实验五 离子交换柱层析法分离氨基酸精.ppt
实验五离子交换柱层析法分离氨基酸第1页，本讲稿共33页目的要求（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。第2页，本讲稿共33页一、原理一、原理离离子子交交换换层层析析是是用用离离子子交交换换剂剂（具具有有离离子子交交换换性性能能的的物物质质）作作固固定定相相，利利用用它它与与流流动动相相中中的的离离子子能能进进行行可可逆逆的的交交换换性性质质来来分分离离离离子子型化合物的层析方法。型化合物的层析方法。即即溶溶液液中中的的离离子子同同离离子子交交换换剂剂上上功功能能基基团团交换反应交换反应的过程。的过程。第3页，本讲稿共33页第4页，本讲稿共33页第5页，本讲稿共33页 带带电电荷荷量量少少，亲亲和和力力小小的的先先被被洗洗脱脱下下来来，带带电电荷荷量量多多，亲亲和和力力大大的的后后被被洗脱洗脱下来。下来。第6页，本讲稿共33页离子交换过程示意：离子交换过程示意：起始起始 吸附吸附 解吸解吸 完成完成 x+:起始缓冲离子起始缓冲离子 y+：待分离离子：待分离离子 z+：待分离离子：待分离离子第7页，本讲稿共33页二、离子交换剂的种类二、离子交换剂的种类v 在在惰惰性性载载体体上上引引入入带带有有电电荷荷的的活活性性基基团团即即离离子交换剂。子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换第8页，本讲稿共33页（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同1.离子交换树脂离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯苯乙乙烯烯+二二乙乙烯烯苯苯 聚聚苯苯乙乙烯烯 （单体）（交联剂）（单体）（交联剂）二乙烯苯二乙烯苯交联度交联度=100%苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯第9页，本讲稿共33页v交交联联度度大大，网网孔孔变变小小，大大分分子子量量的的离离子子不不能能进入树脂颗粒内发生离子交换。进入树脂颗粒内发生离子交换。v在不影响分离的情况下，以采用在不影响分离的情况下，以采用交联度较高交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性择性。第10页，本讲稿共33页目数目数：离子交换树脂的颗粒直径大小：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为为20-50目目Dowex 20 840 m 50 297 m 100 149 m（代表二乙烯苯的百分含量）（代表二乙烯苯的百分含量）第11页，本讲稿共33页树脂树脂resin（据所含交换基团的性质分）（据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂阳离子交换树脂 强酸型强酸型 含磺酸基团含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型中等酸型 含磷酸基团含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型弱酸型 含酚基、羧基含酚基、羧基阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱强碱 含季胺基团含季胺基团-N+(CH3)3 弱碱弱碱 含叔胺、伯胺基团含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离离子交换树脂稳定。子交换树脂稳定。第12页，本讲稿共33页2.离子交换离子交换纤维素纤维素v阴阴离离子子交交换换纤纤维维素素 如如:DEAE-纤纤维维素素 pH8.6以以下下分分离离中中性性或或酸酸性性物物质质,具具二二乙乙胺乙基胺乙基v阳离子交换纤维素阳离子交换纤维素如如:CM-纤维素纤维素 一般一般pH4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 第13页，本讲稿共33页3.离子交换凝胶离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质如如：葡葡聚聚糖糖（Sephadex）、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（PAG）、琼脂糖（）、琼脂糖（Sepharose）第14页，本讲稿共33页三、操作注意点三、操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择原原则则：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之之间间结结合合力力差差异异大大的的型型号号交交换换剂剂，以以保保证证通通过过离离子交换层析后能得到比较满意的结果。子交换层析后能得到比较满意的结果。第15页，本讲稿共33页考虑因素：考虑因素：1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量第16页，本讲稿共33页根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件 强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛 弱酸型弱酸型只能在碱性只能在碱性pH范围内使用范围内使用 弱碱型弱碱型只能在酸性只能在酸性pH范围内使用范围内使用第17页，本讲稿共33页（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择原原则则：不不能能发发生生化化学学反反应应，所所带带电电荷荷应应与与样样品品一致。避免使样品变性一致。避免使样品变性第18页，本讲稿共33页(三三)洗脱剂洗脱剂 原原则则：所所用用洗洗脱脱液液比比吸吸着着物物质质具具有有更更活活泼泼的离子或基团的离子或基团改变改变pH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱第19页，本讲稿共33页四、应用四、应用分分离离多多肽肽蛋蛋白白、氨氨基基酸酸、核核酸酸及及其其他他带电的生物分子带电的生物分子第20页，本讲稿共33页离子交换层析法分离氨基酸及测定离子交换层析法分离氨基酸及测定第21页，本讲稿共33页原理原理 所所用用样样品品为为天天冬冬氨氨酸酸和和赖赖氨氨酸酸的的混混合合液液，分分别别属属酸酸性性氨氨基基酸酸(pI2.77)(pI2.77)、碱碱性性氨氨基基酸酸(pI9.74)(pI9.74)，在在缓缓冲冲溶溶液液中中分分别别带带正正电电荷荷和和负负电电荷荷，与与强强酸酸型型阳阳离离子子交交换换树树脂脂Dowex50亲亲和和力力有有很很大大不不同同，在在一一定定的的洗洗脱脱条条件件下下洗洗脱脱，将将它它们们分分离离。利利用用氨氨基基酸酸可可与与茚茚三三酮酮反反应应生生成有色化合物进行氨基酸鉴定。成有色化合物进行氨基酸鉴定。第22页，本讲稿共33页紫色物质，用于紫色物质，用于氨基酸的比色测定和纸层析显色氨基酸的比色测定和纸层析显色与水含茚三酮的反应：与水含茚三酮的反应：第23页，本讲稿共33页vAsp LysvpH4.2vpH 10第24页，本讲稿共33页器材器材1.层析柱等层析柱等2.2.沸水浴沸水浴第25页，本讲稿共33页试剂试剂vDowex50 v2mol/L NaOHvpH5.3柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液v样品液：氨基酸混合液样品液：氨基酸混合液v茚三酮混合液茚三酮混合液第26页，本讲稿共33页实验步骤1树脂的处理树脂的处理将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2装柱装柱 取直径1cm,长度1012cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至810cm的高度即可。v装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。第27页，本讲稿共33页3平衡平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留34cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。4.加样加样揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面12mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高34cm左右，接恒流泵。5.洗脱洗脱以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集6080管。第28页，本讲稿共33页6洗脱及氨基酸的鉴定洗脱及氨基酸的鉴定向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。第29页，本讲稿共33页实验结果根据氨基酸的解离性质，分析该实验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来的顺序。第30页，本讲稿共33页Separationofaminoacidsonacationexchangecolumn第31页，本讲稿共33页注意事项在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。第32页，本讲稿共33页第33页，本讲稿共33页
