻麻酸酸为为底底物物，其其发发酵酵产产物物GLAGLAGLAGLA含含量量为为1010。当当共共同同表表达达这这两两个个酶酶，在在不不添添加加前前体体脂脂肪肪酸酸的的条条件件下下，GLAGLAGLAGLA的含量也能达到的含量也能达到8 8 8 8。第六十一页，讲稿共七十五页哦二、花生四烯酸发酵的代谢控制育种二、花生四烯酸发酵的代谢控制育种n n花生四烯酸(简称AA)属人体不可缺少的多不饱和脂肪酸，作为合成人体前列腺素、凝血噁烷以及白三烯的前体物质，具有广泛的生物活性，特别对婴幼儿的脑和神经发育有重要影响，对人体心血管系统和免疫系统具有重要的调节作用。n n动物组织中花生四烯酸的质量分数很低，约为0.2%，且来源非常有限；利用微生物发酵法是生产花生四烯酸的新途径。第六十二页，讲稿共七十五页哦n n利用腐霉(Pythium)通过发酵法生产的花生四烯酸(美国Martek生物科学公司)在1995年已获得荷兰健康部法规办公室的安全认可，1996 年获得英国毒理委员会的安全认可，对于食品工业的研究有重要价值，因此从腐霉属及近缘属中寻找有价值的菌株是一个十分有希望的方向。n n目前对腐霉的育种研究较少，花生四烯酸生产菌的诱变育种局限于被孢霉属的少数真菌。第六十三页，讲稿共七十五页哦n n花花生生四四烯烯酸酸又又称称全全顺顺-5,8,11,14-5,8,11,14-二二十十碳碳四四烯烯酸，其分子式为酸，其分子式为C20H32O2C20H32O2，结构式为：，结构式为：第六十四页，讲稿共七十五页哦n n花花生生四四烯烯酸酸的的生生物物合合成成途途径径，即即葡葡萄萄糖糖通通过过脂脂肪肪酸酸的的生生物物合合成成途途径径，先先合合成成硬硬脂脂酸酸，硬硬脂脂酸酸经经脱脱氢氢酶酶作作用用生生成成油油酸酸，油油酸酸进进一一步步脱脱氢氢生生成成亚亚油油酸酸。由由亚亚油油酸酸分分出出2 2个个分分支支，一一方方面面通通过过去去饱饱和和作作用用生生成成-亚亚麻麻酸酸，另另一一方方面面在在6-6-脱脱氢氢酶酶的的作作用用下下生生成成-亚亚麻麻酸酸。-亚亚麻麻酸酸通通过过延延长长碳碳链链生生成成二二高高-亚亚麻麻酸酸，二二高高-亚亚麻麻酸酸再再在在5-5-脱脱饱饱和和酶酶作作用用下下生生成成花花生生四四烯酸。烯酸。第六十五页，讲稿共七十五页哦第六十六页，讲稿共七十五页哦选育花生四烯酸高产菌，可从以下几方面着手。选育花生四烯酸高产菌，可从以下几方面着手。1 1、出发菌株的选择、出发菌株的选择n n花花花花生生生生四四四四烯烯烯烯酸酸酸酸产产产产生生生生菌菌菌菌多多多多采采采采用用用用耳耳耳耳霉霉霉霉属属属属（Conidiobolus）、被被被被孢孢孢孢霉霉霉霉属属属属（MortierellaMortierella）、毛毛霉霉属属（Mucor）和和和和根根根根霉霉霉霉属属属属（Rhizopus）等产油脂较多的真菌作为出发菌株。）等产油脂较多的真菌作为出发菌株。）等产油脂较多的真菌作为出发菌株。）等产油脂较多的真菌作为出发菌株。第六十七页，讲稿共七十五页哦2、切断或减弱支路代谢、切断或减弱支路代谢n n选选育育-亚亚麻麻酸酸缺缺陷陷型型、二二十十碳碳五五烯烯酸酸缺缺陷陷型型、DHA缺缺陷陷型型、前前列列腺腺素素缺缺陷陷突突变变株株，或或者者选选育育DHA渗渗漏漏、-亚亚麻麻酸酸渗渗漏漏及及前前列列腺腺素素渗渗漏漏突突变变株株，均有利于花生四烯酸的大量积累。均有利于花生四烯酸的大量积累。第六十八页，讲稿共七十五页哦3、解除自身的反馈调节、解除自身的反馈调节n n为为了了解解除除菌菌种种自自身身的的反反馈馈调调节节，可可以以通通过过选选育育脂脂肪肪酸酸结构类似物抗性突变株的方法来达到目的。结构类似物抗性突变株的方法来达到目的。n n据据报报道道，选选育育4-氟氟代代亚亚油油酸酸抗抗性性突突变变株株，可可使使被被孢孢霉霉的的花花生生四四烯烯酸酸产产量量提提高高0.65倍倍。另另外外，选选育育而而高高浓浓度度花花生生四四烯烯酸酸的的突突变变株株，也也有有助助于于提提高高花花生生四四烯酸的产量。烯酸的产量。第六十九页，讲稿共七十五页哦4 4、增加前体物的合成、增加前体物的合成n n选选育育脱脱氢氢赖赖氨氨酸酸敏敏感感、萘萘啶啶酮酮酸酸敏敏感感、氟氟乙乙酸酸敏敏感感、狭狭霉霉素素C敏敏感感、德德夸夸菌菌素素敏敏感感突突变变株株，均均有有利利于于加加强强HMP途途径径，从从而而增增加加花花生生四四烯烯酸酸生生物物合合成成的的前前体体物，有助于花生四烯酸的高产。物，有助于花生四烯酸的高产。n n花花生生四四烯烯酸酸的的前前体体物物是是-亚亚麻麻酸酸，凡凡能能提提高高-亚亚麻麻酸酸产量的遗传标记，也有利于花生四烯酸的大量积累。产量的遗传标记，也有利于花生四烯酸的大量积累。第七十页，讲稿共七十五页哦5 5、选育、选育5-5-脱饱和酶活性强的突变株脱饱和酶活性强的突变株n n5-5-脱饱和酶是花生四烯酸生物合成的关键酶之一，脱饱和酶是花生四烯酸生物合成的关键酶之一，其活性高低直接影响了花生四烯酸的产量。其活性高低直接影响了花生四烯酸的产量。第七十一页，讲稿共七十五页哦6 6、选育低温生长突变株、选育低温生长突变株n n花花生生四四烯烯酸酸含含有有4 4个个双双键键，其其相相变变温温度度相相对对很很低低，如如果果其其在在细细胞胞膜膜中中的的含含量量提提高高，那那么么质质膜膜流流动动性性增增加加，在在相相对对低低温温情情况况下下，质质膜膜也也会会具具有有生生物物活活性，细胞继续存活的可能性变大。性，细胞继续存活的可能性变大。n n挑挑选选在在相相对对低低温温条条件件下下生生长长较较好好的的突突变变株株，有有助助于花生四烯酸产量的提高。于花生四烯酸产量的提高。第七十二页，讲稿共七十五页哦7 7、挑选脂肪粒大、密度高的突变株、挑选脂肪粒大、密度高的突变株n n对对菌菌株株镜镜检检，可可观观察察到到菌菌丝丝体体内内存存在在折折光光性性很很强强的的液滴液滴脂肪粒。脂肪粒。n n用用苏苏丹丹IIIIII对对菌菌丝丝体体染染色色，液液滴滴呈呈红红色色；用用苏苏丹丹黑对菌丝体染色，液滴呈深蓝色。黑对菌丝体染色，液滴呈深蓝色。n n挑挑选选脂脂肪肪粒粒大大、密密度度高高的的突突变变株株，有有助助于于花花生生四烯酸产量的提高。四烯酸产量的提高。第七十三页，讲稿共七十五页哦8 8、提高细胞内的能荷水平、提高细胞内的能荷水平n n细细胞胞内内ATPATP水水平平高高时时，在在细细胞胞质质中中合合成成的的